不同產(chǎn)地意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量測定及其抗補體活性研究

何媛媛，韓紅園，李二文，代一航，索亞然，林瑞超

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室，北京 100102)

不同產(chǎn)地意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量測定及其抗補體活性研究

何媛媛，韓紅園，李二文，代一航，索亞然，林瑞超*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室，北京 100102)

目的：測定不同產(chǎn)地意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量和其抗補體活性研究。方法：采用UPLC法，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；流動相為甲醇(A)- 0.4%甲酸(B)；洗脫程序(0～3 min, 5%～31% A； 3～10 min, 31%～37% A；10～12 min, 37%～40% A；12～30 min, 40%～40% A)，柱溫30℃；檢測波長366 nm。通過溶血試驗評價蘆丁和山奈酚的抗補體活性。結(jié)果：意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量分別在1.25-3.34 mg/g和2.86-6.05 mg/g范圍內(nèi)，且蘆丁和山奈酚均具有較好的抗補體活性。結(jié)論：意大利牛舌草中2種主要活性成分的含量同地區(qū)之間差異較小，不同地區(qū)之間存在差異，且這兩種成分均具有較好的抗補體活性。

意大利牛舌草；含量測定；蘆??；山奈酚；抗補體活性

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)為紫草科牛舌草屬多年生草本植物地上部分，維文名為高孜萬，主要分布于地中海和熱帶地區(qū)[1-2]，主要功效具有生濕生熱、調(diào)節(jié)異常黑膽質(zhì)、生濕補腦、祛寒補心、爽心悅志、潤燥消炎、止咳平喘等作用?，F(xiàn)代研究表明，意大利牛舌草具有抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗菌[7]等生物活性，臨床上主要用于治療干寒性或黑膽質(zhì)性疾病，如平性腦虛、心悸、抑郁癥、干性腦膜炎、高血壓、肺炎及結(jié)核疾病、寒性咳嗽、感冒、氣喘等[8]。意大利牛舌草中主要化學(xué)成分有黃酮類、脂肪酸類、三萜類和揮發(fā)油類，其中黃酮類含量較高[9]。各種藥效成分的含量和活性對其藥效具有顯著影響。目前，各個產(chǎn)地的意大利牛舌草活性成分的含量是否存在差別，以及其主要代表性化合物蘆丁和山奈酚的抗補體活性都沒有相關(guān)報道。因此，本實驗采用UPLC法對不同產(chǎn)地意大利牛舌草中的代表性化合物蘆丁和山奈酚進行含量測定，并對蘆丁和山奈酚進行抗補體活性研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RJ-LD-IIB型低速大容量多管離心機(無錫市瑞江分析儀器有限公司)；低溫高速離心機(Sigma公司)；EPOCH型酶標(biāo)儀(Bio Tek，美國)；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀(Waters公司)；BP 211D 型1 /10 萬電子天平(Sartorious 公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；KQ-500型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

豚鼠(體質(zhì)量250～300 g，北京華阜康生物科技股份有限公司)；無菌抗凝綿羊血(北京索萊寶科技有限公司，批號20160525)；抗SRBC抗體(溶血素,北京索萊寶科技有限公司，批號20160429)。

6批意大利牛舌草藥材(表1)購自新疆麥迪森維藥有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)林瑞超教授鑒定為紫草科牛舌草屬植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥全草。

蘆丁(批號PS160113-02)和山奈酚(批號PS0207-0020)對照品均購自成都普思生物科技有限公司;甲醇：色譜醇(Fisher公司，美國);其他均為分析純試劑;水為屈臣氏蒸餾水。

表1 實驗用意大利牛舌草藥材的來源

2 方法與結(jié)果

2.1 兩種成分的含量測定

2.1.1 液相色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫：30℃;流動相：甲醇(A)- 0.4%甲酸(B)。洗脫程序(0～3 min，5～31% A；3～10 min，31%～37% A；10～12 min，37%～40% A；12～30 min，40%～40% A);進樣量：2 μL；檢測波長366 nm。采用上述條件分別得到對照品和意大利牛舌草藥材的色譜圖，如圖1所示。樣品中蘆丁和山奈酚的保留時間分別為11.475 min和22.268 min，其色譜峰與相鄰色譜峰達到基線分離。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁和山奈酚對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中。然后加入適量甲醇制成蘆丁和山奈酚濃度分別為0.030 3 mg/mL和0.010 0 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粗粉(粉碎，過40目篩)，精密稱定1.000 0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加甲醇40 mL、25% HCl溶液10 mL，85℃回流提取1.5 h，過濾，定容于10 mL容量瓶中，搖勻，用0. 22 μm的微孔濾膜濾過，即得[10]。

圖1 蘆丁對照品(A)、山奈酚對照品(B)和意大利牛舌草樣品(C)UPLC圖注：1：蘆丁；2：山奈酚。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取蘆丁和山奈酚對照品溶液各100 μL，用甲醇倍比稀釋得到0、2、4、8、16、32倍稀釋的6份標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進樣2 μL，按上述色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸。得回歸方程蘆?。篩=1×107X+1 250(r=0.999 4)；山奈酚：Y=2×108X-2 125(r=0.999 8)。結(jié)果表明，蘆丁和山奈酚分別在0.947～15.2 μg/mL和0.313～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗

取同一意大利牛舌草樣品供試品溶液，連續(xù)進樣6次，進樣量均為2 μL。測定蘆丁和山奈酚的峰面積，計算蘆丁和山奈酚的RSD分別為 0.33%和0.34%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批意大利牛舌草供試品，分別在0、2、4、8、10、12、24 h進樣2 μL。分別根據(jù)峰面積考察樣品的穩(wěn)定性，計算得到蘆丁和山奈酚的RSD分別為0.76%和1.92%，結(jié)果表明供試品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批意大利牛舌草供試品6份，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別進樣2 μL測定。結(jié)果顯示，蘆丁和山奈酚的RSD分別為1.20%和1.74%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 定量限和檢測限試驗

取上述各對照品溶液，逐步稀釋進樣，直至S/N=3和S/N=10，此時的進樣量即分別為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。測定得蘆丁和山奈酚的檢測限分別為0. 32 ng和0.20 ng；定量限分別為1.05 ng和0.71 ng。

2.1.9 加樣回收率試驗

精密稱取同一批供試品6份，每份1.000 0 g，分別定量加入兩種對照品，測定樣品中相應(yīng)的化合物的含量，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.10 意大利牛舌草中兩種成分的含量測定

取購自不同產(chǎn)地6批意大利牛舌草藥材，每批3份，按上述方法測定其中蘆丁和山奈酚的含量，計算平均值，結(jié)果見表3。

2.2 補體經(jīng)典途徑的溶血活性(CH50)測定[11]

2.2.1 溶液配制

巴比妥緩沖鹽(BBS)，包含0.5 mol/L鎂(Mg2+)和0.15 mol/L鈣(Ca2+)。取溶血素適量，加入BBS,配制成為1∶1 000溶血素溶液。

表2 意大利牛舌草中兩種成分的加樣回收率測定結(jié)果

表3 6批意大利牛舌草藥材中兩種成分的含量

2.2.2 補體的效價測評定

取補體(豚鼠血清)0.1 mL，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS對倍稀釋成1∶10，1∶20，1∶40，1∶80,1∶160，1∶320，1∶640。取1∶1 000溶血素、各濃度補體及2% SRBC各0.1 mL溶于0.3 mL BBS中，混勻，37℃水浴溫育30 min后放入低溫高速離心機，在5 000 rpm、4℃條件下離心10 min。分別取每管上清0.2 mL于96孔板，在405 nm處測定吸光度。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mL 2% SRBC溶于0.5 mL三蒸水中)，選擇達到相似吸光度的最低補體溶液作為正常溶血所需要的臨界補體濃度。

2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定

取臨界濃度的補體分別與不同濃度的供試品混勻，加入適量的BBS、溶血素和2% SRBC。37℃水浴溫育30 min，離心后取上清液在405 nm處測定吸光度。實驗同時設(shè)置中藥對照組(將等量的供試品加入BBS緩沖液中，用于測定中藥本底A值)、補體組(取臨界質(zhì)量濃度的補體加入BBS緩沖鹽、2% SRBC，用于測定臨界質(zhì)量濃度補體所造成紅細胞溶血的A值)和全溶血組(將2% SRBC加入水中使之全溶血，用于觀察補體組是否達到或接近全溶血水平)。計算溶血抑制率。

溶血抑制率=1-(A中藥組-A中藥對照組)/A補體組

2.3 蘆丁和山奈酚抗補體活性測定結(jié)果

本實驗測定了蘆丁和山奈酚的體外抗補體活性，雖然均小于陽性藥肝素鈉(0.048 ± 0.012)mg/mL，但對經(jīng)典途徑的補體激活都有一定的抑制作用，結(jié)果見表4。

表4 蘆丁和山奈酚抗補體活性測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚UPLC含量的方法。通過方法學(xué)考察證明，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。采用該方法成功地測定了來自巴基斯坦、四川、新疆等地6批意大利牛舌草藥材中兩種成分的含量。

意大利牛舌草中兩種主要活性成分的含量同地區(qū)之間差異較小，不同地區(qū)之間存在差異，提示其質(zhì)量也可能存在差異。因此，為了更好的控制意大利牛舌草的質(zhì)量，需要進行不同產(chǎn)地的生存條件與活性成分含量以及藥效學(xué)的相關(guān)性研究。

本實驗對意大利牛舌草的2個黃酮類成分蘆丁和山奈酚進行了抗補體活性評價，發(fā)現(xiàn)蘆丁和山奈酚均具有較好的抗補體活性，且山奈酚的抗補體活性強于蘆丁，表明蘆丁和山奈酚是意大利牛舌草抗補體活性的主要藥效組分。

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Content Determination of Rutin and Kaempferol inAnchusaItalicaRetz.from Different Regions and Its Anti-complement Activity

HE Yuan-yuan, HAN Hong-yuan, LI Er-wen, DAI Yi-hang, SUO Ya-ran, LIN Rui-chao*

(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Quality Evaluation, School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Objective: To determine the content of rutin and kaempferol inAnchusaitalicaRetz. from different regions and its anti-complement activity. Methods: UPLC was used, and the analysis was performed on a ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)with methanol (A) - 0.4% formic acid solution (B) as the mobile phases with gradient elution (0-3 min, 5-31% A; 3-10 min, 31%-37% A; 10-12 min, 37%-40% A; 12-30 min, 40%-40% A). The column temperature was set at 30℃, and the UV detection wavelength was 366 nm. Anti-complement activity of rutin and kaempferol was evaluated by hemolysis test. Results: The contents of rutin and kaempferol in Anchusa italica Retz were in the range of 1.25-3.34 mg/g and 2.86-6.05 mg/g, respectively. Rutin and kaempferol had a good anti-complement activity. Conclusion: There is no significant difference in the contents of two components in Anchusa italica Retz from the same region, but has differences in different regions. The two components have a good anti-complement activity.

AnchusaitalicaRetz.; Content determination; Rutin; Kaempferol; Anti-complement activity

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項項目(No.201507004)

何媛媛(1990-)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2014級民族藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要研究方向：民族藥藥效與化學(xué)成分研究。

林瑞超*(1954-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥與民族藥的品質(zhì)評價研究。

2016-11-01

R284

A

1002-2406(2017)03-0020-04

修回日期：2016-11-30