抗生素效價測定儀校準(zhǔn)用光譜中性濾光片的研制＊

丁峰元，雷軍鋒，楊占旗，班繼民

(河南省計量科學(xué)研究院，鄭州 450008)

抗生素效價測定儀校準(zhǔn)用光譜中性濾光片的研制＊

丁峰元，雷軍鋒，楊占旗，班繼民

(河南省計量科學(xué)研究院，鄭州 450008)

根據(jù)濁度法抗生素效價測定儀吸光度的有效測量范圍和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中吸光度逐漸降低的特點，選用中性灰色玻璃研制了吸光度標(biāo)稱值分別為0.3，0.5，0.7，1.0的光譜中性濾光片組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。用紫外可見近紅外分光光度計對研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、正反面和穩(wěn)定性進(jìn)行測試，吸光度均勻性最大值為0.002 0，吸光度正反面最大差值為0.000 4，吸光度穩(wěn)定性最大值為0.002 5，符合二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求，經(jīng)評定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)吸光度的相對擴展不確定度為1%(k=2)。將該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果與上一級計量標(biāo)準(zhǔn)中國計量科學(xué)研究院的校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行比對驗證，結(jié)果表明研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值準(zhǔn)確，可用于抗生素效價測定儀吸光度準(zhǔn)確性和溯源性校準(zhǔn)。

光譜中性濾光片；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；吸光度；抗生素效價測定儀

濁度法抗生素效價測定法自2005年在中國藥典采用［1］，相關(guān)企業(yè)研制了濁度法抗生素效價測定儀。濁度法抗生素效價測定儀利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后液體培養(yǎng)基吸光度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對試驗菌生長抑制程度，以測定供試品效價［2–3］，儀器的直接測量數(shù)據(jù)為吸光度。目前吸光度準(zhǔn)確性和和溯源性一般采用光譜中性濾光片［4］，鑒于儀器比色皿的光程為20 mm，傳統(tǒng)的光譜中性濾光片不適用于該儀器的校準(zhǔn)［5］。筆者研制的光譜中性濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于校準(zhǔn)抗生素效價測定儀，保證儀器吸光度量值準(zhǔn)確可靠，填補了我國抗生素效價測定儀校準(zhǔn)的空白。該濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由可見光區(qū)吸光度標(biāo)稱值分別為0.3，0.5，0.7，1.0的光譜中性濾光片組合而成，可對抗生素效價測定儀進(jìn)行校準(zhǔn)，使抗生素效價測定儀的校準(zhǔn)工作規(guī)范化、實用化和可溯源性。

1 設(shè)計原理

根據(jù)《中華人民共和國藥典(2015版)》的規(guī)定，濁度法抗生素測定需要的培養(yǎng)液體積為10 mL［2–3］，對應(yīng)的濁度法抗生素測定儀的比色皿為長方體。比色皿外部長、寬均為22 mm，高為96 mm，內(nèi)部長、寬均為20 mm，高為95 mm，即光程為20 mm。隨著培養(yǎng)時間的變化，濁度法抗生素測定儀測定培養(yǎng)液的吸光度由高到低的變化，并將吸光度范圍在0.3～0.7之間的測量數(shù)據(jù)作為抗生素效價計算的有效數(shù)據(jù)，其中吸光度測量波長點為單波長，選用波長為530 nm或580 nm［2–3］。針對以上特點，筆者研制了吸光度為0.3(用于校準(zhǔn)有效測量數(shù)據(jù)低值準(zhǔn)確性)、0.5(用于校準(zhǔn)有效測量數(shù)據(jù)中值準(zhǔn)確性)、0.7(用于校準(zhǔn)有效測量數(shù)據(jù)高值準(zhǔn)確性)、1.0(用于校準(zhǔn)未加抗生素的對照樣品吸光度準(zhǔn)確性)的濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本項目選擇經(jīng)有效溯源的紫外可見近紅外分光光度計(Cary 5000型，美國安捷倫公司)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測量［6］，該儀器符合JJG 178–2007 的I級要求［7］，且技術(shù)指標(biāo)也符合JJG 1034–2008對分光光度計的要求［8］。

2 制備工藝

2.1 原材料及加工工藝

光譜中性濾光片的原材料為中性灰色玻璃，該類玻璃以硼硅酸鹽玻璃為基礎(chǔ)玻璃，以鐵、鈷和鎳等氧化物為著色劑，熔制成具有不同顏色深度的灰色玻璃，對整個可見光波段均勻吸收，可作為濾光片用于定量調(diào)節(jié)光的透過率［9］。分別選用牌號為ZAB50，ZAB30，ZAB20，ZAB10，對應(yīng)的吸光度標(biāo)稱值分別為0.3，0.5，0.7，1.0，厚度2 mm的中性灰色玻璃，該玻璃在500～600 nm范圍內(nèi)吸光度光譜為平滑曲線(見圖1)。每片濾光片切割成長58 mm，寬18 mm，并分別置于架體長22 mm，寬22 mm，高96 mm的濾光片支架上。共研制6套濾光片，編號分別為101～106，每套包含吸光度標(biāo)稱值為0.3，0.5，0.7，1.0的濾光片各1片，如101套內(nèi)編號為101–0.3，101–0.5，101–0.7，101–1.0［10–11］。

圖1 中性灰色玻璃吸光度譜圖

2.2 濾光片均勻性測量

將濾光片垂直放置于光路上，光路經(jīng)過濾光片正面中心點位置，以空氣作參比，分別測定530 nm 和580 nm的吸光度，重復(fù)3次，取平均值。再將濾光片垂直放置于光路上，光路經(jīng)過濾光片反面中心點位置，以空氣作參比，分別測定530 nm和580 nm的吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。另外在濾光片中心點位置的上、下各2 cm處，分別按照以上步驟進(jìn)行測量。根據(jù)JJG 1034–2008規(guī)定，將濾光片上、中、下位置吸光度差值最大絕對值作為濾光片的均勻性測定結(jié)果［8］。

依據(jù)JJG 1034–2008對可見光區(qū)透射比標(biāo)準(zhǔn)濾光片計量性能的要求，一級濾光片的透射比均勻性＜0.1%。6套濾光片中各標(biāo)稱點吸光度均勻性最大值及其對應(yīng)的透射比均勻性最大值見表1，均符合一級濾光片的要求［8］。

表1 6套濾光片各吸光度標(biāo)稱點均勻性最大值

2.3 濾光片正反面測量

將濾光片垂直放置于光路上，光路經(jīng)過濾光片正面中心點位置，以空氣作參比，分別測定530 nm 和580 nm的吸光度，重復(fù)3次，取平均值。再將濾光片垂直放置于光路上，光路經(jīng)過濾光片反面中心點位置，以空氣作參比，分別讀取530 nm和580 nm的吸光度，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)JJG 1034–2008規(guī)定，正面吸光度平均值與反面吸光度平均值之差的絕對值為正反面吸光度差值［8］。

依據(jù)JJG 1034–2008對可見光區(qū)透射比標(biāo)準(zhǔn)濾光片計量性能的要求，一級濾光片的正反面透射比＜0.1%。6套濾光片中各標(biāo)稱點吸光度正反面差值最大值及其對應(yīng)的透射比正反面最大值見表2，均符合一級濾光片的要求［8］。

2.4 濾光片穩(wěn)定性測量

將均勻性、正反面差異性符合一級濾光片要求的濾光片依照J(rèn)JG 1034–2008的測量方法，將每片濾光片在分光光度計上連續(xù)測量6次，取平均值作為該濾光片吸光度測量值，共監(jiān)測12個月的濾光片吸光度穩(wěn)定性。

表2 6套濾光片各吸光度標(biāo)稱點透射比正反面最大差值

依據(jù)JJG 1034–2008對可見光區(qū)透射比標(biāo)準(zhǔn)濾光片計量性能的要求，一級濾光片的年穩(wěn)定性透射比＜0.1%，二級濾光片的年穩(wěn)定性透射比＜0.3%。6套濾光片中各標(biāo)稱點吸光度年變化量最大值及其對應(yīng)的透射比年變化量最大值見表3，均優(yōu)于二級濾光片的要求［8］。

表3 6套濾光片各吸光度標(biāo)稱點透射比年穩(wěn)定性最大值

3 定值結(jié)果的不確定度評定

對于光譜中性濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其定值結(jié)果的不確定度主要由4部分組成：吸光度測量重復(fù)性引入的不確定度u1；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度u2；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度u3；定值儀器引入的不確定度u4［10–11］。

3.1 吸光度測量重復(fù)性引入的不確定度分量

用分光光度計連續(xù)測量6次濾光片的吸光度值，計算6次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s，6次連續(xù)測量的平均值引入的不確定度相對不確定度u1r＝u1／A，結(jié)果見表4［6，12–13］。

表4 吸光度重復(fù)性測量結(jié)果及不確定度分量

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度分量

對均勻性最大的濾光片進(jìn)行不確定度評定，以101–0.3濾光片為例，其測量數(shù)據(jù)及不確定度評定見表5［6，12–13］。

表5 濾光片均勻性測量結(jié)果及不確定度分量

6套濾光片中各吸光度標(biāo)稱點最大均勻性引入的不確定度分量見表6。

表6 各吸光度標(biāo)稱點均勻性引入的不確定度分量

3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度

對穩(wěn)定性變化最大的濾光片進(jìn)行不確定度評定，測量數(shù)據(jù)及相對不確定度u3r結(jié)果見表7［6，12–13］。

表7 穩(wěn)定性引入的不確定度分量評定結(jié)果

3.4 定值儀器引入的不確定度分量

JJG 1034–2008對濾光片定值所用分光光度計的特征波長點透射比最大示值誤差要求為±0.1%，以均勻分布考慮，取則定值儀器透射比引入的不確定度分量見表8［6，12–13］。

表8 定值儀器引入的不確定度分量計算

3.5 合成不確定度

表9 不確定度分量及合成不確定度

3.6 擴展不確定度

取擴展因子為k=2，擴展不確定度Ur=kucr，結(jié)果見表10。將數(shù)據(jù)修約，取整數(shù)為1%，則光譜中性濾光片吸光度值的相對擴展不確定度為Ur=1%，k=2［6］。

表10 相對擴展不確定度

4 比對和驗證

為了驗證測量結(jié)果的準(zhǔn)確程度，將編號為101的濾光片組進(jìn)行測量后立即送至上一級計量標(biāo)準(zhǔn)單位(中國計量科學(xué)研究院)進(jìn)行校準(zhǔn)，將二者測量結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果見表11。由表11可知，吸光度差值均為0.000。經(jīng)比對驗證，濾光片定值結(jié)果與中國計量院的測量值一致，表明可以將定值結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)值［14–15］。

表11 河南省計量院(HNIM)與中國計量院(NIM)測量值比對結(jié)果

5 結(jié)語

濾光片經(jīng)正反面檢測、均勻性檢測、穩(wěn)定性檢測后，符合JJG 1034–2008 《光譜光度計標(biāo)準(zhǔn)濾光器》二級要求。將濾光片用經(jīng)有效溯源且符合JJG 178–2007 《紫外、可見、近紅外分光光度計》I級要求的Cary 5000型紫外可見近紅外分光光度計進(jìn)行定值，定值結(jié)果經(jīng)比對驗證后表明其定值結(jié)果準(zhǔn)確可靠，符合二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求。研制的光譜中性濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于抗生素效價測定儀的校準(zhǔn)和溯源。

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［15］GB／T 27043–2012 合格評定 能力驗證的通用要求［S］.

Preparation of Reference Material for Spectral Neutral Filters to Calibrate Antibiotics Potency Analyzer

Ding Fengyuan, Lei Junfeng, Yang Zhanqi, Ban Jimin
(Henan Institute of Metrology， Zhengzhou 450008， China)

According to the characteristics with the absorbance measuring range and the absorbance decreasing in the cultivation process of the antibiotics potency analyzer，the reference materials of spectral neutral filters with absorbance nominal values of 0.3，0.5，0.7 and 1.0 were prepared by using neutral grey glasses. The absorbance homogeneity，directivity and stability of the reference materials were tested by using an ultraviolet visible near infrared spectrophotometer. The maximum absorbance homogeneity was 0.002 0，the maximum absorbance directivity was 0.000 4，and the maximum absorbance stability was 0.002 5，meeting the reference material 2nd level requirement. By evaluation，the relative expanded uncertainty of the reference material absorbance was 1%(k=2). The determination results of this reference material were compared with the calibration results of the previous level measurement standard (National Institute of Metrology , China)，the results validated that the absorbance of the reference material was accurate. The reference material can be used to calibrate the absorbance accuracy and traceability of antibiotics potency analyzer.

spectral neutral filter; reference material; absorbance; antibiotics potency analyzer

O657.3

A

1008–6145(2017)03–0010–04

*國家質(zhì)檢總局項目[(2014)79]；河南省重點科技攻關(guān)項目(122109000002)

聯(lián)系人：丁峰元；E-mail: fengyuanding@163.com

2017–03–06

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.002