大腸癌組織與癌旁正常組織基因差異表達(dá)圖譜及信號(hào)通路研究

洪朝金 盧麗琴 郭勇 欽志泉

大腸癌組織與癌旁正常組織基因差異表達(dá)圖譜及信號(hào)通路研究

洪朝金 盧麗琴 郭勇 欽志泉

目的 篩查人大腸癌腫瘤組織與相應(yīng)癌旁正常組織差異表達(dá)基因。方法 應(yīng)用NimbleGen基因芯片檢測(cè)4例大腸癌腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常組織基因表達(dá)譜，并以RT-PCR技術(shù)對(duì)部分基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，利用生物信息學(xué)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 大腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織差異表達(dá)基因共5 042條，其中表達(dá)水平上調(diào)3 399條，下調(diào)1 643條，這些基因涉及多個(gè)信號(hào)通路。結(jié)論 本研究結(jié)果可為尋找大腸癌分子標(biāo)記物和探索大腸癌發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

大腸癌 基因芯片 基因表達(dá)譜 生物信息學(xué)

大腸癌是人類高發(fā)惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，患者趨于年輕化，因此，研究其發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。本研究采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)大腸癌腫瘤組織與癌旁正常組織的基因表達(dá)差異，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，探討大腸癌的發(fā)病機(jī)制,尋找大腸癌分子標(biāo)記物和探索大腸癌發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2011年8至10月在浙江省人民醫(yī)院手術(shù)治療的4例大腸癌患者的組織標(biāo)本。術(shù)前均經(jīng)腸鏡檢查明確診斷并經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)，均為中分化結(jié)腸腺癌，其中，48歲男性患者為乙狀結(jié)腸腺癌（pT4aN1M0/ⅢB期），62歲女性患者為乙狀結(jié)腸腺癌（pT3N2aM0/ⅢB期），62歲男性患者為乙狀結(jié)腸腺癌（pT3N0M0/ⅡA期），68歲女性患者為橫結(jié)腸腺癌（pT3N1M0/ⅢB期），診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司制定的《中國(guó)常見惡性腫瘤診治規(guī)范》（2011版），TNM臨床分期采用AJCC制定的標(biāo)準(zhǔn)（2007年版）。

1.2 主要儀器及試劑 微量紫外分光光度計(jì)（NanoDropRND-1000）；羅氏 NimbleGen芯片雜交系統(tǒng)（Roche NimbleGen Hybridization System）；美國(guó) ABI 9700型PCR基因擴(kuò)增儀（Geneamp PCR System 9700）；生物芯片掃描儀（GenePix 4000B）；Trizol試劑（英杰公司）；Invitrogen Superscript雙鏈cDNA合成試劑盒（英杰公司）；Nimblegen單色DNA標(biāo)記試劑盒（羅氏公司）；NimbleGen芯片雜交試劑盒（羅氏公司，批號(hào)：05223474001）；Nimblegen HX12 mixe（r羅氏公司，批號(hào)：05223768001）；Nimblegen洗滌緩沖試劑盒（羅氏公司，批號(hào)：05223504001）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 組織標(biāo)本采集 經(jīng)手術(shù)切取大腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣1cm以上，病理檢查顯示無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)），一部分用生理鹽水清洗后置于RNAlater中，放入凍存管中迅速投入液氮中保存，以備基因芯片研究；另一部分置于甲醛溶液中以做病理切片檢查。將4例中分化腺癌組織作為芯片檢測(cè)“腫瘤組”樣品池，各例相應(yīng)癌旁正常組織等比例混合組成1個(gè)“正常組”樣品池，重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)并利用RT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.2 RNA提取和質(zhì)量控制 采用Trizol方法抽提總RNA；NanoDropRND-1000測(cè)定RNA濃度和純度；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度及完整性。樣本質(zhì)量合格的判定標(biāo)準(zhǔn)為：吸光度（OD）A260與A280比值在1.95～2.05，電泳RNA的28S和18S條帶清晰，28S條帶亮度約是18S條帶的2倍。

1.3.3 熒光標(biāo)記 用NimbleGen單色DNA試劑盒標(biāo)記ds-cDNA。

1.3.4 雜交與清洗 將標(biāo)記好的樣品與雜交buffer（3× SSC，0.2%SDS，50×Denhart’s，25%甲酰胺）混勻后，注到已經(jīng)與相應(yīng)混合物黏合的芯片上，采用RocheNimble－Gen Hybridization System雜交儀42℃雜交16～20h。雜交結(jié)束后，去除混合物，分別用洗液I、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干，掃描。

1.3.5 芯片掃描、圖像采集分析 使用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀陣列掃描，Gene Pix proV6.0軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，并檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫基因銀行（GeneBank），獲得每條基因的名稱和其他基本信息。

1.3.6 RT-PCR驗(yàn)證部分基因芯片檢測(cè)結(jié)果 選擇甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，在基因芯片篩選的結(jié)果中，選擇4條差異表達(dá)基因TNFSF13、IFG1R、HSP90A、IL1R2為待測(cè)基因，通過GeneBank查詢待測(cè)基因及內(nèi)參基因的堿基序列，應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物或引物跨越外顯子，以保證擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)而無DNA干擾。經(jīng)局部序列比對(duì)基本檢索工具（BLAST）驗(yàn)證未見非目的基因擴(kuò)增，不形成二聚體，各基因引物見表1。

1.3.7 芯片數(shù)據(jù)分析 使用AgilentGeneSpringGXv11.5.1軟件進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。對(duì)芯片的歸一化強(qiáng)度（Normalized Intensity）、差異倍數(shù)（Fold-Change）進(jìn)行分析，取Normalized Intensity作t檢驗(yàn)，設(shè)定判斷差異基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為：Fold-Change＞2.0，P＜0.05為顯著表達(dá)差異基因。對(duì)顯著表達(dá)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢索數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Pathway）分析。

表1 各基因引物

2 結(jié)果

2.1 樣本組織總RNA純化及質(zhì)檢 腫瘤組織和癌旁正常組織的總RNA經(jīng)NanoDrop ND-1000核酸定量分析儀檢測(cè)，RNA的OD（A260/A280）均在2.0左右，說明提取的RNA純度較高，見表2。

表2 NanoDrop ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S和18S兩條帶清晰可見，且無拖尾現(xiàn)象，示完整性好，質(zhì)量合格，總量夠用，可用于芯片實(shí)驗(yàn)研究，見圖1。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖（編號(hào)1～4為大腸癌腫瘤組織標(biāo)本，5～8為大腸癌癌旁正常組織標(biāo)本）

2.2 芯片掃描結(jié)果及分析 得出大腸癌腫瘤組織組和癌旁正常組差異表達(dá)基因共5 042條，其中，表達(dá)水平上調(diào)3 399條，下調(diào)1 643條，這些基因在大腸癌腫瘤組織組與癌旁正常組織組的表達(dá)有明顯區(qū)別，見圖2。

圖2 大腸癌腫瘤組織組與癌旁正常組織組間差異基因的火山圖（水平線代表2.0倍,垂直線代表P值為0.05,圖中的紅點(diǎn)表示基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 與癌旁正常組織組相比較，大腸癌腫瘤組織組中TNFSF13、HSP90A、IL1R2基因表達(dá)上調(diào)，而IFG1R基因表達(dá)下調(diào)，提示與疾病相關(guān)基因在兩組大腸組織中的表達(dá)情況，與基因芯片的檢測(cè)結(jié)果基本吻合，驗(yàn)證了基因芯片部分表達(dá)結(jié)果可靠，見圖3-7。

圖3 RT-PCR GAPDH擴(kuò)增曲線（水平線代表循環(huán)數(shù)，垂直線代表熒光相對(duì)強(qiáng)度，據(jù)圖可以看出待測(cè)樣品的重復(fù)性較好，PCR擴(kuò)增效果較好，下同）

2.4 芯片信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果 Pathway分析結(jié)果如圖8、9。

圖4 RT-PCR TNFSF13擴(kuò)增曲線

圖5 RT-PCR IGF1R擴(kuò)增曲線

圖6 RT-PCR HSP90A擴(kuò)增曲線

圖7 RT-PCR IL1R2擴(kuò)增曲線

圖8 上調(diào)基因主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

圖9 下調(diào)基因主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

由圖8、9可見，在大腸癌腫瘤組織中，上調(diào)的3 399條差異基因主要涉及36個(gè)信號(hào)通路，其中最為富集的為DNA修復(fù)通路（DNA replication），有21條基因的表達(dá)發(fā)生變化；其次是細(xì)胞周期通路（Cell cycle）及嘌呤代謝通路（Purine metabolism），分別有38及41條基因的表達(dá)發(fā)生變化；其余變化顯著的依次為葉酸一碳庫(One carbon pool by folate）、類固醇生物合成（Steroid biosynthesis）、錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair）、嘧啶代（Pyrimidine metabolism）、p53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）、基底切除修復(fù)（Base excision repair）。下調(diào)的1 643條基因主要uscle contraction），有20條基因的表達(dá)發(fā)生變化；其次是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路（Complement and coagulation cascades）及焦黏附通路（Focal adhesion），分別有14及26條基因的表達(dá)發(fā)生變化；其余變化顯著的信號(hào)依次是百日咳（Pertussis）、腫瘤途徑（Pathways in cancer）、金黃色葡萄球菌感染途徑（Staphylococcus aureus infection）涉及45個(gè)信號(hào)通路，其中最為富集的為血管平滑肌收縮信號(hào)（Vascular smooth m）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、基底細(xì)胞（Basal cell carcinoma)、黑素生成癌（Melanogenesis）、Wnt信號(hào)通路（Wnt signaling pathway）等。

4 討論

癌癥差異表達(dá)基因一般是指通過比對(duì)癌組織與正常組織的基因表達(dá)狀態(tài)所獲得的 P＜0.05、Fold-Change＞2的基因[1]。基因芯片技術(shù)具有高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，是近年來在分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷技術(shù)領(lǐng)域中又一項(xiàng)創(chuàng)新研究手段，它綜合利用分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子技術(shù)、激光化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等眾多學(xué)科領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)，突破了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法只能對(duì)某一個(gè)或某幾個(gè)基因進(jìn)行研究的局限，可同時(shí)檢測(cè)數(shù)百乃至上萬個(gè)基因。

本研究利用基因芯片技術(shù)對(duì)來源于4例大腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果與癌旁正常組織相比較，在大腸癌腫瘤組織中差異表達(dá)基因5 042條，上調(diào)基因3 399條，下調(diào)基因1 643條。在差異表達(dá)基因中，部分癌基因呈持續(xù)激活的狀態(tài)。例如IGF1R，IGF1與IGF1R結(jié)合后，通過自身磷酸化，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，依次激活胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇3激酶、胰島素相關(guān)底物-I、Src-同源域／膠原蛋白酪氨酸等，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促增殖、抗凋亡的生物學(xué)效應(yīng)[2-3]。在多種腫瘤組織中可以檢測(cè)到IGF1R的表達(dá)，在大腸癌中IGF1R的表達(dá)與分期、分級(jí)有關(guān)[4]。阻斷IGF1R的傳導(dǎo)通路可能成為大腸癌治療的途徑之一[5]。TNFSF13是增殖誘導(dǎo)配體（APRIL），TNFSF13在正常組織有少量表達(dá)，而在多種腫瘤特別是消化道腫瘤（包括直腸、結(jié)腸、十二指腸、胃）中高表達(dá)，與TNFSF13具有促腫瘤細(xì)胞增殖的作用有關(guān)，TNFSF13可作為判斷5-FU療效及預(yù)后的血清學(xué)標(biāo)記物[6-8]。

Pathway是指蛋白間相互作用，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能的過程[9]。Pathway分析可以篩選出在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間具有顯著差異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前，Pathway主要來自KEGG公共數(shù)據(jù)庫，我們利用KEGG數(shù)據(jù)庫嘗試闡述大腸癌腫瘤組織與癌旁正常組織之間具有顯著差異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

本研究通路富集結(jié)果顯示，腫瘤組織中差異表達(dá)基因涉及多條與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的通路，如Cell cycle、DNA replication、Purine metabolism、Mismatch repair、p53 signaling pathway、MAPK signaling pathway及Wnt signaling pathway等。下面對(duì)主要通路分述如下：

Cell cycle上調(diào)38條主要差異表達(dá)基因：ANAPC1，BUB3，CCNB1，CCNB2，CCND1，CCND2，CCNE1，CDC20，CDC25A，CDC6，CDC7，CDK2，CDK6，CDK7，CHEK1，CHEK2，E2F1，E2F3，E2F4，E2F5，MAD2L1，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7，MYC，PCNA，PLK1，PRKDC，PTTG1，RBL1，SKP2，TFDP1，TP53，YWHAE，YWHAZ。Cell cycle受機(jī)體調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響而使細(xì)胞能正常增殖，但對(duì)于癌細(xì)胞，由于宿主失去對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，癌細(xì)胞能夠克服細(xì)胞周期，實(shí)現(xiàn)快速迭代和生長(zhǎng)，從而形成惡性腫瘤。

MAPK signaling pathway下調(diào)28條主要差異表達(dá)基因：CACNA1H，CACNA2D2，CD14，DUSP22，DUSP3，F(xiàn)GFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)LNA，F(xiàn)LNC，HSPA6，IL1R1，JUN，MAP2K5，MAP3K14，MAPK8IP2，MKNK1，NFKB2，PDGFB，PDGFRA，PPP3CB，PPP3CC，PRKACB，RAP1A，RPS6KA2，RPS6KA5，RRAS，SRF，TGFB3。MAPK signaling pathway是一個(gè)典型的在核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路。MAPK家族的信號(hào)通路主要包括4條，即ERK、JNK／SAPK、p38MAPK以及ERK5/BMK1。研究證實(shí)，MAPK信號(hào)通路激活后具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管生成加速的作用。新生血管可為腫瘤細(xì)胞提供更多的營(yíng)養(yǎng)支持，從而促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)，加快癌細(xì)胞擴(kuò)散速度[10-12]。

Wnt signaling pathway下調(diào)28條主要差異表達(dá)基因：CAMK2B，CAMK2G，DAAM2，DVL1，F(xiàn)ZD4，F(xiàn)ZD8，JUN，PLCB1，PPP2R5C，PPP3CB，PPP3CC，PRICKLE1，PR－KACB，ROCK1，TCF7L1，WNT2B，WNT5B，WNT6，GAS1，GLI1，GLI2，GLI3，PRKACB，WNT2B，WNT5B，WNT6。Wnt signaling pathway是一條十分保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路。目前認(rèn)為Wnt signaling pathway的組成主要包括:細(xì)胞外因子（Wnt）、跨膜受體（frizzled）、胞質(zhì)蛋白（β-catenin）及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（TCF）等一系列蛋白。當(dāng)細(xì)胞外因子與受體結(jié)合后，通過一系列胞質(zhì)蛋白的相互作用使β-catenin蛋白在胞質(zhì)內(nèi)累積進(jìn)而入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF共同作用激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt signaling pathway的下游靶基因多數(shù)是參與細(xì)胞增生與凋亡的基因，如cylinD1、c-myc等。越來越多的研究結(jié)果表明，Wnt signaling pathway與許多人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也具有密切關(guān)系[13]。

以上結(jié)果充分證明，大腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因及多通路參與的分子病理過程，只有對(duì)這些基因及信號(hào)通路功能以及它們之間的相互作用進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，才有可能全面闡明大腸癌的發(fā)病機(jī)制。本研究得到的差異表達(dá)基因圖譜中的若干重要基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)于今后的研究工作具有一定的指導(dǎo)和借鑒作用。

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Differentially expressed genes in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues

HONG Chaojin,LU Liqin,GUO Yong,et al.Department of Oncology,Zhejiang Province People′s Hospital,Hangzhou 310014,China

Colorectal cancer Gene chips Gene expression profiles Bioinformatics

2016-11-15）

（本文編輯：沈叔洪）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.9.2016-1908

浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研基金項(xiàng)目（2015ZYCB1）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（2007ZA007）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（洪朝金、盧麗琴、欽志泉）；浙江省中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（郭勇）

洪朝金，E-mail：hongcjhz@163.com

【 Abstract】 Objective To screen the differentially expressed genes in human colorectal cancer(CRC)tissue. Methods NimbleGen gene expression array information were used to detect the gene expressions of CRC tissue paired with normal colorectal tissue.The microarray findings were confirmed by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR).The results were analyzed by bioinformatic technique. Results Compared with normal tissues,a total of 5042genes with more than 2-fold differential expression were detected in CRC tissues,of which 3399 genes were up-regulated and1643 genes were down-regulated.These genes involved multiple signaling pathways. Conclusion The results may provide experimental basis to seek for molecular markers and to investigate the molecular mechanism of colorectal cancer.