桑樹1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)啟動子功能分析

余 建 劉長英 趙愛春 王傳宏 蔡雨翔 余茂德

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桑樹1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因()啟動子功能分析

余 建 劉長英 趙愛春 王傳宏 蔡雨翔 余茂德*

西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 / 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 重慶 400715

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作為關(guān)鍵酶, 能夠催化1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。為探究桑樹基因在桑樹生長發(fā)育和抵御外界脅迫中的功能, 本研究構(gòu)建了pMnACO::GUS的植物表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。采用GUS組織染色法鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥不同生長階段及脅迫處理后的GUS活性。通過PCR克隆得到和啟動子片段, 它們分別為1518 bp和1429 bp, 啟動子區(qū)域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他響應(yīng)外界刺激的順式作用元件。GUS活性分析顯示啟動子能驅(qū)動GUS在擬南芥中表達;啟動子能驅(qū)動GUS在擬南芥的根、葉片、花瓣、花藥、花絲、柱頭以及果莢中表達, 且活性較強;啟動子不能驅(qū)動GUS在果莢中無表達。轉(zhuǎn)和植株經(jīng)不同逆境處理后GUS表達活性不同, 轉(zhuǎn)植株的GUS活性隨處理延長時間而減弱, 轉(zhuǎn)植株GUS活性隨處理時間延長而增強。qRT-PCR檢測2周苗齡的桑幼苗在經(jīng)過脅迫處理后和的基因表達量, 發(fā)現(xiàn)基因的表達模式與啟動子GUS活性變化趨勢一致。本研究結(jié)果表明,為誘導(dǎo)型啟動子,兼具組成型啟動子特性,2兼具組織特異型啟動子特性。在轉(zhuǎn)基因植株中對脅迫響應(yīng)能力更強, 預(yù)示著可將其用來調(diào)控改良桑樹品種抗逆性靶基因;可能與果實成熟有關(guān), 可將其啟動子作為果實特異性啟動子對桑椹品質(zhì)進行合理改良。

桑樹; 乙烯; ACO; 啟動子; GUS; 功能分析

乙烯是一種結(jié)構(gòu)簡單的植物氣體激素, 在植物整個生命周期中調(diào)控多種生長發(fā)育和脅迫應(yīng)激反應(yīng)[1], 包括種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長、下胚軸增粗、性別決定、果實成熟、葉片脫落、花的衰老、抵御病原體、機械創(chuàng)傷反應(yīng)、鹽脅迫和寒冷脅迫等[2-3]。同時, 乙烯與其他多種內(nèi)源激素也存在著緊密聯(lián)系[4]。

ACO (1-Aminocyclopropane-1-carboxylate Oxidase, 1-氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶)是乙烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶, 能夠催化ACC (1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸, 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid)形成乙烯,最早被Yang等[5]學(xué)者發(fā)現(xiàn)并命名為乙烯形成酶, 后來證實, ACO需要抗壞血酸和氧作為輔助底物, 且需要 Fe2+和CO2作為輔助因子, 因此稱為ACC氧化酶[6]。基因最先從番茄中克隆出來[7], 在黃瓜[8]、桃[9]、蘋果[10-11]等多種物種中也已被克隆獲得, 且對其基因的表達也有一定研究。基因可受激素、外界環(huán)境脅迫和植物發(fā)育等刺激而誘導(dǎo)表達, 甜瓜基因的表達受乙烯誘導(dǎo)[12], 而黃瓜基因的表達則由IAA誘導(dǎo)[8]。外界刺激(如機械損傷)可誘導(dǎo)桃、番茄基因的表達[9,13]。

啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5￠端上游的DNA序列, 能夠活化RNA聚合酶, 使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性, 是基因準(zhǔn)確和有效轉(zhuǎn)錄所必需的結(jié)構(gòu)[14]。近年來, 對基因啟動子的研究取得了很大進展, 已在甜瓜[15]、番茄[16]、桃[17]等物種中克隆到基因啟動子并對其功能進行了分析。毛娟等[18]發(fā)現(xiàn)甜瓜啟動子能調(diào)控基因在轉(zhuǎn)基因甜瓜花藥和成熟果實果皮中表達, 在根、莖、葉、幼果中不表達, 而在轉(zhuǎn)基因煙草花瓣、花托、花梗、柱頭以及3 d苗齡的幼苗中明顯表達, 在其他組織都不表達[15]。桃基因啟動子導(dǎo)入番茄, 在葉片、子房、葉和果實中均有表達, 且受到丙烯和機械損傷正調(diào)節(jié)[17]。

桑樹()是一種經(jīng)濟價值較高的木本植物, 不僅作為家蠶的飼料被大面積種植, 而且能結(jié)果, 生產(chǎn)桑椹。桑樹適應(yīng)很多逆境脅迫, 如寒冷、水淹、干旱以及鹽堿環(huán)境[19]。本課題組在前期工作中, 從桑樹中克隆了2個參與桑樹乙烯生物合成的基因, 并對其功能初步分析, 證實其在桑椹發(fā)育中扮演著重要的角色[20-21]。為進一步探究基因在桑樹生長發(fā)育和抵御外界脅迫中的作用模式, 本文對川?；虻膯幼有蛄羞M行克隆以及生物信息學(xué)分析, 構(gòu)建pMnACO:GUS的植物表達載體, 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥, 對陽性轉(zhuǎn)基因植株進行非生物脅迫處理及GUS組織化學(xué)分析, 旨在探究桑樹基因啟動子在逆境中的作用, 為改良桑樹品種奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(, 哥倫比亞型)、桑樹品種川桑(Scheneid), 及大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達載體pCAMBIA1301均由本實驗室保存。

1.2基因啟動子搜索與PCR擴增

將川桑(Morus004820)和(Morus014137)基因CDS序列與川?；蚪M比對, 查找其所在位置, 并通過川桑基因組數(shù)據(jù)庫(http:// morus.swu.edu.cn/morusdb)調(diào)取CDS區(qū)域上游約1500 bp的序列, 設(shè)計PCR擴增引物(表1), 以川?；蚪MDNA為模板進行PCR擴增, 反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性45 s, 51℃退火45 s, 72℃延伸60 s, 35個循環(huán); 結(jié)束后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 篩選陽性單克隆并送南京華大科技公司測序。以plantcare (http://bioinforMntics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)在線網(wǎng)站分析測序正確的啟動子序列中的功能元件, 利用BDGP (eukaryotic sequencey, http://www.fruitfly.org/)預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點。

1.3基因啟動子表達載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)克隆用到的啟動子引物序列, 分別加上酶切位點R I和I (TaKaRa)作為新的克隆引物, 分別以1.2中測序正確的、基因啟動子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的菌液為擴增模板, 擴增程序為94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性45 s, 58℃退火45 s, 72℃延伸60 s, 35個循環(huán); 結(jié)束后72℃延伸10 min。分別用R I和I雙酶切擴增產(chǎn)物和植物表達載體pCAMBIA1301, 回收啟動子片段和表達載體片段, 將這些啟動子片段替換pCAMBIA1301載體上啟動基因表達的CaMV35S啟動子, 與基因融合構(gòu)建植物表達載體并雙酶切鑒定, 鑒定正確的重組表達載體被命名為pMnACO1::GUS和pMnACO2::GUS。以構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101, 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥[22-23], 同時以pCAMBIA1301載體轉(zhuǎn)化擬南芥作為陽性對照。

1.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的分子檢測

T0代種子分別經(jīng)75%酒精清洗1~2 min, 無菌ddH2O清洗3次, 0.1% HgCl2清洗2 min, 無菌ddH2O清洗3次, 點播于含有20 mg L–1潮霉素和1%瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上, 于室溫25℃光照培養(yǎng), 觀察其生長情況。2周后, 將生長正常的擬南芥轉(zhuǎn)移至滅菌土中。分別以轉(zhuǎn)化植物表達載體pCAMBIA1301質(zhì)粒的擬南芥和野生型擬南芥作陽性和陰性對照, 采用2×CTAB法[24](略有改動), 提取T1代植株基因組DNA, 利用1.2中引物和擴增程序, 篩選陽性植株。設(shè)計pCAMBIA1301載體中LB序列的2對反向的巢式引物(表1), 用反向PCR[24]技術(shù)檢測其插入位點。

1.5 GUS組織化學(xué)染色及活性分析

將PCR驗證正確及確定插入位點的單拷貝T2代種子按1.4中方法消毒播種, 1周后轉(zhuǎn)移至鋪消毒脫脂棉和濾紙的培養(yǎng)皿中, 生長至2周時, 分別用0.3 mol L–1NaCl、100 μmol L–1ABA、500 μmol L–1SA處理擬南芥, 用鑷子夾傷葉片模擬機械損傷, 并設(shè)置陰性和陽性對照。于處理后的3、12和24 h對整個植株進行GUS染色[23], 利用體式顯微鏡觀察和照相。參考雷建峰等[25]的方法測定GUS活性, 取每種處理的GUS染液上清液, 以現(xiàn)配制的GUS染液為對照, 在其最大光吸收波長620 nm處測定其光吸收值, 測定3次, 并用SPSS分析顯著性差異。另在擬南芥播種后的1、2、4周和花序軸開始生長期, 以及成熟期進行GUS組織化學(xué)染色分析, 觀察其不同生長階段GUS的表達活性。

1.6 脅迫處理對桑幼苗基因表達的影響

1.6.1 桑幼苗脅迫處理 以桂優(yōu)62為試驗材料, 播種于鋪消毒脫脂棉和濾紙的培養(yǎng)皿中, 2周后的幼苗分別經(jīng)NaCl、損傷、ABA和SA處理, 于3、12和24 h取樣, 以未處理的桑幼苗為對照, 按照北京全式金公司TransZol Plant RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA。分別取適量體積RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度。以總RNA為模板, 參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV說明書合成cDNA第1鏈, 存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 實時熒光定量PCR分析 以基因全長設(shè)計定量PCR引物[20](表1), 對脅迫后桑幼苗中和基因進行qRT-PCR分析。定量PCR試劑為SYBR Premix ExII (TaKaRa), 反應(yīng)體系為Premix ExII (2×) 10 μL, 10 μmol L–1上下游引物各0.8 μL, 50×ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL, cDNA 2 μL和DEPC水6 μL。參照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex試劑盒操作說明書進行Real-time PCR分析, 熱啟動程序為95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 共40個循環(huán), 對每個樣品設(shè)3次重復(fù)取其平均值, 并以(HQ163775.1)[26]作為內(nèi)參基因。用2–ΔΔCT法計算基因的相對表達量, 以SPSS分析顯著性差異。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1基因啟動子的克隆與序列分析

通過PCR擴增獲得和基因啟動子序列, 它們分別為1518 bp和1429 bp (圖1)。通過對啟動子序列分析(圖2和圖3), 發(fā)現(xiàn)和啟動子區(qū)域有較多的功能元件, 預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點分別在起始密碼子上游–101 bp處和–106 bp處。在啟動子區(qū)域含有大量的TATA-box和CAAT-box, 這些都是啟動子發(fā)揮作用的重要元件。此外, 兩者都含有響應(yīng)外界環(huán)境刺激的TC-rich repeats 和響應(yīng)赤霉素的GARE-motif, 含有響應(yīng)外界熱刺激的元件,為MBS, 而為HSE。含有響應(yīng)植物激素的AuxRE元件,含有響應(yīng)水楊酸的TCA-element元件。

A:啟動子序列; 1:啟動子序列1518 bp: 2:啟動子序列1429 bp; M: Trans 5000; B: pMnACO::GUS重組表達載體雙酶切; 1:pMnACO1::GUS; 2: pMnACO2::GUS; M: Trans 5000。

A: promoter sequences of; 1: promoter of, 1518 bp; 2: promoter of, 1429 bp; M: Trans 5000; B: enzyme digestion of recombinant plasmid pMnACO::GUS; 1: pMnACO1::GUS; 2: pMnACO2::GUS; M: Trans 5000.

方框內(nèi)為TATA-box; 陰影部分為CAAT-box; ↓處為轉(zhuǎn)錄起始位點; 其余元件均用下畫線標(biāo)出。

The boxes showed TATA-box; the shadows showed CAAT-box; ↓ is transcription start site; other elements were underlined.

方框內(nèi)為TATA-box; 陰影部分為CAAT-box; ↓處為轉(zhuǎn)錄起始位點; 其余元件均用下畫線標(biāo)出。

The boxes showed TATA-box; the shadows showed CAAT-box; ↓ is transcription start site; other elements were underlined.

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測

將轉(zhuǎn)化的T0代植株種子消毒后播于含20 mg L–1潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上, 大部分能正常萌發(fā), 但根系不能正常生長, 一段時間后植株無法繼續(xù)生長而死亡。經(jīng)過初步篩選, 獲得能正常生長的4株(編號1-1至1-4) pMnACO1::GUS和10株(編號2-1至2-10) pMnACO2::GUS以及2株轉(zhuǎn)pCAMBIA1301載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。提取擬南芥基因組并通過PCR檢測(圖4和圖5), 分別進一步確定了2株(編號為1-3, 1-4)和4株(編號為2-4, 2-5, 2-9, 2-10)陽性轉(zhuǎn)基因植株。反向PCR分析發(fā)現(xiàn), 在編號為2-9的擬南芥中檢測到2個插入位點, 其余株系中均只有1個插入位點。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性檢測

轉(zhuǎn)基因擬南芥不同生長階段GUS表達部位及表達活性不同。pMnACO1::GUS植株生長發(fā)育的各時期均能檢測到GUS活性(圖6-A), 且較pMnACO2:: GUS植株高。生長1周和2周的pMnACO2::GUS植株, 根尖中GUS活性較葉片高, 生長至4周時, 在根尖和蓮座葉片中均沒有檢測到明顯GUS活性, 僅蓮座葉叢的中心有少量GUS活性(圖6-B)。在pMnACO1::GUS植株的花瓣、花藥、花絲以及柱頭中有較高GUS活性, 花柱和花序軸中的活性較低; pMnACO2::GUS植株的花瓣、花藥、花絲、柱頭和莖生葉中, 能檢測到GUS活性, 但花柱和花序軸中無GUS活性(圖7-A)。pMnACO1::GUS果柄以及果莢中有少量GUS活性, 但pMnACO2::GUS的果莢和果柄中無GUS活性(圖8-B)。

泳道1~4分別表示編號為1-1至1-4的轉(zhuǎn)基因株系, 泳道5~6表示轉(zhuǎn)pCAMBIA1301的轉(zhuǎn)基因珠系, 泳道7表示野生型擬南芥, M: Trans 5000。

Lanes 1–4: the transgenic plants from number 1-1 to 1-4, Lanes 5–6: the pCAMBIA1301 transgenic plant, Lane 7: the wild type, M: Trans 5000.

泳道1~10分別表示編號為2-1至2-10的轉(zhuǎn)基因株系, 泳道11和泳道12表示轉(zhuǎn)pCAMBIA1301的轉(zhuǎn)基因珠系, 泳道13表示野生型擬南芥, M: Trans 5000。

Lanes 1–10: the transgenic plants from number 2-1 to 2-10, Lanes 11 and 12: the pCAMBIA1301 transgenic plant, Lane 13: the wild type, M: Trans 5000.

a: 幼苗生長1周; b: 幼苗生長2周; c: 幼苗生長4周; d: 幼苗花序軸開始生長。a, b的比例尺為1 mm; c, d的比例尺為1 cm。

a: one-week-old seedling; b: two-week-old seedling; c: four-week-old seedling; d: inflorescence start growing. Bars = 1 mm in a and b, Bars = 1 cm in c and d.

2.4 脅迫處理對啟動子活性的影響

對單拷貝的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥進行不同脅迫處理, 組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn), 陰性和陽性對照植株在處理前后均沒有顏色改變,和啟動子對不同脅迫呈現(xiàn)不同的響應(yīng)模式, 且啟動子在經(jīng)脅迫處理后GUS活性變化更明顯(圖8)。pMnACO1::GUS植株在經(jīng)過300 mol L–1的NaCl處理后, 染色較其他處理深, 且隨處理時間的延長而加深, 而對ABA的響應(yīng)與NaCl相反, 在處理3 h后染色最深, 且隨處理時間延長而變淺。經(jīng)過損傷處理和SA處理3 h后的擬南芥染色比對照深, 隨后顏色變化不明顯。結(jié)合對每種處理GUS染色上清液光吸收值的測定發(fā)現(xiàn), 總體而言, 轉(zhuǎn)pMnACO1::GUS擬南芥植株中的GUS活性隨處理時間延長而減弱, 而轉(zhuǎn)pMnACO2::GUS擬南芥植株中的GUS活性隨處理時間延長而增加(圖10)。經(jīng)NaCl處理后, 吸光值顯著上升, 24 h最高。經(jīng)ABA處理3 h后, 吸光值達到最高, 隨后吸光值下降并保持平穩(wěn)。植株經(jīng)損傷處理和SA處理后, 吸光值的變化與GUS染色情況有差異, 經(jīng)損傷處理12 h后, 吸光值顯著上升, 隨后下降。SA處理植株的前12 h, 吸光值無顯著性差異, 處理后24 h, 吸光值顯著上升。

a: 成熟期擬南芥整株中GUS活性檢測; b, c: 花GUS活性檢測; d: 果莢GUS活性檢測; a比例尺為1 cm; b~d比例尺為1 mm。

a: GUS activities in the whole adult plant; b, c: GUS activities in the inflorescence and flowers; d: GUS activities in the siliques; bars = 1 cm in a, bars = 1 mm in b–d.

比例尺為2 mm。Bars = 2 mm.

比例尺為2 mm。Bars = 2 mm.

*為差異性顯著(<0.05)。* indicates significant difference (<0.05).

啟動子經(jīng)處理后其活性提高, 在根和葉片都有不同程度的表達(圖9)。pMnACO2::GUS植株葉片經(jīng)損傷12 h染色明顯, 經(jīng)NaCl、ABA和SA處理24 h, 葉片出現(xiàn)藍色。GUS染色上清液光吸收值隨NaCl處理時間的延長不斷上升, 損傷處理后,吸光值隨時間先升高再降低, 12 h吸光值最高, 而經(jīng)過ABA處理后吸光值在3 h急劇上升, 隨后緩慢上升, 經(jīng)SA處理3 h和12 h時的吸光值下降, 在24 h驟然升高。

2.5 桑幼苗中基因在逆境脅迫下的表達

為探究基因啟動子與該基因表達之間的關(guān)系, 采用qRT-PCR檢測2周苗齡的桑幼苗在經(jīng)過脅迫處理后和的基因表達量。基因的表達模式與啟動子GUS染液吸收值變化趨勢一致(圖10和圖11), NaCl處理上調(diào)了基因的表達, 3 h基因的表達量顯著上調(diào), 然后繼續(xù)上調(diào); 損傷處理上調(diào)基因的表達, 12 h時表達量最高, 但是變化幅度較小; ABA處理3 h,表達量迅速上調(diào), 隨后表達量下降; SA處理后,表達量在24 h顯著上升?；虻谋磉_也被NaCl上調(diào);基因表達量經(jīng)ABA處理3 h顯著上升, 隨后上升趨勢緩慢; SA處理桑幼苗3 h和12 h,基因表達量都下降, 但在處理24 h升高。

*為差異性顯著(<0.05)。* indicates significant difference (<0.05).

3 討論

根據(jù)啟動子在植物生長發(fā)育中的作用和功能, 通常將其分為組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異型啟動子以及雙向和可變啟動子, 一種類型的啟動子同時兼具其他類型啟動子的特性[27]。和基因及啟動子在不同條件誘導(dǎo)后, 其表達水平都被上調(diào), 由此可以證明,為誘導(dǎo)型啟動子。同時,啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥生長發(fā)育的各時期和各組織中均能驅(qū)動GUS基因表達,2只驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖和花中的表達, 因此,具有組成型啟動子特性,啟動子具有組織特異型啟動子特性。和啟動子含有大量TATA- box、CAAT-box以及1個GARE-motif元件, 其最大的差異在于啟動子含有1個響應(yīng)外界環(huán)境刺激的TC-rich repeats (圖2),卻含有7個TC-rich repeats (圖3), 這很可能是造成pMnACO1:: GUS和pMnACO2::GUS轉(zhuǎn)基因植株中GUS活性隨處理時間延長而出現(xiàn)差異的原因之一。

基因的表達受多種環(huán)境因子的影響。損傷誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量乙烯[28]; ABA通常會下調(diào)基因的表達[29-30], 但在甜菜種子萌發(fā)[31]和番茄果實成熟[32]的過程中,基因的表達受ABA上調(diào); SA主要是通過抑制ACC合酶(ACS, 1-Aminocyclopro-pane-1-carboxylate synthase)的轉(zhuǎn)錄及其活性[33], 或抑制ACO活性[34], 或通過抑制組織中LOX活性來降低O2?速率[35], 從而抑制ACC向乙烯的轉(zhuǎn)化, 也有報道稱低濃度SA可以促使乙烯的生物合成[36]。桑樹基因及啟動子的表達都能被NaCl、ABA處理上調(diào), SA處理24 h以及損傷葉片也能一定程度上調(diào)其啟動子和基因的表達, 且對脅迫響應(yīng)能力更強, 由此說明, 桑樹在逆境脅迫時,啟動子可能啟動相關(guān)的應(yīng)答機制, 進而調(diào)控基因的表達, 且啟動子發(fā)揮更重要的作用, 預(yù)示著可將其用來調(diào)控改良桑樹品種抗逆性靶基因, 進而提高桑樹的抗逆性, 充分發(fā)揮其經(jīng)濟價值。

植物中基因是一個多基因家族, 其家族中的不同成員在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平、器官表達特異性、時空表達方面均存在差異。甜瓜基因的轉(zhuǎn)錄水平高于家族中的其他成員[37], 獼猴桃基因在花柱組織中的表達量高于內(nèi)果皮[38], 白三葉草基因家族中的不同基因可在不同器官組織中表達[39]。本實驗發(fā)現(xiàn),啟動子的表達在各方面也存在差異,啟動子能驅(qū)動GUS在擬南芥的根、葉片、花瓣、花藥、花絲、柱頭以及果莢中表達, 且活性較強,啟動子具組織特異性, 不能驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因果莢中表達。先前研究也表明[20],和基因在桑椹中的表達同其他組織相差無幾或更低, 由此推測,與果實成熟有關(guān), 為將其啟動子作為果實特異性啟動子對桑椹品質(zhì)改良提供有利證據(jù)。本實驗僅將和基因啟動子全長轉(zhuǎn)化擬南芥, 對其功能進行初步分析, 關(guān)于和基因啟動子結(jié)構(gòu)差異及其在組織中的表達差異還有待進一步誘導(dǎo)處理和啟動子缺失實驗的驗證。

4 結(jié)論

桑樹中和基因的啟動子能夠驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達。啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、葉片、花瓣、花藥、花絲、柱頭以及果莢中均有表達, 且啟動活性較強。脅迫處理能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥中啟動子活性增強,為誘導(dǎo)型啟動子。在轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用, 且對脅迫響應(yīng)能力更強, 預(yù)示著可將其用來調(diào)控改良桑樹品種抗逆性靶基因?？赡芘c果實成熟有關(guān), 可將其啟動子作為果實特異性啟動子對桑椹品質(zhì)進行合理改良。

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Functional Analysis of 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate Oxidase Gene’s Promoter in Mulberry

YU Jian, LIU Chang-Ying, ZHAO Ai-Chun, WANG Chuan-Hong, CAI Yu-Xiang, and YU Mao-De*

College of Biotechnology, Southwest University / Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China

1-Aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) as a key enzyme catalyzes the reaction from 1-Aminocy-clopropane- 1-carboxylate (ACC) to ethylene. In order to explore the function ofin mulberry growth and development and resisting external stresses, we constructedpMnACO::GUS fusion and transformed it into, and used GUS histochemical staining to identify GUS activities of transgenictreated by different stresses in different growth stagesandpromoter fragments obtained by PCR were 1518 bp and 1429 bp, respectively. There were lots of cis-acting elements such as TATA-box, CAAT-box and others responded to external stimuli.promoter could drive GUS to express in;promoter could induce GUS expressed in the root, leaf, flower petal, anther, filament, stigma and silique ofand their activities were higher thanthose of; while,promoter could not drive GUS expression in silique.The pMnACO1::GUS and pMnACO2::GUS transgenetic plantshad different activities in different treatments. The GUS activities of thepMnACO1::GUS transgenetic plants were weakened, while those of the pMnACO2::GUS transgenetic plantswere strengthened with the elongation of stress treatment time. Detection ofexpression in stress treatment of 2-week-old seedlings by qRT-PCR, indicated that the trends of expression pattern ofand itsGUS activity changes were almost the same. This research indicated thatis inducible promoter,1 has the characteristic of constitutive promoter, and2 has the characteristic of tissue-specific promoter.had more ability to respond to stresses in the transgenic plant, indicating it can be used to regulate the target gene of improving mulberry stress resistance.might be relevant to fruit maturation, thus its promoter could be used as fruit-specific promoter to improve the quality of mulberry fruit.

Mulberry; Ethylene; ACO; Promoter; GUS; Functional Analysis

本研究由國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201403064), 重慶市研究生科研創(chuàng)新項目(CYS2015070)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-22)資助。

This study was supported by China Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201403064), Graduate Research and Innovation Projects of Chongqing (CYS2015070), and the China Agriculture Research System (CARS-22).

(收稿日期): 2016-07-25; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-02-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.00839

(Corresponding author): 余茂德, E-mail: yumd@163.com, Tel: 023-68250191

E-mail: yujian1949@163.com, Tel: 13251385318

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1020.028.html