姬松茸菌株J1與J77鎘富集差異及生理響應(yīng)機(jī)制

劉朋虎，李波，江枝和，王義祥，翁伯琦*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福州 350002；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福州 350013；4.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福州 350013）

姬松茸菌株J1與J77鎘富集差異及生理響應(yīng)機(jī)制

劉朋虎1，李波2，江枝和3，王義祥4，翁伯琦4*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福州 350002；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福州 350013；4.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福州 350013）

以姬松茸菌株J1及其誘變菌株J77為材料，研究不同濃度鎘對J1、J77菌絲生長與產(chǎn)量、鎘富集量及相關(guān)氨基酸含量等的影響，分析J1、J77對鎘吸收與耐受性差異及生理響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明：隨著外源添加鎘濃度的增加，J1、J77菌絲生長速度、產(chǎn)量均先增加后降低，低濃度鎘能促進(jìn)姬松茸生長、提高產(chǎn)量；相同濃度外源鎘脅迫下，J77菌絲及子實(shí)體中鎘含量均低于J1，且差異顯著（P＜0.01），J77為低富集鎘的菌株；菌絲中鎘含量與子實(shí)體中鎘含量顯著正相關(guān)（R2＞0.97）；J1、J77子實(shí)體中半胱氨酸含量均先降低后增加，低濃度鎘脅迫下J1半胱氨酸含量較高，高濃度鎘脅迫下J77中半胱氨酸含量較高，半胱氨酸可能與姬松茸鎘富集密切相關(guān)。

姬松茸；鎘；富集；重金屬

姬松茸（Agaricus brasiliensis）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇等，原產(chǎn)于巴西、秘魯和美國等地，是一種珍貴的食藥用菌。1992年，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從日本引進(jìn)姬松茸并栽培成功[1]。經(jīng)過30多年的發(fā)展，我國已經(jīng)成為世界上姬松茸主要產(chǎn)地之一[2]。姬松茸具有杏仁的香味，高蛋白、低脂肪，富含纖維素和礦物質(zhì)元素，是一種營養(yǎng)價(jià)值豐富的食品[3]。且隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)姬松茸菌絲和子實(shí)體中含有多糖、核酸、類固醇、凝集素等多種活性成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗突變、抗炎和抗氧化等多種藥用功能[4-5]。

姬松茸產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮螅瞧渚z對鎘有很強(qiáng)的富集能力，造成子實(shí)體中鎘極易超標(biāo)，危害食品安全及出口創(chuàng)匯。鎘是毒性很強(qiáng)的重金屬元素之一，可以蓄積于人的腎、肝等器官中，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)報(bào)道，姬松茸子實(shí)體中鎘含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)料鎘含量，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他重金屬[6-7]。子實(shí)體中鎘含量超標(biāo)已成為影響姬松茸產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)重要因素。研究表明，不同的姬松茸菌株對鎘富集能力差異顯著[8-11]。所以篩選或者選育低富集鎘的姬松茸菌株是解決姬松茸鎘超標(biāo)的有效方法之一。

本課題組前期以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從日本引進(jìn)的菌株J1（福建省主栽品種之一）為出發(fā)菌株，利用輻射誘變技術(shù)選育到一株高產(chǎn)姬松茸新菌株J77，其子實(shí)體中鎘含量顯著降低[12]。本研究以添加外源鎘的形式研究了不同濃度鎘脅迫對J1、J77菌絲生長、產(chǎn)量的影響，J1、J77對鎘的富集規(guī)律及差異。另據(jù)報(bào)道，真菌中半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸與鎘的解毒密切相關(guān)[13]，因此本研究還測定了不同濃度鎘脅迫下J1、J77子實(shí)體中與鎘富集密切相關(guān)的這3種氨基酸含量的變化規(guī)律。本研究為進(jìn)一步深入研究菌株J77低鎘富集機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為低富集鎘姬松茸菌株選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究供試菌株為姬松茸菌株J1與J77，均保藏于福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分2個(gè)部分：（1）不同濃度鎘對J1、J77菌絲生長的影響。在PDA優(yōu)化固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基中加入一定濃度梯度的外源鎘，使添加外源鎘的濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20、25、50mg·L-1，分別測定2個(gè)菌株在不同濃度鎘脅迫下菌絲生長速度、菌絲鮮量、菌絲中鎘含量，分析2個(gè)菌株對鎘富集及耐受性差異；（2）不同濃度鎘對J1、J77子實(shí)體生長發(fā)育的影響。在培養(yǎng)料中加入一定濃度梯度的外源鎘，使添加外源鎘的濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15、20、25、50mg·kg-1，分別測定2個(gè)菌株在不同濃度鎘脅迫下的產(chǎn)量、子實(shí)體中鎘含量及與鎘富集密切相關(guān)的半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量，分析2個(gè)菌株之間的差異。

1.3 不同濃度鎘對J1、J77菌絲生長的影響

1.3.1 對菌絲生長速度的影響

PDA優(yōu)化培養(yǎng)基：馬鈴薯230 g，蔗糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂0.5 g，維生素B110mg，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH自然。

鎘母液配制：稱取2.031 4 g CdCl2·2.5H2O，溶于蒸餾水并定容于1 L容量瓶中，母液鎘濃度為1 g·L-1。

將鎘母液替換部分PDA優(yōu)化培養(yǎng)基中的水，配制成含有不同濃度鎘的培養(yǎng)基（濃度見1.2），滅菌后無菌條件下倒于培養(yǎng)皿上。先將菌種接種于培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)，待菌落直徑4～6 cm時(shí)，在同一直徑的圓圈上用打孔器打出相同的菌絲塊，接種于含有鎘的培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)，采用平板劃線法測定菌絲的生長速度[14]，每個(gè)處理4個(gè)平行。

二甲戊靈與撲草凈混用防除綠豆田雜草的效果及對綠豆的安全性……… 程玉臣，趙存虎，賀小勇，孔慶全，張富榮，張 輝（80）

1.3.2 對菌絲鮮重影響

與平板處理相同，將不含瓊脂PDA優(yōu)化培養(yǎng)基與鎘母液配制成不同鎘濃度培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，高壓滅菌后接種，于28℃靜置培養(yǎng)30 d，過濾稱取菌絲鮮重，并測定菌絲中鎘含量。

1.4 不同濃度鎘對J1、J77子實(shí)體發(fā)育的影響

培養(yǎng)料配方：棉籽殼20%，玉米芯12.5%，牛糞35%，麩皮10%，稻草20%，CaCO31%，石灰1.5%。

栽培方法：采用熟料袋栽方式出菇。將配方中各種培養(yǎng)料混合均勻，按1∶1.25的比例計(jì)算加水量，先按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將不同鎘母液加入到水中，再將水與培養(yǎng)料混合均勻；混合均勻的培養(yǎng)料分裝到聚丙烯袋中，每袋裝料0.8 kg，放入高壓滅菌鍋中，121℃滅菌2 h，接種后在26℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待菌絲走滿袋后，移到栽培室，開袋覆土。每個(gè)菌株每個(gè)處理設(shè)20個(gè)重復(fù)。覆土后15 d左右即有菇蕾出現(xiàn)，出菇后統(tǒng)計(jì)不同濃度鎘脅迫下2個(gè)菌株的產(chǎn)量，同時(shí)測定不同處理子實(shí)體中鎘含量及半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸含量，計(jì)算鎘的富集系數(shù)。

1.5 測定方法

鎘含量采用火焰原子吸收法進(jìn)行測定[15]，氨基酸含量采用《食品中氨基酸測定》（GB/T 5009.124—2003）方法進(jìn)行[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎘對J1、J77菌絲生長的影響及菌絲對鎘的富集規(guī)律

隨著外源添加鎘濃度的增加，J1和J77菌絲生長速度均呈現(xiàn)先增加后減少的規(guī)律，與之對應(yīng)的菌絲鮮重也呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢（圖1）。菌株J1在添加外源鎘濃度為1.5mg·L-1時(shí)菌絲生長速度最快，而J77在添加外源鎘濃度為2mg·L-1時(shí)菌絲生長速度最快；J1在添加外源鎘1mg·L-1時(shí)菌絲鮮重最大，J77在添加外源鎘2mg·L-1時(shí)菌絲鮮重最大。從菌絲中鎘含量及鎘富集系數(shù)來看（表1）：隨外源鎘濃度的增加，J1、J77菌絲中鎘含量均增加；J1菌絲對鎘富集系數(shù)在180～310之間，在外源鎘為2mg·L-1時(shí)，富集系數(shù)最高；J77菌絲對鎘富集系數(shù)在113～193之間，在外源鎘為25 mg·L-1時(shí)，富集系數(shù)最高；相同外源鎘濃度下J1菌絲中鎘含量高于J77。

圖1 鎘對J1、J77菌絲生長的影響Figure 1 EffectofCd in differentconcentration onmycelium growth rate of J1and J77

2.2 不同濃度鎘脅迫下J1、J77產(chǎn)量及子實(shí)體中鎘含量

在培養(yǎng)料中添加一定濃度梯度的鎘，出菇后收集子實(shí)體，測定不同濃度鎘對J1、J77產(chǎn)量的影響及子實(shí)體中鎘的含量。產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖2）：隨著外源鎘濃度的增加，J1和J77產(chǎn)量均先增加后減少；且2個(gè)菌株均在1mg·kg-1時(shí)產(chǎn)量最高。子實(shí)體中鎘含量檢測表明（表2）：隨鎘濃度的增加，J1、J77中鎘含量逐漸增加，對鎘富集系數(shù)逐漸減少；J1對鎘的富集系數(shù)為24～58，J77對鎘富集系數(shù)為19～45；在相同濃度下，J1子實(shí)體中鎘的濃度均高于J77，且差異達(dá)到顯著或極顯著水平，J77對鎘富集顯著降低。

表1 不同濃度鎘脅迫下J1、J77菌絲中鎘含量及富集系數(shù)Table 1 Effectof Cd in different concentration on Cd content and enrichmentcoefficientof J1and J77mycelium

圖2 鎘對J1、J77產(chǎn)量的影響Figure2 EffectofCd in differentconcentration on yields of J1and J77

對J1、J77菌絲和子實(shí)體中鎘含量相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：J1菌絲與子實(shí)體中鎘含量相關(guān)系數(shù)為0.996，差異極顯著；J77菌絲與子實(shí)體中鎘含量相關(guān)系數(shù)為0.971，差異極顯著。此結(jié)果表明菌絲中鎘含量與子實(shí)體中鎘含量顯著正相關(guān)，菌絲對鎘的吸收能力影響子實(shí)體中的鎘含量。

2.3 不同濃度鎘脅迫對J1、J77中與鎘富集相關(guān)的氨基酸含量的影響

本研究測定了不同濃度鎘脅迫下J1、J77子實(shí)體中半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸含量的變化。半胱氨酸檢測結(jié)果表明（圖3）：隨著外源鎘濃度的增加，菌株J1和J77半胱氨酸的含量均表現(xiàn)為先減少后增加的規(guī)律；J1中半胱氨酸含量變化幅度較小，J77中半胱氨酸含量變化幅度較大，當(dāng)外源鎘濃度在25mg·kg-1以上時(shí)J77中半胱氨酸含量急劇上升；在2mg·kg-1以下J1中半胱氨酸含量大于J77中的含量，且差異極顯著；在15mg·kg-1以上時(shí)，J77中半胱氨酸含量大于J1中的含量，且差異極顯著。

表2 不同濃度鎘脅迫下J1、J77子實(shí)體中鎘含量及富集系數(shù)Table 2 EffectofCd in differentconcentration on Cd contentand enrichmentcoefficientof J1and J77fruiting bodies

甘氨酸檢測結(jié)果表明（圖4）：不同外源鎘處理下，J1、J77子實(shí)體甘氨酸含量變化較小；添加外源鎘濃度在0.5～2.5mg·kg-1之間時(shí)，J1中甘氨酸含量大于J77中含量，而在5～50mg·kg-1之間，J1、J77子實(shí)體中甘氨酸含量無明顯規(guī)律。

谷氨酸檢測結(jié)果表明（圖5）：在相同濃度外源鎘脅迫下，J1、J77子實(shí)體谷氨酸含量變化較??；0.5～2.5 mg·kg-1之間，J1中谷氨酸含量大于J77中含量，而在5～50mg·kg-1之間，J1、J77子實(shí)體中甘氨酸含量無明顯規(guī)律。進(jìn)一步分析J1、J77子實(shí)體中甘氨酸與谷氨酸含量，發(fā)現(xiàn)二者變化規(guī)律一致。

圖3 鎘對J1、J77子實(shí)體半胱氨酸含量的影響Figure3 EffectofCd in differentconcentration on Cyscontentsof J1and J77fruiting bodies

圖4 鎘對J1、J77子實(shí)體甘氨酸含量的影響Figure 4 EffectofCd in differentconcentration on Gly contentsof J1and J77fruiting bodies

圖5 鎘對J1、J77子實(shí)體谷氨酸含量的影響Figure 5 EffectofCd in differentconcentration on Glu contentsof J1and J77fruiting bodies

3 討論

姬松茸菌絲對鎘有很強(qiáng)的富集能力，已經(jīng)引起越來越多學(xué)者的關(guān)注，但是其機(jī)理還不甚清楚[17]。本課題組前期以菌株J1為出發(fā)菌株，經(jīng)過60Co-γ射線誘變，獲得一株低富集鎘的新菌株J77。本研究在此基礎(chǔ)上，采用添加外源鎘的方法，進(jìn)一步研究了J1、J77對鎘吸收與耐受性的差異，并對兩個(gè)菌株中與鎘富集密切相關(guān)的氨基酸含量進(jìn)行檢測，初步揭示了J77低富集鎘的生理機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

隨著鎘濃度增加，J1和J77菌絲生長速度均表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢，表明低濃度的鎘能夠促進(jìn)姬松茸菌絲生長，這與以前報(bào)道一致[18]。在添加不同濃度外源鎘處理下，J77菌絲體與子實(shí)體中鎘含量均低于J1，表明J77菌絲對鎘吸收較少，導(dǎo)致菌絲及子實(shí)體中鎘含量較低，J77為低富集鎘的菌株。從菌絲與子實(shí)體鎘含量相關(guān)性分析結(jié)果來看，J1和J77菌絲與子實(shí)體中鎘含量相關(guān)性均為極顯著（97%以上），說明采用添加外源鎘的形式液體培養(yǎng)菌絲可以作為初步篩選低鎘姬松茸菌株的方法。

真菌中普遍存在對金屬離子具有親和能力的蛋白質(zhì)（肽），稱為金屬硫蛋白（MT），可以結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬離子，使其以不具有生物活性的無毒的螯合物形式存在，降低金屬離子的活性，從而減輕金屬離子對細(xì)胞的毒害作用。相關(guān)研究表明，在食用菌中的金屬硫蛋白通常由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸等3種氨基酸組成[19]。李開本等[6]研究表明，巴西蘑菇子實(shí)體中谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸等構(gòu)成富鎘多肽的三種主要氨基酸含量均明顯高于雙孢蘑菇。江啟沛[19]分析姬松茸富鎘的原因之一是細(xì)胞內(nèi)特異的與Cd2+結(jié)合的谷氨酸含量高，并發(fā)現(xiàn)Cd2+結(jié)合蛋白的存在。江枝和等[20]用灰色系統(tǒng)理論分析了姬松茸子實(shí)體中17種氨基酸含量與重金屬鎘含量的關(guān)系，結(jié)果表明：半胱氨酸含量與鎘含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)最大，谷氨酸含量與金屬鎘含量兩者關(guān)聯(lián)系數(shù)最小[20]。本研究結(jié)果表明，隨著鎘濃度增加，兩個(gè)菌株中半胱氨酸含量呈明顯規(guī)律性，且高濃度鎘脅迫下，J77中半胱氨酸顯著增加，表明半胱氨酸可能對姬松茸解毒具有重要作用。

4 結(jié)論

J1、J77菌株對鎘富集具有明顯差異性，J77為低富集鎘的菌株；菌絲中鎘含量與子實(shí)體中鎘含量顯著正相關(guān)，采用菌絲液體培養(yǎng)的方法可以初步篩選低鎘菌株；半胱氨酸的含量可能與姬松茸鎘富集有關(guān)。

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Com parison and physiologicalm echanism sof cadm ium（Cd）accumulation by strain J1and mutant J77of Agaricusbrasiliensis

LIUPeng-hu1,LIBo2,JIANGZhi-he3,WANGYi-xiang4,WENGBo-qi4*
（1.National Engineering Research Centerof JUNCAO Technology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.College ofResources and Environment,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;3.Institute of Soiland Fertilizer Sciences,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China;4.Institute of Agricultural Ecology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China）

Agaricus brasiliensis is an edible andmedicinalmushroom with a strong capability of cadmium accumulation,whichmay impact food security.Using a combination of60Co-γray and UV light,we previously bred a new A.brasiliensis strain named J77by irradiating mycelium of strain J1.Owing to its low Cd contentand high stable yield,J77wasapproved asa new variety named Fuji77 by the Crop Variety Approval Committee of Fujian Province in 2013.Using the A.brasiliensis strain J1and itsmutant J77as researchmaterials,the effects of Cd in differentconcentrationsonmycelium growth rate and yields,Cd accumulation and contentsof three amino acids inmycelium,and fruiting bodies of J1and J77were analyzed by adding different concentrations of Cd into the culturemedium to reveal the differences in Cd uptake, tolerance,and physiological responsemechanisms between J1and J77.The results showed thatmycelium growth rate and yields of J1and J77increased firstand then declined with the increase of Cd concentration,which indicated that Cd of lower concentrations could promote the growth ofmycelium and increase the yields.Under the same concentration of Cd,Cd contents in bothmycelium and fruiting body of J77were significantly lower than those of J1,which indicated that J77was a lower Cd accumulative strain.In addition,there was a significant positivecorrelation between Cd contents inmycelium and fruiting bodies（R2＞0.97）.Cysteine（Cys）contents in both fruiting bodies of J1and J77decreased firstand then increased with the increase of Cd concentrations.Cys contentwas significantly higher in fruiting body of J1compared with J77under lower Cd concentrations.In contrast,the Cys content in the fruitbody of J77was significantly higher than thatof J1under higher Cd concentrations.These results indicated thatCysmightplay an important role in Cd accumulation in A.brasiliensis.

Agaricusbrasiliensis;cadmium（Cd）;accumulation;heavymetal

X171.5

A

1672-2043（2017）05-0863-06

10.11654/jaes.2017-0073

2017-01-13

劉朋虎（1982—），男，山東莘縣人，副研究員，主要從事食用菌重金屬污染與遺傳、育種等方面的研究。E-mail：phliu1982@163.com

*通信作者：翁伯琦E-mail：wengboqi@163.com

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01077）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JA13108）；福建省菌草生態(tài)產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心攻關(guān)項(xiàng)目（K80DN8002-JCXTGG16）

Project supported：The Natural Science Foundation of Fujian Province（2015J01077）；Foundation for Young and Middle-aged Teacher of Fujian Education Department（JA13108）；Key SubjectofCooperation Innovation Centerof JUNCAOEcological IndustryofFujian Province（K80DN8002-JCXTGG16）

劉朋虎，李波，江枝和，等.姬松茸菌株J1與J77鎘富集差異及生理響應(yīng)機(jī)制[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（5）：863-868.

LIUPeng-hu,LIBo,JIANG Zhi-he,etal.Comparison and physiologicalmechanismsofcadmium（Cd）accumulation by strain J1and mutant J77of Agaricus brasiliensis[J].JournalofAgro-EnvironmentScience,2017,36（5）:863-868.