生川烏片炮制過(guò)程中5-HMF含量隨炮制時(shí)間的變化規(guī)律研究

王蕾，張語(yǔ)凡，王鑫，彭詩(shī)濤，袁金鳳，張先靈，陳炯，李飛*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

生川烏片炮制過(guò)程中5-HMF含量隨炮制時(shí)間的變化規(guī)律研究

王蕾1，張語(yǔ)凡1，王鑫1，彭詩(shī)濤1，袁金鳳1，張先靈1，陳炯2，李飛1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

目的：考察生川烏片炮制過(guò)程中5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量隨炮制時(shí)間的變化規(guī)律。方法：按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)制川烏項(xiàng)下的蒸與煮法，分別制備不同炮制時(shí)間的制川烏片，采用HPLC法測(cè)定川烏各炮制品中5-HMF的含量。結(jié)果：生川烏片中5-HMF含量為4.45 μg/g；煮制品及蒸制品在6 h之內(nèi)，5-HMF的含量變化規(guī)律基本一致，均隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)呈非線性增加。在相同的時(shí)間點(diǎn)，蒸制品含量顯著高于煮制品。 結(jié)論：首次建立了HPLC法測(cè)定川烏中5-HMF含量的方法，該法穩(wěn)定、可靠；生川烏片在蒸、煮兩種加熱方式下5-HMF含量的變化規(guī)律與加熱時(shí)間有關(guān)，該結(jié)果對(duì)川烏飲片中5-HMF的檢測(cè)及其質(zhì)量控制提供參考。

生川烏片；炮制；HPLC；5-羥甲基糠醛

川烏為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx．)的干燥母根，味辛、苦，性熱，有大毒，歸心、肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛功效[1]。川烏中主要含有生物堿類及多糖類成分。在炮制過(guò)程中，川烏中的多糖可能發(fā)生糖苷鍵的水解和糖的脫水反應(yīng)，生成5-羥甲基糠醛(5-HMF)。目前，尚未見(jiàn)炮制對(duì)川烏中5-HMF影響的相關(guān)研究報(bào)道。因此，作者建立了川烏中5-HMF的含量測(cè)定方法，并對(duì)生川烏片及不同煮制時(shí)間和蒸制時(shí)間的制川烏片中5-HMF的含量進(jìn)行檢測(cè)，分析其含量隨煮制和蒸制時(shí)間的變化規(guī)律，為川烏飲片的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、四元泵，Agilent公司)；Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)； BS210S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司，Max 210 g，d=0.1 mg)；超聲波清洗器(SB22-12DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

川烏片(購(gòu)于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的母根)；5-羥甲基糠醛(批號(hào)MUST-15051212，成都賽思特生物科技有限公司，純度>98%)；甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品的制備

生川烏片:取生川烏片，凈制，備用。

煮制川烏片：參照2015版《中國(guó)藥典》制川烏項(xiàng)下煮法炮制。取生川烏片，用水浸泡約5 h達(dá)內(nèi)無(wú)干心，取出，加寬水分別沸水煮40 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，取出，干燥。

蒸制川烏片：參照2015版《中國(guó)藥典》制川烏項(xiàng)下蒸法炮制。取生川烏片，用水浸泡約5 h達(dá)內(nèi)無(wú)干心，取出加水分別蒸1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，取出，干燥。

觀察上述炮制品的外觀性狀，均達(dá)到內(nèi)無(wú)白心的質(zhì)量要求，但麻舌感程度不同，結(jié)果見(jiàn)表2。以上樣品分別粉碎，過(guò)3號(hào)篩，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品適量于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，即得含5-羥甲基糠醛662 μg/mL的對(duì)照品母液。精密吸取一定量母液，加甲醇定容配制成濃度為0.066 2，0.662，1.986，3.31，4.634，5.985，7.282 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取各炮制品粉末約1 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取20 min，放冷，再稱定重量，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液適量，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.4 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B。洗脫梯度：0～5 min，5%A；5～20 min，5%～20%A；20～21 min，20%～80%A；21～35 min，20%A。檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；柱溫25℃，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取5-HMF的系列濃度對(duì)照品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積y對(duì)濃度x進(jìn)行線性回歸。線性回歸方程為：y=74.906x+15.667(R2=0.999 6，n=7)，5-羥甲基糠醛在0.066 2～7.282 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為2.648 μg/mL的 5-HMF對(duì)照品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣10 μl，依法測(cè)定峰面積，測(cè)得5-HMF峰面積的RSD為0.74%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末1 g，平行共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，測(cè)得5-HMF峰面積的RSD為1.90%(n=6)。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末1 g，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，在制備后0，2，4，8，12 h分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到5-HMF的RSD為1.58%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末0.5 g，精密稱定，平行共6份， 加入一定量的5-HMF對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算5-羥甲基糠醛的平均回收率為98.58%，RSD為1.90%(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5-HMF加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品的含量測(cè)定

將川烏的各炮制品按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批次樣品平行操作2份，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，計(jì)算生川烏片及不同炮制時(shí)間的制川烏片中5-HMF含量。結(jié)果見(jiàn)表2，色譜圖見(jiàn)圖2，5-HMF含量隨煮制時(shí)間變化見(jiàn)圖3。

表2 川烏各樣品中5-HMF的含量(n=2)

圖2 5-HMF對(duì)照品、生川烏片、不同煮制、蒸制時(shí)間的制川烏片HPLC圖

圖3 5-HMF含量隨炮制時(shí)間的變化規(guī)律

3 討論

傳統(tǒng)直接以生川烏為原料浸泡達(dá)到同等程度約36 h[2]，本文采用生川烏片制備制川烏，其中浸泡至“內(nèi)無(wú)干心”的時(shí)間約5 h；川烏產(chǎn)地切片雖使其成分有流失，但在制備制川烏過(guò)程中可大幅度縮短浸泡時(shí)間，節(jié)約工時(shí)，并在一定程度上減少成分流失。

本文建立了川烏中5-HMF的HPLC含量測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為制川烏飲片的質(zhì)量控制的檢測(cè)方法。

5-HMF是炮制過(guò)程中糖類美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。結(jié)果表明，生川烏片炮制前后5-HMF的含量變化明顯，且含量高低與炮制時(shí)間和加熱方式有關(guān)。在6 h內(nèi)，蒸或煮川烏片中的5-HMF的含量變化規(guī)律基本一致，均隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而呈非線性增加。加熱1 h時(shí)，蒸或煮制川烏片中含量約為生品的5～6.3倍；加熱在2～4 h之間，含量波動(dòng)很小，煮制品的含量約為生品的10.9～11.7倍，蒸制品的含量約為生品的15.6～17.5倍；5～6 h，煮制品5-HMF含量急劇增加，約為生品的12.1～20.1倍；蒸制品含量則在4～5 h急劇增加，約為生品的34.4～41.3倍。同時(shí)，蒸制及煮制川烏片的顏色亦隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而加深，麻舌感逐漸減弱或消失。當(dāng)制川烏片的外觀顏色基本一致時(shí)，同一加熱方式下的炮制品中的5-HMF含量也基本一致。此外，蒸制6 h之后，5-HMF含量呈波動(dòng)變化，但無(wú)麻舌感，飲片片型皺縮，飲片顏色呈黑褐色，傳統(tǒng)性狀不符合《中國(guó)藥典》要求。比較相同加熱時(shí)間下的蒸制川烏和煮制川烏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒸制川烏片中5-HMF的含量均明顯高于煮制川烏片，可能與5-HMF易溶于水[3]，在煮制過(guò)程中大量流失在水煮液中有關(guān)。該研究結(jié)果可為制川烏片的炮制工藝及質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供借鑒。

體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-HMF對(duì)CCl4急性肝損傷組織有保護(hù)作用；亦對(duì)由H2O2和葡萄糖所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的細(xì)胞均具有保護(hù)作用[4]。同時(shí)，5-HMF具有抗氧化、抗心肌缺血等對(duì)人體有益的作用[5-6]，但亦有研究表明5-HMF對(duì)人體橫紋肌和內(nèi)臟有毒副作用[7]。因此，炮制過(guò)程中5-HMF的含量變化對(duì)制川烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有一定意義，但尚須進(jìn)一步研究，結(jié)合其藥理、毒理作用及其對(duì)制川烏的外觀性狀、生物堿含量的影響等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以保障制川烏的安全性、有效性。

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Changes of 5-hydroxymethylfurfuraldehyde Content in Radix Aconiti Tablets Processed at Different Time Points

WANG Lei1,ZHANG Yu-fan1,WANG Xin1,PENG Shi-tao1,YUAN Jin-feng1,

ZHANG Xian-ling1,CHEN Jiong2,LI Fei1*

(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China)

Objective: To find the changing regularity of 5-Hydroxymethylfurfuraldehyde (5-HMF) content in Radix Aconiti tablets processed at different time points.Methods: HPLC was used to determine the changes of 5-HMF content in different processed products of Radix Aconiti.Results: The content of 5-HMF of the raw product was 4.45 μg/g. The content of 5-HMF was increased within the first six hours of heating. At the same processing time, the content of steamed products was significantly higher than that of boiled products. Conclusion: An HPLC method for determining the content of 5-HMF has been established. The proposed method is stable and reliable. The changes of the content of 5-HMF of Radix Aconiti tablets are processed by steaming and boiling for two kinds, which were associated with the heating time. It provides a reference for the quality control of Radix Aconiti.

Radix Aconiti tablets; Processing; HPLC; 5-hydroxymethylfurfural

國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(No.201107008)；科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)資助項(xiàng)目(No.2014FY111100-3)

王蕾(1992-)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)在讀碩士研究生，主要研究方向：中藥炮制。

李飛*(1963-)，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥炮制工藝、原理及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。

2016-10-25

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0017-03

修回日期：2016-11-01