松弛素在大鼠放射性肺損傷中的表達(dá)及作用①

王曉茜，鮑文華，鐘 銓?zhuān)R雪梅，文 銳，孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003)

松弛素在大鼠放射性肺損傷中的表達(dá)及作用①

王曉茜，鮑文華，鐘 銓?zhuān)R雪梅，文 銳，孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討松弛素在不同劑量大鼠放射性肺損傷模型中的表達(dá)和作用。方法：分別建立高、中、低三個(gè)劑量的放射性肺損傷動(dòng)物模型，運(yùn)用熒光定量-PCR法測(cè)定照射后1天、7、天、14天、28天肺組織中松弛素mRNA的表達(dá)量，行H-E染色后觀察鏡下肺組織病理改變。結(jié)果：高劑量組肺組織松弛素mRNA表達(dá)量最多，中劑量組其次，小劑量組最少，三組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，第14天達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：松弛素對(duì)放射性肺損傷的形成過(guò)程中有重要的調(diào)控作用，且肺損傷程度越重，其作用越強(qiáng)。

松弛素；放射性肺損傷；肺纖維化

放射性治療已經(jīng)成為肺癌、乳腺癌、食道癌等胸部腫瘤患者的主要治療手段，但在進(jìn)行治療的同時(shí)，由于肺組織對(duì)放射線(xiàn)中度敏感，腫瘤附近的肺組織可能出現(xiàn)不同程度的損傷，我們稱(chēng)之為放射性肺損傷。放射性肺損傷其實(shí)質(zhì)為無(wú)菌性的炎癥，其發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)，包括早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纖維化，早期有干咳、少痰、發(fā)熱、氣短和胸部不適，以后可出現(xiàn)逐漸加重的干咳和呼吸困難[1]，以上癥狀往往嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。肺纖維化從起始到病情惡化,進(jìn)而導(dǎo)致呼吸功能不全，最后導(dǎo)致而死亡一般在5年左右，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療較困難[2]。松弛素是體內(nèi)存在的一種天然的抗纖維化物質(zhì)，它不僅能抑制膠原合成、沉積，成纖維細(xì)胞活化、增殖、分化以及上皮或內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還可以增強(qiáng)膠原纖維降解。松弛素在心臟、腎臟中的作用已較明確，研究發(fā)現(xiàn)，松弛素基因剔除的雄性小鼠可以出現(xiàn)與年齡相關(guān)的，以心臟、腎臟為主的全身多器官纖維化[3]。有最新研究表明，對(duì)心臟、腎臟纖維化的松弛素基因敲除小鼠給予重組二型人類(lèi)松弛素治療兩周后，肺內(nèi)膠原的沉積明顯減少。另外，在自發(fā)性高血壓大鼠模型中，松弛素可顯著降低左心室和腎臟的膠原蛋白含量，說(shuō)明松弛素可同時(shí)改善心臟和腎臟的纖維化[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立放射性肺損傷的動(dòng)物模型，觀察松弛素在各組的表達(dá)情況及差異，推測(cè)松弛素在放射性肺損傷的形成過(guò)程中起著非常重要的調(diào)控作用，并且其含量的高低可能成為預(yù)測(cè)肺損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

X線(xiàn)定位機(jī)、直線(xiàn)加速器，德國(guó)西門(mén)子公司。

健康清潔級(jí)Wistar大鼠70只，雌雄各半，6～8周齡，體重(220±20)g，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 隨機(jī)將70只大鼠分為對(duì)照組(10只)，高劑量組(20只)，中劑量組(20只)，低劑量組(20只)，常規(guī)飼養(yǎng)1周無(wú)異后納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物的固定和照射：全部大鼠以10%水合氯醛3.5mL/kg腹腔注射麻醉。將大鼠保持仰臥位，四肢固定于老鼠板上，頭部和胸部以下部位分別使用5cm厚的鉛磚遮擋，露出胸部為照射區(qū)域， 常規(guī)X線(xiàn)模擬機(jī)定位，以腋窩頂部為上界，劍突下緣為下界，，腋窩外側(cè)緣為外側(cè)，射野面積4.0cm×5.0cm，界源皮距110cm。照射劑量分別為高劑量組：25Gy，中劑量組：20Gy，低劑量組：12Gy。對(duì)照組麻醉后佯裝照射。

1.2.3 大鼠一般狀態(tài)觀察：精神狀況，進(jìn)食、飲水情況，體重變化，是否出現(xiàn)脫毛、皮膚潰瘍等。

1.2.4 鼠肺大體標(biāo)本觀察及病理學(xué)觀察：于照射后1、7、14、28d4個(gè)時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠，固定大鼠后，結(jié)扎氣管后剖開(kāi)胸腔分離主氣管，并快速將氣管及雙肺剝離出胸腔，觀察肺的大體結(jié)構(gòu)改變。取右肺中葉于10%甲醛溶液中固定24h后，常規(guī)行石蠟包埋、切片、染色，光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 鼠肺松弛素mRNA含量測(cè)定：使用組織RNA快速提取試劑盒提取，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，所有器具使用前采用0.1%DEPC水浸泡過(guò)夜，高溫高壓蒸汽滅菌，以去除RNA酶的污染，操作過(guò)程中會(huì)接觸各種有毒物質(zhì)，需謹(jǐn)慎小心，提取成功后測(cè)定RNA的純度和濃度。應(yīng)用cDNA合成試劑盒及熒光染料RT-PCR試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列如下：relaxin：上游CCACTGCAGAAGTTGTGCCATC，下游ACAACGGAATCGCTCAACGC，β-action：上游CCCATCTATGAGGGTTACGC,下游TTTAATGTCACGCACGATTTC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

釆用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用單向方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡。對(duì)照組大鼠精神及飲食、活動(dòng)正常，皮毛有光澤；低劑量一般情況尚可，飲食及體重變化不明顯；中劑量組、高劑量組照射后均出現(xiàn)精神不振，活躍程度較對(duì)照組明顯減弱，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍，皮毛無(wú)光澤，進(jìn)食及飲水減少，體重明顯減輕，體重變化于第一周時(shí)較明顯，以后逐漸恢復(fù)，以上表現(xiàn)高劑量組更明顯。部分出現(xiàn)背部皮毛脫落、皮膚糜爛及淺潰瘍，病變持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，個(gè)別大鼠出現(xiàn)呼吸困難，呼吸頻率加快，胸廓膨隆。

2.2 鼠肺大體觀察

對(duì)照組肺組織呈粉紅色，彈性良好，無(wú)充血水腫等表現(xiàn)；低劑量組肺組織彈性良好，表面光滑，肉眼觀察改變不明顯；中劑量組及高劑量組第7、14天可見(jiàn)肺組織輕度腫脹，彈性較好，表面及切面可見(jiàn)散在的點(diǎn)狀出血，28d左右可見(jiàn)肺組織中度腫脹，彈性一般，為斑片狀或片狀出血點(diǎn)，肺葉顏色明顯加深，呈暗紅色，高劑量組較中劑量組明顯。

2.3 鼠肺組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組大鼠肺組織光鏡下結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整、薄而光滑，血管正常，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)明顯滲出；照射組第1、7、14天可見(jiàn)肺泡壁毛細(xì)血管輕度充血水腫，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)淡紅色水腫液，肺泡腔及肺泡間隔內(nèi)有較多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，高劑量組表現(xiàn)最為顯著；中劑量組及高劑量組第28天可見(jiàn)肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)及肺泡間隔可見(jiàn)纖維素樣滲出物及大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1、圖2)，后者較明顯。

圖1 高倍鏡下(×400)可見(jiàn)大量慢性炎癥細(xì)胞

圖2 高倍鏡下(×200)可見(jiàn)肺泡間隔增寬，纖維蛋白沉積

2.4 肺組織松弛素mRNA表達(dá)

松弛素在對(duì)照組肺組織中為弱表達(dá)，在照射組中，照射后隨照射組時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增多，第14天達(dá)到高峰，后緩慢下降，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，明顯高于對(duì)照組，其中高劑量組較中、低劑量組其升高的趨勢(shì)更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 四組大鼠肺組織中松弛素mRNA的相對(duì)含量

3 討論

松弛素是1926年Hisaw等人在豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種具有松弛恥骨韌帶作用的多肽類(lèi)激素，其結(jié)構(gòu)與胰島素類(lèi)似，主要來(lái)源為妊娠黃體，近些年動(dòng)物模型證實(shí)，松弛素可能來(lái)源于腎臟、心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃、十二指腸等全身多個(gè)器官[5]。它可以作為一種全身性的激素進(jìn)入血液循環(huán)，也可以只起局部激素的作用。最初，松弛素被認(rèn)為是一種與生殖相關(guān)的激素，在妊娠期它可以起著松弛結(jié)締、肌肉組織和抑制子宮肌收縮、軟化宮頸的作用，但隨著對(duì)其結(jié)構(gòu)和機(jī)制的更進(jìn)一步探索，發(fā)現(xiàn)它不僅在生殖系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用，對(duì)心血管系統(tǒng)也起著保護(hù)作用，還具有抗炎、促進(jìn)傷口愈合、加速前列腺癌等腫瘤的進(jìn)展、抗纖維化的作用。

松弛素抗纖維化的作用主要體現(xiàn)在：①抑制前纖維化因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1[6](TGFβ1)、血管緊張肽Ⅱ等；②抑制纖維母細(xì)胞增殖和分化，減少成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白；③刺激金屬蛋白酶(MMP)，誘導(dǎo)基質(zhì)降解。另外對(duì)于已經(jīng)形成瘢痕(纖維化) ，松弛素能明顯減輕其嚴(yán)重程度。在心臟和腎臟纖維化的研究中，松弛素的作用已經(jīng)得到了充分的證明[7]，它可以作為一種內(nèi)源性的保護(hù)因子減緩心臟、腎臟纖維化的進(jìn)展。

MOOKERJEE等人[8]，通過(guò)對(duì)松弛素基因敲除小鼠和野生型小鼠腹腔注射卵清蛋白致敏后，結(jié)果顯示松弛素基因敲除小鼠較野生型小鼠和的肺膠原沉積量顯著增多(P<0.05)，并且進(jìn)一步提示金屬蛋白酶-9的減少與膠原含量增多有關(guān)，這項(xiàng)研究提示，在過(guò)敏性炎癥過(guò)程中，松弛素可以起著抑制肺膠原沉積的作用。還有國(guó)外研究表明，松弛素缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)與衰老相關(guān)的肺纖維化、肺組織質(zhì)量增加、膠原含量增加、肺泡充血和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞肥厚、肺泡結(jié)構(gòu)變形、最大呼氣流量升高、吸氣末停頓縮短，而通過(guò)松弛素的治療可以使過(guò)多的膠原沉積得到逆轉(zhuǎn)。以上研究均表明，松弛素在肺組織纖維化形成過(guò)程中起著一定的抑制作用。而關(guān)于松弛素對(duì)放射性肺損傷引起的放射性肺炎及放射性肺纖維作用，國(guó)內(nèi)尚未得到充分研究和證明。本研究提示，松弛素在放射性肺損傷形成肺纖維化的過(guò)程中起著非常重要的調(diào)控作用，同時(shí)它與放射性肺損傷的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，可以成為將來(lái)臨床上預(yù)測(cè)放射性肺損傷程度的重要因子，同時(shí)可以為放射性肺損傷的防治提供新的思路。

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The expressions and roles of relaxin on the radioactive lung injury of rats

WANGXiao-xi,BAOWen-hua,ZHONGQuan,MAXue-mei,WENRui,SUNYun-hui

(The Department of Respiration, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To investigate the expression and function of relaxin in radioactive lung injury model in rats in different doses. Methods: High, medium and low doses of radioactive lung injury animal models were established. Fluorescent quantitative PCR method was used to measure relaxin mRNA expression in the lung tissue after 1 day, 7 days, 14 days, 28 days. after HE was stained, the lung tissue pathological changes were observed.Results: the highest relaxin mRNA expression quantity was in high dose group, the second in medium dose group, and the least in low dose group. Three groups tended to reduce after the first rise. On the 14th day, the expression reached its peak, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: In the process of the formation of radioactive lung injury, relaxin plays an important role in regulating, and the degree of lung injury is heavier, the role of it is stronger.

relaxin; radioactive lung injury;pulmonary fibrosis

王曉茜(1990～)女，湖北荊門(mén)人，在讀碩士研究生。

孫云暉(1970～)女，黑龍江虎林人，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：394849603@qq.com。

R

B

1008-0104(2017)02-0082-03

2015-12-11)