普通小麥近緣種低分子量麥谷蛋白亞基Glu-A3基因的分離和鑒定

董 雪 劉 夢(mèng) 趙獻(xiàn)林 馮玉梅 楊 燕,*

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普通小麥近緣種低分子量麥谷蛋白亞基基因的分離和鑒定

董 雪1劉 夢(mèng)1趙獻(xiàn)林2,*馮玉梅1楊 燕1,*

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所 / 河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 小麥國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州450002

低分子量麥谷蛋白約占小麥種子貯藏蛋白的三分之一, 對(duì)面團(tuán)延展性和食品加工品質(zhì)有重要影響。普通小麥近緣種是小麥遺傳改良的重要基因資源。本研究利用位點(diǎn)特異性引物對(duì)野生二粒小麥、栽培二粒小麥、硬粒小麥及野生一粒小麥共計(jì)9份材料進(jìn)行、、基因擴(kuò)增和鑒定, 各發(fā)現(xiàn)5個(gè)等位變異, 共計(jì)15個(gè)單元型; 其中, 有2個(gè)等位變異含有9個(gè)半胱氨酸殘基, 可能屬于優(yōu)良品質(zhì)亞基。對(duì)小麥近緣種中這些位點(diǎn)等位變異的鑒別, 進(jìn)一步完善了小麥低分子量麥谷蛋白亞基的構(gòu)成, 并為小麥品質(zhì)育種中親本的選擇提供了相應(yīng)依據(jù)。

普通小麥近緣種; 低分子量麥谷蛋白亞基;基因; 等位變異

普通小麥近緣種植物是指小麥屬中的其他物種和小麥族中的其他各屬物種, 包括山羊草屬(L.)、黑麥屬(L.)、大麥屬(L.)等38個(gè)屬[1], 一粒小麥和二粒小麥被認(rèn)為是普通小麥的祖先。近年來(lái), 對(duì)小麥品質(zhì)的改良越來(lái)越受到重視, 而蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量對(duì)小麥加工品質(zhì)具有決定性作用。小麥貯藏蛋白主要包括麥谷蛋白和醇溶蛋白, 麥谷蛋白的含量對(duì)面筋強(qiáng)度有著重要影響。根據(jù)分子量大小的不同, 可將麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)[2], 其中LMW-GS約占麥谷蛋白的60%。大部分LMW-GS通過(guò)第一組染色體短臂上的(、和)位點(diǎn)編碼[3]。在小麥中已報(bào)道的編碼LMW-GS 家族的、和基因位點(diǎn)約有70個(gè)[2,4]; 在其他位點(diǎn)上也相繼有過(guò)報(bào)道, 例如在染色體1B上的和[5], 在染色體1D上的和7D上的[6-7]。目前無(wú)論是在普通小麥或是近緣種材料中, 在D染色體上的LMW-GS基因要比在A和B染色體上的研究多一些。但是3個(gè)位點(diǎn)中不同等位基因的亞基間分子量很接近, 且有的亞基的鑒定需要依賴其表達(dá)量來(lái)區(qū)分[7-8], 所以很難發(fā)現(xiàn)新的亞基。由于低分子量麥谷蛋白亞基拷貝數(shù)較多, 其分子量與醇溶蛋白分子量相似, 用傳統(tǒng)分離方法SDS-PAGE很難將其區(qū)分開來(lái), 對(duì)LMW-GS的分析、分離以及鑒定技術(shù)還不夠完善; 因此對(duì)LMW-GS遠(yuǎn)不及對(duì)HMW-GS研究得那么深入。近年來(lái), 采用基因特異性引物已經(jīng)從普通小麥品種、近等基因系和近緣種中獲得了很多LMW-GS的編碼基因及相應(yīng)的單元型[8-11]。Wang等[12]從位點(diǎn)分離出3個(gè)LMW-GS基因,和, 共包含有6個(gè)等位基因(a, b, c, d, e, f), 并從位點(diǎn)分離出4個(gè)LMW-GS基因、、和以及相應(yīng)的9個(gè)等位變異類型[12]; Zhao等[13]從位點(diǎn)分離出6個(gè)LMW-GS基因12個(gè)等位變異。許多研究認(rèn)為, 在位點(diǎn)編碼的LMW-GS等位基因?qū)π←溒焚|(zhì)有重要影響, 其中位點(diǎn)上的和等位基因?qū)υ黾用鎴F(tuán)筋度和改善烘烤品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)[14-17]。LMW-GS不僅存在于普通小麥品種中, 也存在于其近緣種中; 例如, Qin等[18]在野生二粒小麥位點(diǎn)鑒定出5個(gè)LMW-GS基因; Zhao等[13]證明節(jié)節(jié)麥也含有6個(gè)與普通小麥相對(duì)應(yīng)的編碼基因。目前, 從普通小麥及其近緣種中發(fā)現(xiàn)的LMW-GS基因、片段基因和假基因已經(jīng)超過(guò)200個(gè)[2,4]。由于LMW-GS對(duì)小麥加工品質(zhì)的重要性, 鑒定LMW-GS基因的等位變異, 開發(fā)出相應(yīng)的分子標(biāo)記, 對(duì)小麥品質(zhì)育種具有重要意義[19]。目前為止, 已經(jīng)研發(fā)出了一些LMW-GS基因的功能標(biāo)記,如Zhang 等[20]根據(jù)位點(diǎn)的1個(gè)LMW-GS 基因的等位變異, 開發(fā)出一套位點(diǎn)等位基因的PCR標(biāo)記, 可以有效地鑒定出該位點(diǎn)的等位基因類型, 并在小麥資源及育種材料的篩選中加以利用[21-23]; Zhao等[13]從位點(diǎn)擴(kuò)增出6個(gè)LMW-GS基因的12個(gè)等位變異, 并根據(jù)各基因等位變異之間的SNP或InDel開發(fā)出7個(gè)單元型的STS標(biāo)記; Wang等[12,23]對(duì)和位點(diǎn)的基因進(jìn)行了鑒定, 開發(fā)出相應(yīng)的特異性STS標(biāo)記, 并利用CIMMYT小麥材料進(jìn)行了驗(yàn)證。

鑒于普通小麥近緣種在小麥育種中的重要價(jià)值, 本研究利用特異性引物[23]對(duì)9份材料進(jìn)行、、基因擴(kuò)增和鑒定, 擬發(fā)現(xiàn)新的等位變異, 為小麥品質(zhì)育種中的親本選擇提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 植物材料及其DNA提取

供試材料包括9份含A組染色體的小麥近緣種, 其中野生一粒小麥3份(B01、B03和B04, AA), 野生二粒小麥3份(DS1、DS3和15, AABB), 栽培二粒小麥2份(DM2和DM3, AABB), 硬粒小麥1份(Langdon, AABB), 均由河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。

選取每個(gè)供試材料3~5粒種子, 在潔凈培養(yǎng)皿中25℃下培養(yǎng)5~7 d后, 取1~2 g葉片經(jīng)液氮冷凍。采用CTAB法[24]提取基因組DNA。

1.2 引物篩選和PCR擴(kuò)增

LMW-GS基因位點(diǎn)的特異性引物選自王林海文章[23], 引物序列及其他信息見表1。PCR擴(kuò)增體系含模板 DNA 100 ng, 上、下游引物各1 μL (20 μmol L–1),DNA聚合酶(5 U μL–1, TaKaRa Ex) 1 μL, 10× PCR buffer 5 μL, dNTP Mix (2.5 mmol L-1) 4 μL, 加無(wú)菌水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性45 s, 57~58℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 共32個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min, 4℃保存。

1.3 PCR產(chǎn)物純化與克隆

采取兩種方法測(cè)序, 一是直接測(cè)序, 二是克隆(利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-T1載體)后測(cè)序, 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)序3~6次, 由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列分析

核苷酸序列比對(duì)、推導(dǎo)氨基酸序列分析以及相關(guān)基因的序列比對(duì), 均用DNAMAN和Vector NTI Advance軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通小麥近緣種的等位變異檢測(cè)

利用引物L(fēng)A1F/LA1R對(duì)9份普通小麥近緣種進(jìn)行基因擴(kuò)增, 共獲得6個(gè)目標(biāo)條帶(圖1-A),測(cè)序分析后檢測(cè)到6個(gè)等位變異類型。其中在硬粒小麥Langdon中擴(kuò)增的核苷酸序列與GenBank中單元型(GenBank登錄號(hào)為FJ549934.1)相同。另5個(gè)新的單元型分別來(lái)自栽培二粒小麥DM2, 野生二粒小麥DS3, 野生二粒小麥15、栽培二粒小麥DM3和野生一粒小麥B03, 其序列長(zhǎng)度在1438~ 1537 bp之間, 編碼區(qū)長(zhǎng)度為1065~1164 bp, 分別命名為、、、和(GenBank登錄號(hào)分別為KX879094、KX879095、KX879096、KX879097和KX879098)。將5個(gè)新的單元型與進(jìn)行核苷酸序列比對(duì), 發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)第951 nt處堿基C替換為T, 使得對(duì)應(yīng)的精氨酸(R)替換為半胱氨酸(C) (見附圖1-A);在213–236 nt和990–998 nt處分別有24 bp和9 bp的缺失, 其推導(dǎo)的氨基酸序列AP1-9在對(duì)應(yīng)位置分別有8個(gè)氨基酸和3個(gè)氨基酸的缺失, 另外有9個(gè)SNP為錯(cuò)義突變, 7個(gè)SNP為同義突變;在279~302 nt、621~623 nt和984~998 nt處, 分別有24、3和15 bp的缺失, 這些缺失并沒有引起翻譯閱讀框架的改變, 另在編碼區(qū)內(nèi)有19個(gè)SNP, 包括8個(gè)錯(cuò)義突變, 8個(gè)同義突變和3個(gè)無(wú)義突變(編碼終止密碼子, 形成假基因);在編碼區(qū)的213~236 nt和993~1001 nt處, 分別有24 bp和9 bp的堿基缺失, 另有19個(gè)SNP, 包括12個(gè)錯(cuò)義突變和7個(gè)同義突變, 在620 nt后有一個(gè)3 bp的插入。在編碼區(qū)的300~302 nt、540~620 nt和990~1004 nt處分別有3、81和15 bp的缺失, 這些缺失并沒有引起翻譯閱讀框架的改變, 另有35個(gè)SNP, 包括15個(gè)錯(cuò)義突變和20個(gè)同義突變。

表1 Glu-A3位點(diǎn)基因特異性引物

引物位置從參考基因的第一個(gè)核苷酸計(jì)算。引物序列來(lái)自王林海[23]。

Primer location counted from the first nucleotide of the available gene fragments. Primersequences are from Wang[23].

利用引物L(fēng)A2F/LA2R擴(kuò)增基因(圖1-B), 共獲得8個(gè)目標(biāo)條帶, 測(cè)序分析后共檢測(cè)到6個(gè)等位變異類型。其中, 在野生一粒B01中擴(kuò)增的序列與單元型(FJ549937.1)相同, 其他5個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的等位變異類型, 分別命名為(KX879101, 來(lái)自野生二粒小麥DS1)、(KX879102, 來(lái)自野生二粒小麥DS3、栽培二粒小麥DM3以及硬粒小麥Langdon)、(KX879103, 來(lái)自栽培二粒小麥DM2)、(KX879104, 來(lái)自野生一粒小麥B03)和(KX879105, 來(lái)自野生一粒小麥B04), 其核苷酸序列長(zhǎng)度在1070~1100 bp之間, 完整編碼區(qū)長(zhǎng)度為882~912 bp。在編碼區(qū)內(nèi), 與單元型(FJ549937.1)相比, 等位變異類型、、和在320 nt后有3個(gè)CAA重復(fù)序列的缺失。另外,在368 nt后有21 bp的缺失, 使對(duì)應(yīng)肽鏈的N-末端重復(fù)區(qū)缺少PFSQQQP序列(見附圖1-B), 在728 nt處C堿基替換為A堿基, 使得編碼酪氨酸的密碼子UAC變?yōu)榻K止密碼子UAA;包含4個(gè)錯(cuò)義突變和5個(gè)同義突變;和在485 nt后有一個(gè)3 bp (CAA)的插入序列, 且含有8個(gè)SNP;有3個(gè)錯(cuò)義突變和2個(gè)同義突變。

利用引物L(fēng)A3F/LA3R擴(kuò)增基因獲得8個(gè)目標(biāo)條帶(圖1-C), 測(cè)序分析檢測(cè)到6個(gè)等位變異類型。從栽培二粒小麥DM2和DM3以及硬粒小麥Langdon中擴(kuò)增得到的單元型(GenBank登錄號(hào)為FJ549944.1)與王林海[23]報(bào)道的基因相同。另外5個(gè)為新的等位變異, 分別命名為(來(lái)自野生二粒小麥DS1, GenBank登錄號(hào)為KX879108)、(來(lái)自野生二粒小麥15, GenBank登錄號(hào)為KX879109)、(來(lái)自野生一粒小麥B01, GenBank登錄號(hào)為KX879110)、(來(lái)自野生一粒小麥B03, GenBank登錄號(hào)為KX879111)和(來(lái)自野生一粒小麥B04, GenBank登錄號(hào)為KX879112), 它們的序列長(zhǎng)度在1348~1420 bp之間, 其完整編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為972~1044 bp。與單元型編碼區(qū)相比, 等位變異有15個(gè)錯(cuò)義突變、17個(gè)同義突變和1個(gè)無(wú)義突變, 其中無(wú)義突變?cè)诘?14個(gè)堿基處C替換成T, 形成終止密碼子UAA。等位變異有7個(gè)錯(cuò)義突變, 12個(gè)同義突變和2個(gè)無(wú)義突變, 無(wú)義突變分別發(fā)生在第516 bp和921 bp處, 分別形成終止密碼子UAA和UAG, 使得翻譯終止(見附圖1-C);中, 含有19個(gè)錯(cuò)義突變、18個(gè)同義突變和2個(gè)無(wú)義突變, 其中無(wú)義突變?cè)?45 nt和1012 nt處, 均為C替換T, 翻譯成終止密碼子; 等位變異共有45個(gè)SNP, 在230 nt后有2個(gè)CAA重復(fù)序列的插入, 該插入并沒有引起翻譯閱讀框架的移動(dòng); 等位變異有17個(gè)錯(cuò)義突變, 21個(gè)同義突變及2個(gè)無(wú)義突變, 無(wú)義突變分別發(fā)生在612 nt和759 nt處, 均為C替換T, 導(dǎo)致翻譯終止, 形成假基因。

A: LA1F/LA1R擴(kuò)增產(chǎn)物(1438~1537 bp); B: LA2F/LA2R擴(kuò)增產(chǎn)物(1070~1100 bp); C: LA3F/LA3R擴(kuò)增產(chǎn)物(1348~1420 bp)。M: DL2000 marker; 1: 野生二粒小麥DS1; 2: 野生二粒小麥DS3; 3: 野生二粒小麥15; 4: 栽培二粒小麥DM2; 5: 栽培二粒小麥DM3; 6: 硬粒小麥Langdon; 7: 野生一粒小麥B01; 8: 野生一粒小麥B03; 9: 野生一粒小麥B04。

A: PCR products amplified with the primer set LA1F/LA1R (1438–1537 bp); B: PCR products amplified with the primer set LA2F/LA2R (1070–1100 bp); C: PCR products amplified with the primer set LA3F/LA3R (1348–1420 bp). M: DL2000 marker; 1:DS1; 2:DS3; 3:15; 4:DM2; 5:DM3; 6:Langdon; 7:accession B01; 8:B03; 9:B04.

2.2 普通小麥近緣種基因的等位變異推導(dǎo)氨基酸特征

本研究獲得的3個(gè)基因、和的每一個(gè)單元型在起始密碼子上游區(qū)域都含有TATA結(jié)構(gòu)和起始密碼子ATG; 其中和含有雙聯(lián)體終止密碼子TGATAA; 而中的單元型和含有單個(gè)終止密碼子;和編碼區(qū)的下游區(qū)域有多個(gè)多聚腺苷酸AATAAA結(jié)構(gòu)。

從基因推導(dǎo)氨基酸序列可以看出,的等位變異、、和,的等位變異、、和以及的等位變異都含有完整的開放閱讀框, 可以編碼完整的氨基酸序列; 而其他等位變異(、、、、和)在編碼區(qū)內(nèi)各含有1~2個(gè)終止密碼子, 屬于假基因。其中編碼的肽鏈AP1-8和編碼的肽鏈AP3-12均含有9個(gè)半胱氨酸殘基(見附圖1-A), AP1-8多出的半胱氨酸位于半胱氨酸富集區(qū), AP3-12多出的半胱氨酸則位于谷酰胺富集區(qū); 其余新發(fā)現(xiàn)的單元型編碼的肽鏈則具有典型的8個(gè)半胱氨酸殘基。

2.3 在普通小麥近緣種中新擴(kuò)增基因與GenBank相關(guān)基因的相似性

與GenBank中普通小麥基因比對(duì), 本研究從近緣種中得到的、和與相應(yīng)的普通小麥基因之間的相似性依次為96.5%~99.9%、98.9%~99.7%和95.8%~99.4% (表2), 其中不同來(lái)源的相似性最高, 而不同來(lái)源的相似性最低。將本研究擴(kuò)增的3個(gè)基因的15個(gè)單元型與GenBank中的序列比對(duì), 基因序列之間的相似性在67.7%~99.9%之間(表2); 其中, 本研究擴(kuò)增的和單元型與GenBank中部分基因序列的相似性分別達(dá)到99%以上, 而在的5個(gè)新等位變異中, 只有與的相似性達(dá)到99.4%, 其余的相似度均在99%以下, 說(shuō)明基因的堿基序列變化大于其他2個(gè)基因。

由于在GenBank中注冊(cè)的這些普通小麥基因序列的長(zhǎng)度差別較大, 有的序列只包括編碼區(qū), 而有的不止有編碼區(qū)還包含了調(diào)控區(qū)的序列。為了更進(jìn)一步地探討基因在進(jìn)化上與普通小麥的關(guān)系, 我們把本研究中發(fā)現(xiàn)的15個(gè)特有的單元型與GenBank中搜索到的32個(gè)普通小麥和1個(gè)硬粒小麥的基因(AY146587)的編碼區(qū)進(jìn)行了親緣關(guān)系分析, 保證了這些基因序列之間的比較區(qū)域都是從起始密碼子開始到終止密碼子結(jié)束(圖2)。進(jìn)化樹顯示, 所有序列分屬于3個(gè)分支, 其中有20個(gè)序列和基因的序列聚為一類, 7個(gè)序列和基因的序列聚為一類, 6個(gè)序列和基因的序列聚為一類?？梢钥闯? 在普通小麥和硬粒小麥中大部分序列和基因有更近的親緣關(guān)系, 說(shuō)明基因比和基因更多地參與到小麥的進(jìn)化過(guò)程中。

表2 本研究鑒定的Glu-A3位點(diǎn)新單元型與GenBank中相關(guān)序列的同源性比較

不考慮序列長(zhǎng)度。加粗體表示假基因。Irrespective of the sequence length. Pseudogenes are in bold font.

3 討論

低分子量麥谷蛋白亞基基因核苷酸序列的長(zhǎng)短, 主要是由重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)序列的多少?zèng)Q定的, 不同等位變異之間的差別則取決于核苷酸序列間SNP和InDel的數(shù)目。本研究在9份小麥近緣種中發(fā)現(xiàn)、和的18個(gè)單元型, 其中3種單元型(、和)曾在普通小麥中報(bào)道過(guò)[23], 分別來(lái)自硬粒小麥Langdon、野生一粒B01及栽培一粒小麥DM2、DM3和硬粒小麥Langdon, 據(jù)此推測(cè), 這些近緣種很可能與普通小麥的起源有關(guān)。另外15個(gè)單元型以前未見報(bào)道, 屬于新的等位變異類型, 分別是等位變異、、、和,等位變異、、、和, 以及等位變異、、和。、和基因間的相似性約為83.5%~95.6%, 而這3個(gè)基因各自的等位變異之間的相似性分別為96.4%~99.9%、98.9%~99.8%和95.8%~99.4% (表2和表3)。在每一基因的等位變異之間存在著較大的堿基序列和氨基酸序列差異, 充分證明在普通小麥近緣種中有廣泛的LMW-GS基因多樣性, 是小麥品質(zhì)遺傳改良不可忽視的基因資源。同時(shí)發(fā)現(xiàn),基因的等位變異類型多數(shù)為假基因, 只有在野生一粒小麥B03中得到的單元型在理論上能夠表達(dá), 這一證據(jù)支持一粒小麥?zhǔn)瞧胀ㄐ←湹淖嫦鹊慕Y(jié)論[25]。

根據(jù)N末端起始氨基酸的不同(甲硫氨酸、絲氨酸或異亮氨酸), 又可將低分子量麥谷蛋白亞基分為L(zhǎng)MW-m、LMW-s和LMW-i 3種類型[26-27]。據(jù)此可以確定, 本研究獲得的氨基酸序列AP1和AP3的N末端為 ISQQQQ-, 屬于LMW-i類型, AP2的N-末端為MDTSYIP-和 MDTSCIP-, 屬于LMW-m類型。編碼的AP1的分子量范圍為40.8~44.7 kDa,編碼的AP2的分子量為32.8~34.2 kDa,編碼的AP3的分子量為36.7~39.9 kDa, 與前人報(bào)道基本一致[12,23]。

最難得的是, 在栽培二粒小麥DM2和野生一粒小麥B03中獲得含有9個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-GS。而大多數(shù)LMW-GS含有8個(gè)半胱氨酸殘基, 在第1和第7位上的半胱氨酸殘基形成分子間二硫鍵, 其余6個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵。AP1-8和AP3-12都是在第6位和第7位半胱氨酸殘基之間多出一個(gè)半胱氨酸殘基。Zhao等[28]在小麥品種小偃6號(hào)的1D染色體上發(fā)現(xiàn)含有9個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-GS, 其多出的半胱氨酸殘基在第3和第4位半胱氨酸殘基之間; 另外, 李黎等[9]在小麥品種豫麥50的1D染色體上也發(fā)現(xiàn)了含有9個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-GS, 其多出的半胱氨酸殘基在C末端I區(qū)內(nèi)。Si等[11]在1B染色體上也發(fā)現(xiàn)含有9個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-GS, 其多出的半胱氨酸殘基在第7和第8位半胱氨酸殘基之間。根據(jù)Zhao等[28]和Xu等[29]的報(bào)道, 與含有8個(gè)半胱氨酸殘基LMW-GS材料的面粉相比, 含有9個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-GS更有助于形成分子間二硫鍵, 進(jìn)而提高和面時(shí)間、顯著增強(qiáng)面團(tuán)強(qiáng)度、增多蛋白聚合體, 減弱抗延阻力。進(jìn)一步對(duì)栽培二粒小麥DM2和野生一粒小麥B03獲得含有9個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-GS的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), AP3-12蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊所占的比例之和為22.8%, 明顯低于位點(diǎn)的其他LMW-GS中α-螺旋和β-折疊的比例之和(25.2%~29.3%), 這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可能與多出的一個(gè)半胱氨酸殘基有關(guān), 使得該LMW-GS更有利于形成分子間二硫鍵, 從而影響其三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)型, 進(jìn)而會(huì)影響蛋白的功能及面粉品質(zhì)。據(jù)此推測(cè), 栽培二粒小麥DM2和野生一粒小麥B03有可能是小麥優(yōu)質(zhì)育種的基因資源, 這有待進(jìn)一步深入研究。

表3 3個(gè)Glu-A3基因的15個(gè)新單元型(下對(duì)角線)及其推導(dǎo)氨基酸(上對(duì)角線)序列的相似性比較

下對(duì)角線為新單元型, 上對(duì)角線為推導(dǎo)氨基酸, 不考慮序列長(zhǎng)度。加粗體表示假基因。

New haplotypes are below diagonal; new haplotypes deduced amino-acid sequences are above diagonal; irrespective of the sequence length. Pseudogenes are in bold font.

4 結(jié)論

普通小麥近緣種中LMW-GS的基因存在著豐富的等位變異。在野生二粒小麥、栽培二粒小麥、硬粒小麥和野生一粒小麥共9份材料中, 發(fā)現(xiàn)、和基因的15個(gè)新的等位變異; 其中在栽培二粒小麥DM2和野生一粒小麥中鑒定出的2個(gè)LMW-GS基因各含有9個(gè)半胱氨酸殘基, 有可能是小麥優(yōu)質(zhì)育種不可多得的基因資源。

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(附圖1)

附圖1位點(diǎn)推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)

Supplementary figure 1 Alignments of deduced amino-acid sequences onloci

(A): AP1-7與5個(gè)單元型推導(dǎo)氨基酸的序列比對(duì); (B): AP2-3與5個(gè)單元型推導(dǎo)氨基酸的序列比對(duì); (C): AP3-6與 5個(gè)單元型推導(dǎo)氨基酸的序列比對(duì)。帶下畫線的加粗體字母表示半胱氨酸殘基, 灰色背景顯示突變位點(diǎn)。黑色和白色倒三角分別指示N末端保守區(qū)和重復(fù)區(qū)的起始點(diǎn); 箭頭指表示C末端的3個(gè)亞區(qū), 包括半胱氨酸富集區(qū)、谷酰胺富集區(qū)和末端保守區(qū)的起始點(diǎn)。

(A): Alignments of deduced amino-acid sequences (AP1-7) of onehaplotype and those (AP1-8 to AP1-12) of fivegenes; (B):Alignments of deduced amino-acid sequences (AP2-3) of onehaplotype and those (AP2-7 to AP2-11) of fivegenes; (C):Alignments of deduced amino-acid sequences (AP3-6) of onehaplotype and those (AP3-9 to AP3-13) of fivegenes. The positions of the cysteine residues are bold and underlined, and mutation loci are shadowed. Filled nabla the beginning of short N-terminal conserved region; open nabla shows the beginning of N-terminal repetitive domain; down arrow shows the beginning of the three subregions of C-terminal part of the protein, including a cysteine-rich region, a glutamine-rich region and shows the final conserved part of proteins, respectively.

Isolation and Characterization of LMW-GSin Common Wheat Related Species

DONG Xue1, LIU Meng1, ZHAO Xian-Lin2,*, FENG Yu-Mei1, and YANG Yan1,*

1The functional Laboratory of Plant Biotechnology, College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China;2Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences / Henan Key Laboratory of Wheat Biology / National Engineering Laboratory for Wheat / Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Breeding in Central Huang-Huai Region, Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China

Low-molecular-weight glutenin subunits (LMW-GS) account for about one-third of wheat seed storage proteins and have great effects on dough extensibility and food processing quality. Common wheat relative species are important genetic resources for wheat improvement. In this study, the specific primers ofgenes were used to identify the allelic variations of,,andfrom nine accessions of,,, and. A total of 15new haplotypes were identified, including five in, five in, and five in. Among them, two haplotypes each contained nine cysteines that might be good for improvement of wheat quality. The results aboutgenes in wheat further made clear composition of LMW-GS and provide a basis for selection of parents in wheat quality breeding.

Common wheat related species; LMW-GS;gene; Allelic variation

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271726), 內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014MS0338), 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2014XYQ-18)和教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(Z2009-1-01060)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271726), the Natural Science Foundation of Inner Mongolia (2014MS0338), the Excellent Young Scientist Foundation of Inner Mongolia Agricultural University (2014XYQ-18), and the Chunhui Project funded by the Ministry of Education (Z2009-1-01060).

(收稿日期): 2016-10-02; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-02-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.00829

(Corresponding authors):楊燕, E-mail: yangyanchutao@126.com; 趙獻(xiàn)林, E-mail: xlin918@126.com

E-mail: dongxue225@126.com

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1009.018.html