金雙歧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響①

曲博新，顏 玉，張瑞洲，張芮瑞，薛 琳，孫培茹

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

金雙歧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響①

曲博新1，顏 玉1，張瑞洲1，張芮瑞1，薛 琳2，孫培茹2

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察金雙歧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)情況。方法：將雄性Wistar大鼠30只隨機(jī)分為5組：①對(duì)照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組，每組6只。①對(duì)照組和②模型組：均灌腸生理鹽水1mL·kg-1，③惠迪組：惠迪溶液2mL0.5g/kg·d灌胃1次。④金雙歧組，金雙歧溶液2mL7.5g/kg/d灌胃1次。⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組：用莎爾福溶液2mL5g/kg·d和金雙歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1 次。給藥第14天大鼠處死，剪下病變最明顯結(jié)腸組織，吸干血跡稱取15g加0.9%氯化鈉研磨制漿，全自動(dòng)脫帽離心機(jī)DD4-T3000r·min-1離心15min，取上清液-20℃保藏，IL-4，TNF-α運(yùn)用RIA法測定。結(jié)果：惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯(lián)合用藥3個(gè)治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TNF-α含量顯著降低，而IL-4含量顯著升高。結(jié)論：惠迪、金雙歧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療均有效，聯(lián)合用藥效果更佳。

金雙歧；潰瘍性結(jié)腸炎大鼠；結(jié)腸組織；細(xì)胞因子；表達(dá)

1875年首先由Moxon和Willks描述潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)，1903年Boas和Willks將其命名為潰瘍性結(jié)腸炎，1973年世界衛(wèi)生組織(WHO)醫(yī)學(xué)科學(xué)國際組織委員會(huì)正式命名為慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎又稱潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)。潰瘍性結(jié)腸炎病因目前尚未完全闡明，潰瘍性結(jié)腸炎主要侵潤結(jié)腸黏膜慢性非特異性炎性疾病，大多是開始于左半邊結(jié)腸，然后向結(jié)腸近端乃至于全結(jié)腸連續(xù)不斷逐漸進(jìn)展[1]。潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸上皮產(chǎn)生抗原激活免疫淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)，促進(jìn)并加重結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)，潰瘍性結(jié)腸炎檢測相關(guān)細(xì)胞因子水平和變化可作潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生程度指標(biāo)。本研究通過金雙歧治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型檢測結(jié)腸病理組織學(xué)及細(xì)胞因子變化，探索金雙歧治療潰瘍性結(jié)腸炎依據(jù)，為臨床探索輔助方法治療潰瘍性結(jié)腸炎。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥物

雄性Wistar大鼠30只，體重(100±20)g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。金雙歧(雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片)(內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司)；惠迪(美沙拉秦腸溶片)(佳木斯鹿靈制藥有限責(zé)任公司)。

1.2 主要試劑和儀器

2，4-二硝基氯苯(DNCB)(上海安諾芳胺化學(xué)品有限公司)，分析純丙酮(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)，無水乙醇(濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司)，36%醋酸(南京化學(xué)試劑股份有限公司)，0.9%氯化鈉注射液(沈陽恒之盛商貿(mào)有限公司)，硫化鈉(南陽同泰化工有限公司)。

免疫組化試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)，Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)，全自動(dòng)脫帽離心機(jī)DD4-T(長沙湘銳離心機(jī)有限公司)，BXP-124高檔研究型雙目生物顯微鏡(上海荼明光學(xué)儀器有限公司)。

1.3 2，4 二硝基氯苯(DNCB)+醋酸聯(lián)合建潰瘍性結(jié)腸炎大鼠造模及鑒定方法

1.3.1 造模方法。首先用100g/L硫化鈉將雄性Wistar大鼠頸部背面毛脫去，去毛后頸部背面連續(xù)14d滴1次/d5滴(0.25mL)20g/L2，4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮液，第15天用3mm直徑導(dǎo)尿管經(jīng)過肛門插入結(jié)腸8cm處，注入0.25mL0.1%DNCB乙醇溶液，第15天同部位注入2mL8%醋酸溶液，10s后用5mL0.9%氯化鈉溶液沖洗。飼養(yǎng)14d每天連續(xù)觀察大鼠大便性狀、飲食、毛發(fā)和活動(dòng)狀態(tài)等[3]。

1.3.2 模型鑒定。潰瘍性結(jié)腸炎大鼠造模30d后，采用病理學(xué)病理學(xué)檢查可觀察到結(jié)腸出現(xiàn)水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤、隱窩膿腫、杯狀細(xì)胞減少、腺體破壞及小潰瘍形成等一系列變化，可以確認(rèn)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠造模成功[4]。

1.4 大鼠分組、給藥及取材

將雄性Wistar大鼠30只隨機(jī)分為5組：①對(duì)照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組，每組6只。①對(duì)照組和②模型組：均灌腸生理鹽水1mL·kg-1，③惠迪組：惠迪溶液2mL0.5g/kg·d灌胃1次。④金雙歧組，金雙歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1次。⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組：用莎爾福溶液2mL5g/kg·d和金雙歧溶液2mL7.5g/kg·d灌胃1 次。給藥第14天大鼠處死，剪下病變最明顯結(jié)腸組織，吸干血跡稱取15g加0.9%氯化鈉研磨制漿，全自動(dòng)脫帽離心機(jī)DD4-T3000r·min-1離心15min，取上清液-20℃保藏，IL-4，TNF-α運(yùn)用RIA法測定[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 金雙歧等五處理大鼠一般狀況表現(xiàn)

①對(duì)照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組處理大鼠狀況表現(xiàn)見表1。

表1 金雙歧等五處理大鼠一般狀況表現(xiàn)

2.2 金雙歧等五處理大鼠結(jié)腸黏膜病理學(xué)檢查2.2.1 結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

2.2．2 結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤深度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤深度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表2 結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤深度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.3 金雙歧等五處理對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜損傷的影響

①對(duì)照組、②模型組、③惠迪組、④金雙歧組、⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組五處理對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜損傷表現(xiàn)情況：①對(duì)照組大鼠在活動(dòng)能力、飲食量、體重、排便均正常；②模型組大鼠精神萎靡、飲食量減少、體重下降，出現(xiàn)溏、血便，結(jié)腸組織出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤深至全層，潰瘍面比較大，深度達(dá)黏膜肌層；③惠迪組大鼠活動(dòng)能力逐漸好轉(zhuǎn)、飲食量漸增、體重稍有恢復(fù)、溏、血便稍有緩解，結(jié)腸組織炎細(xì)胞浸潤緩解，潰瘍稍小，深度沒有達(dá)黏膜肌層；④金雙歧組大鼠活動(dòng)狀況好轉(zhuǎn)、飲食量增加、體重恢復(fù)、溏、血便改善，結(jié)腸組織炎細(xì)胞浸潤明顯緩解，潰瘍小，深度達(dá)黏膜層；⑤惠迪和金雙歧聯(lián)合治療組大鼠活動(dòng)緩解、飲食量和體重正常、溏血便明顯緩解，結(jié)腸組織潰瘍和腺體增生基本愈合，但有明顯愈合面存在。金雙歧等五處理對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜損傷的影響見表4。

表4 金雙歧等五處理對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜損傷影響±s，n=6)

注：與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，abP<0. 05，cP<0.01。

2.3金雙歧等五處理大鼠血清IL-4與TNF-α水平變化

金雙歧、對(duì)照、模型、莎爾福、莎爾福和金雙歧聯(lián)合用藥處理大鼠結(jié)腸黏膜IL-4與TNF-α水平變化，見表5。

表5 金雙歧等五處理大鼠結(jié)腸黏膜大鼠IL-4 及TNF-α水平變化

注：與對(duì)照組比較△P﹤0.05；與模型組比較☆P﹤0.05。

金雙歧、對(duì)照、模型、莎爾福、莎爾福和金雙歧聯(lián)合用藥處理大鼠結(jié)腸黏膜IL-4與TNF-α水平變化結(jié)果可以看出：①惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯(lián)合用藥3個(gè)治療組IL-4、TNF-α表達(dá)均低于模型組，表現(xiàn)顯著差異性(P<0.05)，說明金雙歧、惠迪、惠迪和金雙歧聯(lián)合用藥IL-4和TNF-α表達(dá)均有效降低。②惠迪組與金雙歧組和金雙歧和惠迪福聯(lián)合用藥組相比差異性顯著(P<0.05)，與對(duì)照組相比表現(xiàn)差異不顯著(P>0.05)，說明莎爾福和金雙歧聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥治療效果好。③莎爾福組與金雙歧組相比IL-4和TNF-α表達(dá)表現(xiàn)不顯著差異(P>0.05)，說明具有相當(dāng)治療效果。

3 討論

慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)簡稱潰結(jié)，潰瘍性結(jié)腸炎臨床上分四種類型：①初發(fā)型：可轉(zhuǎn)變?yōu)槁詮?fù)發(fā)型或慢性持續(xù)型；②慢性復(fù)發(fā)型：輕度充血、水腫，有典型的潰結(jié)病變；③慢性持續(xù)型：有輕重不等的腹瀉、間斷血便、腹痛及全身癥狀；④急性暴發(fā)型：起病急驟，全身及局部癥狀均嚴(yán)重，易發(fā)生中毒性結(jié)腸擴(kuò)張，腸穿孔及腹膜炎。

慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)臨床主要癥狀：①腹瀉或便秘；②黏液膿血便；③里急后重；④腹痛；⑤全身表現(xiàn)；⑥腸外表現(xiàn)。潰瘍性結(jié)腸炎具有急性暴發(fā)型病死率高；慢性持續(xù)型易反復(fù)發(fā)作癌變率高等特點(diǎn)。

慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)結(jié)腸炎基本病理變化：①結(jié)腸中各種炎性細(xì)胞浸潤。②結(jié)腸中腺體萎縮、破壞、紊亂、基底膜斷裂和消失。③結(jié)腸中隱窩膿腫及潰瘍。④結(jié)腸黏膜下水腫及纖維化。⑤結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞減少或消失以至上皮再生。

慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎疾病病因多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與遺傳因素、免疫功能障礙、感染及精神因素等有關(guān)。近年來，潰結(jié)成為消化系統(tǒng)疾病研究熱點(diǎn)。劉丹等[13]金雙歧聯(lián)合柳氮磺胺吡啶治療潰瘍性結(jié)腸炎療效滿意，較單用柳氮磺胺吡啶好。宋清江等[14]金雙歧片配合辨證口服中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎療效優(yōu)于單純口服金雙歧和單純辨證口服中藥，而復(fù)發(fā)率卻低于單純口服金雙歧和單純辨證口服中藥。李慧等[14]治療潰瘍性結(jié)腸炎金雙歧片與美沙拉秦片聯(lián)合治療可獲得理想效果。

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制世界衛(wèi)生組織目前普遍認(rèn)可原因是由免疫反應(yīng)介導(dǎo)引起，在遺傳與環(huán)境及細(xì)菌協(xié)同作用下發(fā)生潰瘍性結(jié)腸炎，然而腸道內(nèi)細(xì)菌是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病引起的主要原因[11]。

IL-4主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，IL-4對(duì)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用。IL-4是T細(xì)胞自身分泌的生長因子，IL-4多數(shù)情況下對(duì)CTL和LAK細(xì)胞分化有正調(diào)節(jié)作用。IL-4多數(shù)報(bào)道認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎中減少非常明顯，臨床研究表明潰瘍性結(jié)腸炎患者IL-4基因表達(dá)同樣減少。IL-4刺激T、B淋巴細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞因子，由于抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和移動(dòng)就抑制促炎作用，IL-4腸道中抑制腸黏膜維持腸道免疫平衡起關(guān)鍵作用[12]。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TNF-α含量明顯升高，而IL-4含量顯著減少，表明大鼠腸道抗、抑炎因子平衡被破壞。經(jīng)過惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯(lián)合用藥3個(gè)治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TNF-α含量顯著降低，而IL-4含量顯著升高，表明惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯(lián)合用藥治療潰瘍性結(jié)腸炎機(jī)制之一可能是抑制促炎因子TNF-α表達(dá)，提高抗炎因子IL-4表達(dá)。調(diào)整抗、抑炎因子平衡關(guān)系，使腸道抗、抑炎因子平衡恢復(fù)，腸道黏膜組織修復(fù)潰瘍得到良好治療。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，應(yīng)用惠迪、金雙歧和惠迪和金雙歧聯(lián)合用藥3個(gè)治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TNF-α含量顯著降低，而IL-4含量顯著升高，可有效地改善大鼠一般狀況，大鼠腸黏膜充血與水腫及潰瘍明顯減輕，大鼠腹瀉癥狀明顯改善，腸黏膜病理損害明顯減輕，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表現(xiàn)顯著差異性，說明惠迪、金雙歧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療均有效，聯(lián)合用藥效果更佳。

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1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：201610222038；2.佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：xsym2016-02；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：Sjz2012-15；4.黑龍江省教育廳項(xiàng)目，編號(hào)：12511570。

曲博新(1995～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科生。

顏玉(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:yanyu163.com。

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1008-0104(2017)02-0008-03

2016-11-02)