芫花素對模式生物秀麗隱桿線蟲的毒性作用

許 云，阮秦莉，紀蕾蕾，嵇 晶，吳晨曦，王 夢

（南京中醫(yī)藥大學1.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，2.藥物安全性評價研究中心，江蘇南京 210023）

芫花素對模式生物秀麗隱桿線蟲的毒性作用

許 云1，2，阮秦莉1，2，紀蕾蕾2，嵇 晶2，吳晨曦2，王 夢2

（南京中醫(yī)藥大學1.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，2.藥物安全性評價研究中心，江蘇南京 210023）

目的應用模式生物秀麗隱桿線蟲研究中藥芫花的主要成分之一芫花素的毒性作用及機制。方法分別以芫花素0.1，1，10和100 μmol·L-1處理野生型或轉基因型秀麗隱桿線蟲（簡稱線蟲）24，48和72 h，顯微鏡下觀察野生型線蟲頭部擺動次數、身體彎曲次數、存活天數、后代數目、平均排泄循環(huán)長度和咽泵行為，并觀察轉基因型線蟲γ-氨基丁酸（GABA）能神經元熒光強度，計數神經元數目。結果①野生型線蟲：與正常對照組比較，芫花素處理24 h后，芫花素1～100 μmol·L-1組線蟲頭部擺動和身體彎曲次數顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；48 h后，芫花素0.1 μmol·L-1組身體彎曲次數顯著減少（P＜0.05），1～100 μmol·L-1組頭部擺動和身體彎曲次數顯著減少（P＜0.01），100 μmol·L-1組平均排泄循環(huán)長度顯著增加（P＜0.05）且咽泵行為顯著減少（P＜0.01）；72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組頭部擺動和身體彎曲次數均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），平均排泄循環(huán)長度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），咽泵行為顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。②轉基因型線蟲：與正常對照組比較，芫花素處理24 h后，芫花素1～100 μmol·L-1組轉基因型線蟲GABA能神經元熒光強度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；48 h后，芫花素1～100 μmol·L-1組GABA能神經元熒光強度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）且VD神經元數目顯著減少（P＜0.01）；72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組GABA能神經元熒光強度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），1～100 μmol·L-1組AVL神經元數目顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），10和100 μmol·L-1組VD神經元數目顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。結論芫花素對秀麗隱桿線蟲具有一定的毒性作用，主要表現為運動行為抑制，其毒性機制可能與GABA能神經元損傷有關。

秀麗隱桿線蟲；芫花素；毒性

芫花（Daphne genkwaSieb.et Zucc.）屬瑞香科植物，味苦、辛，性溫，有毒，為傳統(tǒng)的瀉下逐水藥?，F代醫(yī)學研究認為，芫花能夠用于中晚期妊娠引產和抗早孕，同時具有鎮(zhèn)咳祛痰的作用［1］，可用于慢性支氣管炎。但是，芫花在臨床上使用時產生多種不良反應，患者口服芫花制劑可出現輕度頭痛、頭暈及四肢酸痛等神經系統(tǒng)癥狀；出現口干、惡心嘔吐、胃部灼燒感、腹痛腹瀉等胃腸道癥狀；用于引產時，多數孕婦在用藥后除出現胃腸道不適及頭痛心悸等癥狀外，還會產生體溫升高和白細胞數升高的不良反應。本實驗室前期通過高效液相法發(fā)現芫花水提物中主要包含芫花素（genkwanin）、木犀草素和芹菜素等，曾應用秀麗隱桿線蟲（Caenorhab?ditis elegans，C.elegans）對芫花水提物的毒性進行了初步研究。結果顯示，芫花水提物對線蟲運動行為具有抑制作用［2］。芫花素是芫花中一個主要的黃酮類成分，也是芫花主要功效成分，它可刺激腸黏膜引起劇烈的腹痛水瀉，可引起子宮收縮，還具有鎮(zhèn)咳祛痰等作用。芫花素在芫花中的含量也常作為評價芫花質量的主要指標之一，有文獻報道，其在芫花水提物中含量可達0.11%［3］。由芫花分離化學成分時，在分離得到的23個化合物中芫花素得率最高，約占總質量的80%［4］。鑒于藥物的主要有效成分有時也會是其主要毒效成分，為了深入了解芫花毒性作用的物質基礎，本文研究了其主要成分芫花素的毒性作用及機制。

C.elegans是目前應用廣泛的替代模式動物，具有繁殖周期短、后代繁多、通體半透明、結構簡單等特點，易于在實驗室中培養(yǎng)和觀察。C.elegans的神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)結構簡單而完善，與人類具有高度同源性，在毒理學研究中具有極大優(yōu)勢，被廣泛應用于化合物毒性評價和機制研究［5-6］。本研究應用C.elegans觀察芫花素對其運動行為、壽命、生殖、排泄行為和咽泵行為的影響，并通過觀察分析γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神經元的損傷，探討芫花素毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 秀麗隱桿線蟲的來源與培養(yǎng)

野生型秀麗隱桿線蟲（N2）和轉基因型秀麗隱桿線蟲{EG1285〔unc-47∶∶綠色熒光（GFP）〕}（以下簡稱野生型線蟲和轉基因型線蟲）均來源于美國秀麗隱桿線蟲遺傳中心。所有線蟲培養(yǎng)于含有大腸桿菌OP50的線蟲生長介質瓊脂培養(yǎng)基上，20℃恒溫培養(yǎng)［7］。按照Donkin等［8］的方法同步化，獲得大量L4期線蟲，本研究中所有實驗均使用L4期線蟲進行藥物處理。

1.2 藥品、主要試劑與儀器

芫花素標準品，購于江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，純度94.2%。胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取物、多聚蛋白胨和瓊脂糖均購于英國OXOID公司。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購于美國Sigma公司。正置熒光顯微鏡（Axio ScopeA1），德國蔡司；連續(xù)變倍體視顯微鏡（XTZ-E），上海光學儀器六廠。

1.3 實驗分組及藥物處理

在表面涂布有OP50的直徑30 mm的瓊脂培養(yǎng)基上，分別加入含芫花素0.1，1，10和100 μmol·L-1的溶液200 μL或等體積溶劑，使其均勻分布于培養(yǎng)基表面，并晾干。將野生型和轉基因型線蟲隨機分組，分別移入經不同藥物處理過的培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48或72 h。壽命實驗中每組50條線蟲，其余實驗中每組10條。

1.4 野生型線蟲頭部擺動行為觀察

野生型線蟲經芫花素0.1，1，10和100 μmol·L-1分別處理24，48或72 h后，轉移至滴有M9緩沖液的單凹載玻片上，待其恢復1 min后，于體視顯微鏡下記錄其在30 s內頭部擺動次數。線蟲頭部擺動行為定義為頭部擺動方向改變，且改變角度大于90度［9-10］。

1.5 野生型線蟲身體彎曲行為觀察

野生型線蟲藥物處理同1.4。處理后的線蟲轉移至不含OP50的瓊脂培養(yǎng)基上，待其恢復1 min后，于體視顯微鏡下記錄其在30 s內身體彎曲次數。一次成功的彎曲定義為以身體形成的S型中軸線為軸，向前行進一個正弦波形的過程［9-10］。

1.6 野生型線蟲壽命觀察

在經芫花素0.1，1，10和100 μmol·L-1處理后的培養(yǎng)基中分別加入5-Fu 12.5 mg·L-1以抑制線蟲子代的孵化，同時不影響成蟲壽命［11］。以此培養(yǎng)基處理野生型線蟲72 h，從處理當天（實驗第0天）開始，每天記錄線蟲的死亡數目和丟失數目，并計算存活率。存活率（%）=〔（線蟲總數-死亡數目-丟失數目）/（線蟲總數-丟失數目）〕×100%。線蟲存活率減少至50%時的天數即為中位生存期；最后一條線蟲死亡時的天數即為最長壽命。用鉑絲輕觸蟲體，無任何反應即為死亡［2］；線蟲出現囊樣變化或爬出培養(yǎng)皿即為丟失。本實驗中，各組線蟲丟失數目均為0。

1.7 野生型線蟲繁殖力觀察

每個培養(yǎng)皿中喂飼1條野生型線蟲，藥物處理同1.6。從藥物處理開始，每天記錄每只線蟲的產卵數，并將線蟲移至新的培養(yǎng)基中繼續(xù)飼養(yǎng)，直至線蟲喪失繁殖力。將每天產卵數目相加便得到該線蟲的總子代數目［12］。

1.8 野生型線蟲排泄行為觀察

野生型線蟲藥物處理同1.4，藥物處理后觀察記錄線蟲排泄循環(huán)長度。一個排泄循環(huán)長度定義為2次尾部肌肉收縮的間隔時間，每條線蟲觀察3個循環(huán)，取平均值［12-13］。

1.9 野生型線蟲咽泵行為觀察

野生型線蟲藥物處理同1.4。藥物處理后，采用數碼顯微系統(tǒng)，于500倍放大鏡頭下拍攝30 s線蟲咽泵運動的視頻，然后0.5倍慢速播放，計數30 s內咽泵運動次數，每段視頻計數3次，取平均值［12-13］。

1.10 轉基因型線蟲GABA能神經結構觀察

線蟲的表皮透明，在熒光顯微鏡下，轉基因型線蟲EG1285（unc-47∶∶GFP）可見以GFP形式存在的GABA能神經元。轉基因型線蟲藥物處理同1.4，藥物處理后，將線蟲轉移至滴加了50 μL疊氮化鈉（500 mmol·L-1）的瓊脂糖薄層上，待線蟲死亡后輕輕蓋上蓋玻片，使用熒光顯微鏡拍照，與線蟲神經結構模式圖比對后確認特定神經元位置，然后使用Image pro plus 6.0軟件分析各組線蟲GABA能神經元平均熒光強度，并計數每條線蟲特定神經元數目［13］。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行實驗結果數據分析，壽命實驗中存活率數據采用時序檢測（log-rank test），以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異；其余數據均用x±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），在方差齊時兩組間比較采用LSD檢驗，在方差不齊時兩組間比較采用Dunnettt檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 芫花素對野生型線蟲頭部擺動行為的影響

與正常對照組比較，經芫花素處理24和48 h后，芫花素1～100 μmol·L-1組線蟲頭部擺動次數顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲頭部擺動次數均顯著減少（P＜0.01）（圖1）。

Fig.1 Effect of genkwanin on times of head thrashes in wild-type Caenorhabditis elegans（C.elegans）.Wild-type C.elegans were treated with genkwanin 0.1，1，10 and 100 μmol·L-1for 24，48 and 72 h，respectively.The times of head thrashes were counted for 30 s under a stereomicroscope.，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.2 芫花素對野生型線蟲身體彎曲行為的影響

與正常對照組比較，線蟲經芫花素處理24 h后，芫花素1～100 μmol·L-1組線蟲身體彎曲次數顯著減少（P＜0.01）；48和72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲身體彎曲次數均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）（圖2）。

2.3 芫花素對野生型線蟲存活率與中位生存期的影響

野生型線蟲經芫花素處理72 h后，正常對照組線蟲最長壽命為25 d，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲存活率均為100%。與正常對照組比較，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲存活率和中位生存期均無顯著差異（圖3）。

Fig.2 Effect of genkwanin on times of body bends in wild-type C.elegans.See Fig.1 for the C.elegans treat?ment.The number of body bends was counted for 30 s.n= 10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the control group.

Fig.3 Effect of genkwanin on lifespan of wild-type C.elegans.C.elegans were treated with genkwanin 0.1，1，10 and 100 μmol·L-1for 72 h.n=50.

2.4 芫花素對野生型線蟲子代數目的影響

與正常對照組比較，野生型線蟲經芫花素處理72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲子代數目均無顯著差異（圖4）。

2.5 芫花素對野生型線蟲排泄循環(huán)長度的影響

與正常對照組比較，經芫花素處理24 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲平均排泄循環(huán)長度均無顯著差異；48 h后，芫花素100 μmol·L-1組平均排泄循環(huán)長度顯著延長（P＜0.05）；72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組平均排泄循環(huán)長度均顯著延長（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

Fig.4 Effect of genkwanin on brood size of wild-type C.elegans.See Fig.3 for the C.elegans treatment.n=10.

Fig.5 Effect of genkwanin on defecation cycle length of wild-type C.elegans.See Fig.1 for the C.elegans treat?ment.n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.6 芫花素對野生型線蟲咽泵運動次數的影響

與正常對照組比較，芫花素處理24 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲咽泵運動次數無顯著差異；48 h后，芫花素100 μmol·L-1組咽泵運動次數顯著減少（P＜0.01）；72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組咽泵運動次數均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）（圖6）。

2.7 芫花素對轉基因型線蟲GABA能神經元熒光強度的影響

與正常對照組比較，芫花素處理24 h和48 h后，芫花素1～100 μmol·L-1組線蟲神經元熒光強度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組神經元熒光強度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖7）。提示芫花素對線蟲GABA能神經元具有損傷作用。

Fig.6 Effect of genkwanin on times of pumpings in wild-type C.elegans.See Fig.1 for the C.elegans treatment.s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the control group.

Fig.7 Effect of genkwanin on fluorescent intensity of GABAergic neurons in transgenic C.elegans.See Fig.1 for the C.elegans treatment.n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the control group.

2.8 芫花素對轉基因線蟲GABA能神經元數目的影響

如圖8所示，芫花素處理72 h后，每組隨機取1條轉基因型線蟲在不同照明系統(tǒng)下成像，可見各濃度芫花素組線蟲GABA神經元均出現不同程度缺失，圖中紅色箭頭代表該位置神經元缺失。

神經元計數結果顯示（表1），與正常對照組比較，芫花素處理24 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲各類GABA能神經元數目均無顯著性差異；48和72 h后，芫花素0.1～100 μmol·L-1組線蟲DD、RME、RIS和DVB神經元數目無顯著性差異（數據略）。與正常對照組比較，芫花素處理48 h后，芫花素100 μmol·L-1組VD神經元數目顯著減少（P＜0.01）；72 h后，芫花素10和100 μmol·L-1組VD神經元數目顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），芫花素1～100 μmol·L-1組AVL神經元數目顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.8 Morphology of GABAergic neurons in transgenic C.elegans.C.elegans were treated with genkwanin 0.1,1,10 and 100 μmol·L-1for 72 h.After being executed and sealed,C.elegans were photographed with a fluorescence microscope under bright-field(column A)and fluorescent-field(column B)illumination system,respectively.Photos of column C were the merge of A and B. Photos of each line were taken from the same C.elegan of each group.The red arrows indicate the main positions of neuronal loss and abnormality.

Tab.1 Effect of genkwanin on number of GABAergic neurons in transgenic C.elegans

3 討論

本研究結果顯示，芫花素處理能明顯影響野生型線蟲的行為學指標。隨芫花素處理濃度和時間的增加，線蟲頭部擺動和身體彎曲次數均顯著減少；排泄周期延長；咽泵運動次數減少。本實驗室前期發(fā)現芫花水提物對野生型線蟲繁殖力具有抑制作用［2］，而本研究中，芫花素0.1～100 μmol·L-1處理72 h對野生型線蟲子代數目無顯著影響，故其生殖毒性作用物質基礎有待探討。野生型線蟲的運動、排泄以及咽泵行為主要受神經系統(tǒng)控制，結果提示芫花素可能對線蟲神經系統(tǒng)起抑制作用。

神經系統(tǒng)是機體在結構和功能上最為復雜的系統(tǒng)之一，由于該系統(tǒng)自身的特點，神經毒性表現往往呈現為全身效應。線蟲具有神經元結構簡單，基因功能與哺乳動物同源，并具有與哺乳動物類似的神經遞質（如GABA、乙酰膽堿、多巴胺、5-羥色胺、谷氨酸和神經肽等）的特點，因而在研究神經毒理學方面具有極大優(yōu)勢。一條雌雄同體的成蟲有959個體細胞和302個神經元，且每一根神經的走向都清晰明確，其半透明的身體為觀察細胞的變化和蟲體中熒光標記蛋白的表達提供了便捷的研究手段［15-16］。

GABA是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中最重要的抑制性神經遞質，約50%的中樞神經突觸部位以GABA為遞質［17］。而線蟲體內GABA能神經元的結構與功能均已進行了深入系統(tǒng)的研究，已具有綠色熒光蛋白標記GABA 26個神經元的轉基因型線蟲EG1285（unc-47∶∶GFP），熒光顯微鏡下可以清晰觀察到神經元的數量和結構。線蟲中26個GABA神經元主要分為6大類，其中13個VD神經元、6個DD神經元、1個AVL神經元、1個DVB神經元和4個RME神經元，它們都屬于運動神經元，直接和肌肉連接并支配其運動；還有1個RIS神經元屬于中間神經元［14，18］。運動神經元中，VD和DD末梢分別延伸入線蟲背部和腹部的肌肉中，抑制肌肉收縮，調控線蟲運動；本研究中，線蟲經過芫花素處理后VD神經元出現缺失，導致GABA釋放下降，不正常的肌肉收縮可能是引起線蟲身體彎曲次數下降的主要原因。AVL和DVB神經元末梢延伸到線蟲腸部肌肉，促進腸部肌肉興奮，使腸道肌肉收縮，從而調控線蟲的排泄行為；本研究中線蟲經過芫花素處理后AVL神經元出現缺失，這可能是線蟲排泄行為受到抑制的主要原因［19-21］。根據文獻［22-23］，正常對照組亦會出現少數神經元缺失情況，但不影響整體實驗結果。

綜上，本研究表明，芫花素對線蟲具有一定的毒性作用，主要表現為運動行為抑制，其機制可能與損傷GABA能神經元有關，該結果將為中藥芫花的毒性物質基礎研究以及芫花素進一步的哺乳動物毒性研究提供依據。

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Toxic effect of genkwanin on model organism Caenorhabditis elegans

XU Yun1,2,RUAN Qin-li1,2,JI Lei-lei2,JI Jing2,WU Chen-xi2,WANG Meng2

(1.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, 2.Center for Drug Safety Evaluation and Research,Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023,China)

OBJECTIVE To explore the toxicity and mechanisms of genkwanin,one of the main components ofFlos Genkwa,using the model organismCaenorhabditis elegans(C.elegans)assay system.METHODSBoth wild-type and transgenic strains ofC.eleganswere treated with genkwanin 0.1,1,10 and 100 μmol·L-1for 24,48 and 72 h,respectively.The head thrashes,body bends,lifespan,brood size,mean defecation cycle length and pumping behavior of the wild-typeC.elegansas well as the fluo?rescence intensity and the number of GABAergic neurons of the transgenicC.eleganswere observed under microscopes.RESULTS① Wild-typeC.elegans：Compared with the normal control group,after treatment with genkwanin for 24 h,the times of head thrashes and body bends ofC.elegansshowed significant decreases(P＜0.05,P＜0.01)in genkwanin 1-100 μmol·L-1groups.After treatment with genk?wanin for 48 h,the times of body bends showed a significant decrease(P＜0.05)in genkwanin 0.1 μmol·L-1group,the times of head thrashes and body bends showed a significant decrease(P＜0.01)in genkwanin 1-100 μmol·L-1groups,but a significant increase of mean defecation cycle length(P＜0.05)and a decrease of pumping behavior(P＜0.01)were observed in genkwanin 100 μmol·L-1groups.After treat?ment with genkwanin for 72 h,a decrease in the times of head thrashes and body bends(P＜0.05,P＜0.01),an increase of mean defecation cycle length(P＜0.05,P＜0.01),and a decrease of pumping behavior (P＜0.05,P＜0.01)inC.eleganswere observed in genkwanin 0.1-100 μmol·L-1groups.②TransgenicC.elegans：Compared with the normal control,after treatment with genkwanin for 24 h,the fluores?cence intensity of GABAergic neurons of the transgenicC.elegansshowed significant decreases(P＜0.05,P＜0.01)in genkwanin 1-100 μmol·L-1groups.After treatment with genkwanin for 48 h,the fluores?cence intensity of GABAergic neurons(P＜0.05,P＜0.01)and the number of VD neurons(P＜0.01)showed significant decreases in genkwanin 1-100 μmol·L-1groups.After treatment with genkwanin for 72 h,thefluorescence intensity of GABAergic neurons(P＜0.05,P＜0.01)decreased in genkwanin 0.1-100 μmol·L-1groups,so did the number of AVL(P＜0.05,P＜0.01)and VD neurons(P＜0.05,P＜0.01)in genkwanin 1-100 μmol·L-1and 10-100 μmol·L-1groups,respectively.CONCLUSIONGenkwanin has certain toxicity inC.elegansmainly by inhibiting the locomotion behaviors.The underlying mechanism may be related to the impairment of GABAergic neurons.

Caenorhabditis elegans;genkwanin;toxicity

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81202981);and Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization(ZDXM-2-7)

WANG Meng,E-mail:w-m65@163.com，Tel:(025)85811244-808

R285.1

：A

：1000-3002-（2017）05-414-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.05.006

2016-05-12 接受日期：2017-05-02）

（本文編輯：趙 楠）

國家自然科學基金（81202981）；江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心開放課題（ZDXM-2-7）

許 云，女，碩士研究生，從事藥物毒理學研究。

王 夢，E-mail：w-m65@163.com，Tel：（025）85811244-808