HBV-DNA及HBeAg陰性乙型肝炎病毒感染者乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP）檢測(cè)的臨床價(jià)值

楊忠臣 袁 軼 姜麗麗 張 舒

（齊齊哈爾市第二○三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

HBV-DNA及HBeAg陰性乙型肝炎病毒感染者乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP）檢測(cè)的臨床價(jià)值

楊忠臣 袁 軼 姜麗麗 張 舒

（齊齊哈爾市第二○三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

目的 對(duì)慢性乙型肝炎患者血清檢測(cè)乙型肝炎病毒的脫氧核糖核酸（HBV-DNA）及乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg），結(jié)果陰性的標(biāo)本進(jìn)一步檢測(cè)乙型肝炎病毒大蛋白（HVB-LP），用以判斷乙型肝炎病毒是否復(fù)制的臨床價(jià)值。方法 以302例慢性乙型肝炎患者為研究對(duì)象，50例健康體檢者做為對(duì)照組，采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血HBV-LP和乙型肝炎病毒標(biāo)志物（HBV-M），熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA。進(jìn)行HBV-DNA、HBV-LP和HBeAg的陽(yáng)性率差異性比較，比對(duì)HBV-DNA及HBeAg陰性患者檢測(cè)血清HBV-LP的陽(yáng)性率。結(jié)果 HBV-LP陽(yáng)性率為78.8%，較HBV-DNA、HBeAg均敏感。HBV-LP檢出率為78.8%高于HBV-DNA（70.8%）（χ2=0.4674，P＞0.05），二者無顯著性差異， HBV-LP和HBeAg檢出率（40.7%）比較（χ2=91.058，P＜0.01）二者差別有非常顯著意義；HBV-LP的HBeAg陰性患者陽(yáng)性率為69.3%，對(duì)比HBV-DNA陰性患者HBV-LP陽(yáng)性檢出率（11.27%）（χ2=62.43，P＜0.01）顯著高；有18例慢性乙型肝炎患者血清檢測(cè)HBV-DNA和HBeAg皆是是陰性的標(biāo)本中，檢出4例HBV-LP陽(yáng)性。結(jié)論 血清HBV-LP檢測(cè)是對(duì)HBV-DNA及HBeAg檢測(cè)的補(bǔ)充，HBV-LP是鑒別慢性乙型肝炎患者體內(nèi)病毒是否復(fù)制的敏感指標(biāo)，對(duì)提高監(jiān)測(cè)慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的病毒復(fù)制、觀察療效及判斷預(yù)后提供了進(jìn)一步的保障。

乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP）；乙型肝炎病毒DNA；乙型肝炎病毒標(biāo)志物（HBV-M）

中國(guó)是乙型肝炎病毒（HBV）感染性疾病的重災(zāi)區(qū)，約有1.2億人感染乙型肝炎病毒，約為1/3的全球感染者，其中乙型肝炎E抗原（HBeAg）陰性慢性肝炎平均占52%，約20%的慢性HBV感染患者中死于HBV感染相關(guān)的肝病[1]。治療慢性乙型肝炎患者臨床常用HBVDNA＜103拷貝/mL為陰性或HBeAg轉(zhuǎn)陰（產(chǎn)生E抗體）來判斷患者的HBV停止復(fù)制，而臨床檢測(cè)證實(shí)部分HBeAg陰性的患者體內(nèi)病毒仍然大量復(fù)制，并且HBV-DNA轉(zhuǎn)陰時(shí)也不能徹底排除HBV的復(fù)制[2-3]。乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP）是乙型肝炎病毒（HBV）上重要的傳染性顆粒（Dane顆粒）和亞病毒顆粒管的包膜蛋白，它是乙型肝炎病毒形式完整外膜的一個(gè)重要指標(biāo)，由HBsAg和前S蛋白（PreSl蛋白和PreS2蛋白）組成，HBV-LP的前S蛋白具有復(fù)雜跨膜構(gòu)象拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制過程起激活作用，并參與在細(xì)胞中的病毒顆粒的調(diào)節(jié)釋放，與病毒復(fù)制密切相關(guān)[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)302例慢性乙型肝炎患者血清進(jìn)行HBV-LP、HBV-DNA和HBV-M定量的檢測(cè)，探討HBV-LP的檢測(cè)在慢性乙型肝炎HBV-DNA和HBeAg陰性患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：選取2015年健康體檢者50例為對(duì)照組，排除病毒肝炎感染者，其中，男性28例，女22例，年齡分布在19～67歲。另外，選取2015年1月至2016年4月感染科住院及肝病專家門診就診慢性乙型肝炎患者302例為實(shí)驗(yàn)組，排除其他型肝炎病毒感染，以及非病毒引起的肝臟疾病等。其中，男性233例，女性69例；年齡7～76歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依照《慢性乙型肝炎防治指南（2014年版）》，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)的肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂。

1.2 試劑與儀器：①乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP）酶免定量檢測(cè)試劑由北京熱景鹽物技術(shù)有限公司生產(chǎn)（結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：CUTOFF=陰性對(duì)照OD均值Nc×2.1，陽(yáng)性對(duì)照OD值≥1.0，陰性對(duì)照OD值＜0.1，樣品OD值≥CUTPFF判為陽(yáng)性）；②HBV-DNA采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定試劑盒（深圳市匹基生物工程股份有限公司），結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)以HBV-DNA拷貝數(shù)＞103 copy/mL判斷為HBV-DNA陽(yáng)性；③HBeAg血清標(biāo)志物采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（英科新創(chuàng)廈門科技有限公司）；上述試驗(yàn)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。主要儀器為深圳RAYTO公司生產(chǎn)的RT-2100C型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩指標(biāo)間陽(yáng)性率的比較和相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組的50例健康體檢者血清HBV-M檢測(cè)結(jié)果：41.8%抗-HBs陽(yáng)性，其他項(xiàng)目皆陰性，HBV-DNA、HBV-LP陽(yáng)性檢測(cè)率為零。慢性乙型肝炎患者各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果HBV-LP陽(yáng)性率為78.8%，高于HBVDNA的檢出陽(yáng)性率76.5%，以及HBeAg的檢出陽(yáng)性率40.7%。HBV-LP檢出率為78.8%高于HBV-DNA（76.5%）（χ2=0.4674，P＞0.05）二者無顯著性差異，HBV-LP和HBeAg檢出率（40.7%）比較（χ2=91.058，P＜0.01）二者差別有非常顯著意義；HBV-LP的HBeAg陰性患者陽(yáng)性率為69.3%，對(duì)比HBV-DNA陰性患者HBV-LP陽(yáng)性檢出率（11.27%）（χ2=62.43，P＜0.01）顯著高。HBV-DNA和LHB-LP陽(yáng)性的標(biāo)本檢測(cè)值比較，LHB-LP的檢測(cè)值（OD值）與HBV-DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.86，P＜0.01，有18例慢性乙型肝炎患者血清檢測(cè)HBV-DNA和HBeAg皆是是陰性的標(biāo)本中，檢出4例HBV-LP陽(yáng)性。HBV-LP能夠反應(yīng)HBV的復(fù)制情況見表1。

表1 HBeAg、HBV-DNA、HBV-LP檢出率

2.2 HBV-DNA及HBeAg陰性樣本LHBs檢測(cè)結(jié)果：見表2。在179例HBeAg陰性血清中，LHBs的陽(yáng)性率為69.3%，在71例HBV-DNA陰性血清中LHBs的陽(yáng)性率11.27%。

表2 HBV-DNA及HBeAg陰性標(biāo)本中LHBs檢測(cè)結(jié)果[n（%）]

3 討 論

乙型肝炎病毒大蛋白是傳染性顆粒（Dane顆粒）和亞病毒顆粒的主要包膜成分，Dane顆粒的數(shù)目和亞病毒顆粒的數(shù)目與HBV的復(fù)制程度密切相關(guān)。HBV-LP在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集是導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因素，亞病毒顆粒能通過反式激活使病毒繼續(xù)復(fù)制。目前，在抗病毒治療慢性乙型肝炎患者時(shí)，能抑制乙型肝炎病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板（cccDNA）再?gòu)?fù)制，但乙型肝炎病毒表達(dá)蛋白活性不能及時(shí)抑制，在HBV-DNA數(shù)量＜103copy/mL的低水平時(shí)，HBV-LP仍能在血清中檢測(cè)到，證明患者體內(nèi)Dane顆粒和亞病毒顆粒依然存在，說明HBV的復(fù)制仍在繼續(xù)[7-11]。因此檢測(cè)HBV-LP對(duì)臨床上判定HBV復(fù)制具有一定的意義。

血清HBV-DNA檢測(cè)是評(píng)估的HBV復(fù)制可靠的指標(biāo)，可直接反映患者體內(nèi)乙型肝炎病毒的載量，是判定攜帶者和乙型肝炎患者有無傳染性重要依據(jù)，是目前判斷乙型肝炎病毒是否復(fù)制和抗病毒治療中評(píng)判藥物療效的良好指標(biāo)。但HBV-DNA檢測(cè)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室條件和儀器設(shè)備要求較高，操作復(fù)雜，并且擴(kuò)增產(chǎn)物極易受到污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，特別是基層醫(yī)院不能進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)，僅僅以HBeAg陽(yáng)性判斷HBV是否復(fù)制、以及傳染性的強(qiáng)弱，試驗(yàn)表明HBeAg陰性并不代表HBV復(fù)制能力減低，在乙型病毒肝炎治療中，可導(dǎo)致病毒基因前C區(qū)或者CP區(qū)發(fā)生突變，使HBeAg合成受阻，故HBeAg檢測(cè)陰性，不能除外病毒的復(fù)制[12]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，231例慢性乙型肝炎患者HBV-DNA陽(yáng)性乙型肝炎患者血清中，隨著HBV-DNA拷貝數(shù)的升高其血清LHB-LP的含量（OD值）呈上升趨勢(shì)，兩項(xiàng)檢測(cè)具有良好的相關(guān)性（r=0.86，P＜0.01），說明體內(nèi)HBV-LP與病毒復(fù)制程度密切相關(guān)，能準(zhǔn)確反映出患者體內(nèi)病毒的復(fù)制的情況，各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果HBV-LP陽(yáng)性率為78.8%，高于HBV-DNA的檢出率76.5%，以及HBeAg的檢出率40.7%。HBV-LP和HBV-DNA檢出率二者無顯著性差異，HBV-LP和HBeAg檢出率比較二者差別有非常顯著意義，HBV-LP的HBeAg陰性患者陽(yáng)性率為69.3%，對(duì)比HBV-DNA陰性患者HBV-LP陽(yáng)性檢出率（11.27%）（χ2=62.43，P＜0.01）顯著高，有8份HBV-DNA陰性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為而LHB-LP陽(yáng)性，因此，抗病毒治療即使HBVDNA轉(zhuǎn)陰，也不能表明HBV已清除，如果此時(shí)盲目停止抗病毒治療，又何能使HBV死灰復(fù)燃病情復(fù)發(fā)，血清HBV-LP的檢測(cè)，可補(bǔ)充乙型肝炎患者抗病毒治療過程中HBV-DNA檢測(cè)在終止治療時(shí)機(jī)和療效觀察中的不足。有124份HBeAg陰性標(biāo)本LHB-LP檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，長(zhǎng)期抗病毒治結(jié)果療可致使病毒基因發(fā)生突變，可使HBeAg合成受阻，此時(shí)慢性乙型肝炎患者血清HBeAg檢測(cè)陰性也不能說明病毒停止復(fù)制，HBV-LP的檢測(cè)就可判斷患者體內(nèi)HBV的復(fù)制狀況，對(duì)病情監(jiān)測(cè)、觀察療效和判斷預(yù)后有很高的臨床價(jià)值。

總之，LHB-LP是HBV感染的一個(gè)新的標(biāo)志物，對(duì)慢性乙型肝炎患者特別是血清HBV-DNA及HBeAg陰性的乙型肝炎患者，檢測(cè)血清HBV-LP的是反映患者體內(nèi)病毒持續(xù)復(fù)制的敏感指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確的反映出乙型肝炎患者體內(nèi)病毒的感染情況，從適用和推廣的角度看，LHB-LP檢測(cè)由于易操作、成本低廉及易于推廣，因而更優(yōu)于HBVDNA的檢測(cè)?？勺鳛镠BV-DNA的替代及補(bǔ)充檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)提高血清學(xué)手段診斷HBV的水平有積極意義。

[1] Bruss V.Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid [J]. Virus Res,2004,106(8):199-209.

[2] 賈繼東.乙型肝炎e 抗原陰性慢性乙型肝炎的治療[J].中華肝臟病雜志,2005,13(7):539.

[3] Chang TT,Robeft GG,Robert M,et al.A comparison of Entecavir and Lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].N Engl J Med,2006,354(10):1001-1010.

[4] Lambert C,Mann S,Prange R,et al.Assessment of determinants effecting the dual topology of hepadnaviral large envelope proteins[J].J Gen Virol,2004,85(Pt 5):1221-1225.

[5] Hildt E,Saher G,Bruss V,et a1.The Hepatitis B Virus Large Surface Protein(HBV-LP)Is a Transcriptional Activator[J].J Virol,1996,225(1):235-239.

[6] Barrera A,Guerra B,Notvall L,et a1.Mapping of the hepatitis B virus Pre-S1 domain involved in receptor recognition[J].J Virol,2005, 79(15):9786-9798.

[7] Bang G,Kim KH,Guarnieri M,et a1.Effect of mutating the two cysteines required for HBe antigenicity on hepatitis B virus DNA replication and virion secretion[J].Virology,2005,332(1);216-224.

[8] Chua PK,Wang RY,Lin MH,et a1.Reduced secretion of virions and hepatitis B virus (HBV) surface antigen 0f a naturally occurring HBV variant correlates with the accumulation of the small S envelope protein in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus[J].J Virol,2005,79(21):13483-13496.

[9] Bruns M,Miska S,Chassot S,et a1.Enhancement of hepatitis B virus infection by noninfectious subvial panicles[J].J Virol,1998, 72(2):1462-1468.

[10] Foo NC,Ahn B,Ma X,et a1.Cellular vacuolization and apoptosis induced by hepatitis B Virus h,19e surface protein[J].Hematology, 2002,36(6):1400-1407.

[11] 毛遠(yuǎn)麗,李伯安,馬洪濱,等.乙肝患者外膜蛋白血清學(xué)檢測(cè)對(duì)于判定HBV-DNA復(fù)制的意義[J].中華檢驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2006,20(3):276-278.

[12] Hamasaki K,Nakata K,Nagayama Y,et a1.Changes in the prevalence of HBeAg-negative mutant hepatitis B virus during the course of chronic hepatitis B[J].Hepatology,1994,20(1 Pt 1):8-14.

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1671-8194（2017）10-0048-02