棉酚對(duì)T2DM合并NAFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用

王家員 樊建霜 吳亮 黃卡特 王蓉蓉

●論 著

棉酚對(duì)T2DM合并NAFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用

王家員 樊建霜 吳亮 黃卡特 王蓉蓉

目的 探討棉酚對(duì)2型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）大鼠肝臟的保護(hù)作用。方法 將30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為棉酚組、T2DM組和正常組，每組10只。高脂高糖飲食喂養(yǎng)4周后腹腔注射小劑量（30mg/kg）鏈脲佐菌素構(gòu)建T2DM大鼠模型。棉酚組用棉酚混懸液灌胃12周，每次劑量為15mg/kg，前4周為1次/d，后8周為1次/周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、白蛋白（ALB）及透明質(zhì)酸（HA）水平；透射電鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)改變；經(jīng)HE染色、Masson膠原纖維染色后，在光鏡下分別觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變、纖維化病變；免疫組化染色檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、肝臟Ⅰ型11β類固醇脫氫酶（11β-HSD1）及糖皮質(zhì)激素受體（GR）蛋白表達(dá)；采用半定量RT-PCR法檢測(cè)肝組織葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、瘦素受體（Leptin R）、胰島素受體（Insulin R）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組相比，T2DM組血清ALT、AST、HA水平均明顯升高（均P＜0.05），ALB水平明顯降低（P＜0.01）；肝臟α-SMA、11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05）；肝組織Leptin R、Insulin R mRNA表達(dá)均明顯升高（均P＜0.01）；臨床病理學(xué)表現(xiàn)主要為肝細(xì)胞水腫、脂肪變性、氣球樣變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生，肝組織內(nèi)可見較多活化的肝星形細(xì)胞。與T2DM組相比，棉酚組血清ALT、AST、HA水平均明顯降低（均P＜0.05），ALB水平明顯升高（P＜0.05）；肝臟11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)均明顯降低（均P＜0.05）；肝組織G6Pase、PEPCK、Insulin R、Leptin R mRNA表達(dá)均明顯下降（均P＜0.01）；臨床病理學(xué)表現(xiàn)主要為肝細(xì)胞水腫、脂肪變性、氣球樣變及炎癥現(xiàn)象稍有減輕，肝內(nèi)纖維組織明顯減少，肝組織內(nèi)活化的肝星形細(xì)胞數(shù)量明顯減少。結(jié)論 低劑量棉酚可明顯減輕T2DM合并NAFLD大鼠纖維化病變，其機(jī)制可能與其抑制組織11β-HSD1、Leptin R、Insulin R mRNA表達(dá)有關(guān)。

棉酚 2型糖尿病 非酒精性脂肪性肝病 Ⅰ型11β類固醇脫氫酶 瘦素受體 胰島素受體

【 Abstract】 Objective To investigate the hepatoprotective effect of gossypol in type 2 diabetic (T2DM)rats complicated with non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD). Methods Thirty male Sprague-Dauley rats were divided randomly into normal control group,T2DM group and gossypol-treated group with 10 in each group.After being fed with high-fat feeding for 4 weeks, the latter two groups were injected with strepozotocin(30mg/kg)intraperitoneally to induce T2DM.The rats in gossypol treated group were given gossypol at a dose of 15mg·kg-1·d-1for 4 weeks by gavage,then at a dose of 15mg·kg-1·d-1until the end of week 12.At the end of the experiment all animals were sacrificed,the concentration of serum ALT,AST,ALB and HA were measured.The ultrastructural changes of liver were observed by transmission electron microscopy(TEM),the pathologic changes and fibrosis of liver were observed by light microscopy(LM)with HE staining and Masson staining respectively.Additionally,the activated hepatic stellate cells(HSCs)and the protein expression of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1(11β-HSD1) and glucocorticoid receptors(GR)was assayed by immunohistochemistry(IHC),the mRNA expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK),glucose-6-phosphatase(G6Pase),insulin receptor and leptin receptor in liver tissue was assayed by semi-quantitative RT-PCR. Results The levels of serum ALT,AST,HA increased(P＜0.05),serum ALB decreased(P＜0.05),the 11β-HSD1 and GR protein expression increased(P＜0.05),the mRNA expression of insulin receptor,leptin receptor increased (P＜0.05)in liver tissue of T2DM group compared with normal control group.Clinical pathology showed obvious liver hydropicdegeneration,fatty degeneration,ballooning degeneration,inflammatory infiltration,fibrosis,a great number of activated HSCs in liver tissue of T2DM group.The levels of serum ALT,AST,HA decreased (P＜0.05),serum ALB increased (P＜0.01),the 11β-HSD1 and GR protein expression decreased(P＜0.05),the mRNA expression of PEPCK,G6Pase,insulin receptor and leptin receptor decreased (P＜0.05)in liver tissue of gossypol treated group compared with diabetic group.The hydropic degeneration,fatty degeneration,ballooning degeneration,inflammatory infiltration in liver tissue were improved slightly but the hepatic fibrosis was attenuated and the number of activated HSCs was reduced in gossypol treated group significantly compared with T2DM group. Conclusion Low dosage gossypol can attenuate fibrosis of NAFLD in diabetic rats.Down regulation of mRNA expression of 11β-HSD1,insulin receptor and leptin receptor may be involved in it.

【 Key words】 Gossypol Type 2 diabetes Nonalcoholic fatty liver disease 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 Leptin receptor Insulin receptor

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積為特征但無過量飲酒史的慢性肝臟疾病[1]。NAFLD包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及相關(guān)肝硬化、肝細(xì)胞癌[1]。在這一組由輕至重的疾病譜中，纖維化對(duì)疾病的發(fā)展起著關(guān)鍵的作用。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前較為公認(rèn)的觀點(diǎn)是胰島素抵抗導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂是其啟動(dòng)因子與中心事件。糖皮質(zhì)激素（GC）是潛在的胰島素拮抗劑，它對(duì)靶組織的作用依賴于局部組織Ⅰ型11β類固醇脫氫酶（11β－HSD1）調(diào)節(jié)的受體前代謝[2]。棉酚是從棉籽中提煉出來的一種黃色脂溶性多酚化合物，曾被證實(shí)是一種非常有效的男性避孕藥[3]。相關(guān)研究表明，棉酚能抑制大鼠睪丸11β－HSD1活性[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)棉酚可以降低2型糖尿?。═2DM）大鼠的血糖、血脂、血胰島素水平[5－6]，抑制大腦皮層與海馬組織內(nèi)11β－HSD1蛋白表達(dá)[6]。國(guó)外研究證實(shí)棉酚具有拮抗肺纖維化的功能[7]。目前關(guān)于棉酚對(duì)T2DM大鼠肝臟11β－HSD1的表達(dá)及肝臟形態(tài)、功能的影響，國(guó)內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。故本課題組構(gòu)建T2DM合并NAFLD大鼠模型，觀察棉酚對(duì)糖尿病大鼠肝臟形態(tài)與功能的影響，檢測(cè)肝組織α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA）、11β－HSD1、糖皮質(zhì)激素受體（GR）的蛋白表達(dá)，以及葡萄糖－6－磷酸酶（G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、瘦素受體（Leptin R）、胰島素受體（Insulin R）基因mRNA表達(dá)水平，探討棉酚對(duì)T2DM合并NAFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重140～180g [由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCXK（浙）2015－0004]；鏈脲佐菌素（廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；ALT、AST、白蛋白（ALB）、透明質(zhì)酸（HA）試劑盒（上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司）；鼠抗單克隆抗體α－SMA（北京中杉金橋生物試劑有限公司），兔抗多克隆抗體11β－HSD1（由美國(guó)洛克菲勒大學(xué)人口委員會(huì)葛仁山教授惠贈(zèng)），兔抗多克隆抗體GR（美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)有限公司），二抗（北京中杉金橋生物試劑有限公司）；Triol（美國(guó)Invitrogen公司），M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Promega公司），PCR試劑[大連寶生物（TaKaRa）公司]；所用引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模[8]將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為棉酚組、T2DM組和正常組，每組10只。棉酚組、T2DM組用高糖高脂飼料（飼料配方：10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料）喂養(yǎng)4周后，禁食12h，按照30mg/kg的劑量單次腹腔注射鏈脲佐菌素（溶于0.1mmol/L枸椽酸緩沖液內(nèi)，pH 4.0）；72h后檢測(cè)空腹血糖≥8mmol/L，即造模成功。正常組大鼠腹腔注射等容積枸櫞酸緩沖液。

1.2.2 藥物治療[8]將棉酚溶于2%羧甲基纖維素混合制成棉酚混懸液，棉酚組用棉酚混懸液灌胃12周，每次劑量為15mg/kg，前4周為1次/d，后8周為1次/周[5]。T2DM組、正常組用等容積2%羧甲基纖維素灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，T2DM組、棉酚組繼續(xù)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 血清檢測(cè) 股動(dòng)脈放血處死大鼠，采集血清10ml，2 200r/min離心10min，取上清液；使用日立7600大型生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、ALB水平，采用放免法檢測(cè)血清HA水平。

1.2.4 肝臟病理學(xué)檢查 （1）HE染色：取10mm×10mm× 2mm的新鮮肝臟組織1塊，置于10%中性甲醛溶液中固定6h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，用切片機(jī)制成厚度約3μm切片，行HE染色。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（× 200）進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分（NAS）[1]：①肝細(xì)胞脂肪變性＜5%為0分，5%～＜34%為1分，34%～66%為2分，＞66%為3分；②小葉內(nèi)炎癥（200倍鏡下壞死灶計(jì)數(shù)）無為0分，1個(gè)為1分，2～4個(gè)為2分，＞4個(gè)為3分；③肝細(xì)胞氣球樣變“無”為0分，“少見”為1分，“多見”為2分。（2）Masson膠原纖維染色：肝組織石蠟切片，脫蠟至水，蘇木素染色5min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，置于Masson液染色5min，水洗數(shù)次，置于亮綠液中染色1min，經(jīng)低濃度到高濃度梯度乙醇脫水，石碳酸－二甲苯中紅綠分化數(shù)秒，入二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果判斷：膠原纖維藍(lán)綠染，肝細(xì)胞胞質(zhì)紅染，肝細(xì)胞核紫色；光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)低倍鏡視野（×100）觀察膠原纖維的分布，按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝組織纖維化分期評(píng)分[1]：無纖維化為0分；肝小葉3區(qū)竇周或匯管區(qū)周圍纖維化為1分；肝小葉3區(qū)竇周合并匯管區(qū)周圍纖維化為2分；橋接纖維化為3分；高度可疑或確診肝硬化為4分。

1.2.5 肝臟超微結(jié)構(gòu)檢查 取新鮮肝組織1小塊，約1mm×1mm×1mm，立即置于2.5%戊二醛4℃固定1h；餓酸后固定，行常規(guī)PBS漂洗，丙酮梯度脫水；用Epon812包埋，半薄切片定位，用LKB－V型超薄切片機(jī)切片；行鉛鈾雙重染色，在H－600A型透射電鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化染色 根據(jù)Envision二步法進(jìn)行染色。將石蠟標(biāo)本切成厚度5μm切片，在60℃水浴箱內(nèi)展貼于防脫膠APES處理的載玻片上，常規(guī)脫蠟、脫水至蒸餾水；用3%過氧化氫甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min；將切片置于0.01mol檸檬酸緩沖液中（pH 7.2～7.4）高壓抗原修復(fù)10min；分別滴加一抗α－SMA（稀釋濃度1∶100）、11β－HSD1（稀釋濃度1∶300）、GR（稀釋濃度1∶160），置于4℃冰箱過夜；用0.01mol PBS（pH 7.2～7.4）漂洗數(shù)次，滴加二抗及HRP復(fù)合物，反應(yīng)20min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；以0.01mol PBS代替一抗作為陰性正常。結(jié)果判定：α－SMA、11β－HSD1定位于細(xì)胞質(zhì)，GR定位于細(xì)胞核，棕黃色為陽性表達(dá)；光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)低倍鏡視野（×100），按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估α－SMA蛋白表達(dá)[9]：無著色為無表達(dá)；＜10%為輕度表達(dá)；10%～25%為中度表達(dá)；＞25%～50%為重度表達(dá)；＞50%為極重度表達(dá)。應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算累積吸光度（OD），以評(píng)估11β－HSD1、GR蛋白表達(dá)。

1.2.7 半定量RT－PCR －80℃超低溫冰箱內(nèi)取出冷凍肝組織100mg，碾碎后加入1ml Triol，提取總RNA。應(yīng)用Beckman Coulter DU800紫外分光光度儀進(jìn)行RNA純度、濃度檢測(cè)。取2μg OD260/OD280比值1.8～2.0的RNA在M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶下合成cDNA。取1μl cDNA作為模板，在Taq DNA聚合酶催化下行目的基因G6Pase、PEPCK、Insulin R、Leptin R和內(nèi)參基因RPS16的PCR同管擴(kuò)增。PCR引物及反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5μg/ml Goldview染色劑），應(yīng)用Gel－pro31凝膠分析系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物條帶累積光密度，以各目的基因與內(nèi)參照基因的比值反映目的基因的相對(duì)mRNA水平。

表1PCR引物及反應(yīng)條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，3組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清肝功能指標(biāo)及HA水平比較 與正常組比較，T2DM組大鼠血清ALT、AST、HA水平均明顯升高，ALB水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與T2DM組比較，棉酚組大鼠血清ALT、AST、HA水平均明顯降低，ALB水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

2.2 3組大鼠肝臟病理學(xué)評(píng)分比較 正常組大鼠肝小葉以中央靜脈為中心，肝索呈放射狀整齊排列，肝血竇清晰可見；T2DM組大鼠肝索紊亂、肝血竇消失，肝細(xì)胞廣泛水腫伴部分氣球樣變、明顯脂肪變性，多灶區(qū)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、小膽管增生；棉酚組肝細(xì)胞水腫、氣球樣變、脂肪變性、肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸

潤(rùn)略有減輕，見圖1（插頁）。Masson膠原纖維染色：僅正常組見血管壁少許膠原纖維綠染；T2DM組見肝小葉3區(qū)竇周隙區(qū)域或氣球樣變、嚴(yán)重脂肪變性的肝細(xì)胞外周有“雞爪樣”的膠原纖維增生為主的NASH特征性的纖維化病變，嚴(yán)重者肝小葉3區(qū)膠原纖維與匯管區(qū)膠原纖維相互連接并形成橋接纖維化，甚至個(gè)別肝小葉內(nèi)纖維組織增生將其分割形成假小葉；棉酚組膠原纖維增生程度較T2DM組明顯減輕，兩組纖維化分期評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2（插頁）和表3。

圖1 3組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變（a.：正常組；b：T2DM組；c：棉酚組；HE染色，×200）

圖2 3組大鼠肝組織膠原纖維分布（a：正常組；b：T2DM組；c：棉酚組；Masson染色，×100）

表2 3組大鼠血清肝功能及HA水平比較

2.3 3組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)比較 正常組大鼠肝細(xì)胞核呈圓形、居中，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，未見脂滴，見圖3a（插頁）；T2DM組大鼠肝細(xì)胞核固縮、偏位，胞質(zhì)內(nèi)見大量脂滴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目減少，線粒體體積變小、數(shù)目減少、密度增高，狄氏竇膠原纖維增生，見圖3b（插頁）；棉酚組大鼠肝細(xì)胞核固縮減輕，胞質(zhì)內(nèi)脂滴略有減少，線粒體數(shù)目增多、密度降低，板狀嵴變清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與正常組相近，狄氏竇未見明顯膠原纖維增生，見圖3c（插頁）。

圖3 3組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)（a：正常組胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，透射電鏡，×6 000；B：T2DM組胞質(zhì)內(nèi)見脂滴（↑），狄氏竇示膠原纖維增生（←），透射電鏡，×12 000；C：棉酚組線粒體密度降低，板狀嵴較清晰，透射電鏡，×20 000）

表3 3組大鼠肝臟病理學(xué)評(píng)分比較

2.4 3組大鼠肝臟α-SMA、11β-HSD1、GR蛋白表達(dá)正常組肝星形細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，僅肝小葉中央靜脈、小葉間靜脈、小葉間動(dòng)脈血管壁的平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA，肝臟α-SMA蛋白表達(dá)水平為0；T2DM組肝組織內(nèi)可見局灶表達(dá)α-SMA的增生、活化的肝星形細(xì)胞，高倍鏡下星形細(xì)胞胞漿呈星狀或棱狀突起，主要分布于肝小葉3區(qū)竇周纖維組織增生區(qū)域及纖維組織增生的匯管區(qū)及其周圍，其分布與膠原纖維增生區(qū)域基本一致，其α-SMA蛋白表達(dá)水平為1.60±1.35，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；棉酚組肝組織內(nèi)陽性表達(dá)α-SMA的肝星形細(xì)胞明顯減少，部分肝組織未見表達(dá)α-SMA的肝星形細(xì)胞，其α-SMA蛋白表達(dá)水平為0.40±0.52，與T2DM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 3組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)（a：正常組；b：T2DM組；c：棉酚組；Invision法，×400）

正常組肝臟11β-HSD1呈弱陽性表達(dá)，其蛋白表達(dá)水平為4 316.57±1 330.35，主要在中央靜脈周圍區(qū)；T2DM組肝臟11β-HSD1蛋白表達(dá)水平為9 857.37±5 762.49，明顯高于正常組（P＜0.05）；棉酚組肝臟11β-HSD1蛋白表達(dá)水平為5 651.48±3 345.21，明顯低于T2DM組（P＜0.05），與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

正常組肝臟GR呈中等強(qiáng)度表達(dá)，其蛋白表達(dá)水平為3 319.11±1 462.39，多數(shù)肝細(xì)胞核呈棕黃色；T2DM組GR蛋白表達(dá)水平為8 922.95±2 324.85，明顯高于正常組（P＜0.05），肝細(xì)胞核略顯棕黑色；棉酚組GR蛋白表達(dá)水平為4 576.68±2 136.43，明顯低于T2DM組（P＜0.05），與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

2.5 3組大鼠肝組織G6Pase、PEPCK、Leptin R、Insulin R mRNA表達(dá) T2DM組肝組織Leptin R、Insulin R mRNA表達(dá)均明顯高于正常組（均P＜0.05）；G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)，但與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與T2DM組相比，棉酚組肝組織PEPCK、G6Pase、Insulin R、Leptin R mRNA表達(dá)均明顯下降（均P＜0.05），見表4和圖7（插頁）。

3 討論

NAFLD是T2DM的一種常見并發(fā)癥，其發(fā)病率高達(dá)50%[10]。多數(shù)患者僅表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的單純性脂肪肝，臨床預(yù)后良好；但仍有20%～30%的患者伴肝內(nèi)炎癥、纖維組織增生的NASH。NASH若不進(jìn)行早期干預(yù)治療，纖維組織持續(xù)增生，將發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化甚至肝功能衰竭[11]。因此，有效地治療糖尿病性NAFLD具有重要的臨床意義。

圖5 3組大鼠肝臟11β-HSD1蛋白表達(dá)（a：正常組；b：T2DM組；c：棉酚組；Invision法，×400）

圖6 3組大鼠肝臟GR蛋白表達(dá)（a：正常組；b：T2DM組；c：棉酚組；Invision法，×400）

表4 3組大鼠肝組織G6Pase、PEPCK、LeptinR、InsulinRmRNA表達(dá)

圖7 3組大鼠肝組織G6Pase、PEPCK、Leptin R、Insulin R mRNA的表達(dá)（M：100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；a：正常組b：T2DM組；c：棉酚組）

GC是潛在的胰島素拮抗劑，可在多個(gè)水平參與調(diào)節(jié)葡萄糖－胰島素之間的平衡，如抵抗胰島素的外周作用、抑制胰島素的釋放、促進(jìn)糖異生等[12]。11β－HSD1是GC的代謝酶，具有脫氫/氧化還原兩種活性，催化局部器官、組織內(nèi)無生物活性的GC可的松與有生物活性GC皮質(zhì)醇的相互轉(zhuǎn)換。在肝臟，11β－HSD1以還原酶活性為主，催化可的松轉(zhuǎn)換為皮質(zhì)醇[13]。肝臟是糖代謝的重要靶器官，肝臟通過糖異生的方式合成肝內(nèi)葡萄糖，G6Pase、PEPCK是糖異生的關(guān)鍵酶[14]。PEPCK催化草酰乙酸是磷酸烯醇式丙酮酸，G6Pase催化葡萄糖－6－磷酸分解成葡萄糖、磷酸，引起血液中葡萄糖水平升高，主要生理意義在于保證饑餓情況下的血糖濃度相對(duì)恒定。G6Pase、PEPCK的表達(dá)受到胰島素的抑制與胰高血糖素的激活。Insulin R是一種廣泛分布于各組織與器官的跨膜蛋白，胰島素通過與其結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中肝臟是Insulin R的主要靶器官，Insulin R的數(shù)目受到血胰島素水平的調(diào)節(jié)。胰島素與受體的結(jié)合程度隨糖尿病嚴(yán)重程度而增加，發(fā)生糖尿病時(shí)肝細(xì)胞Insulin R數(shù)目可增加180%，但I(xiàn)nsulin R的酪氨酸激酶活性降低，由胰島素介導(dǎo)的葡萄糖利用率反而減少[15]。瘦素是由肥胖基因編碼白色脂肪組織合成的一種分泌型蛋白質(zhì)，它通過與靶器官上的Leptin R結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。瘦素及其受體在葡萄糖代謝過程中具有重要作用。在生理情況下，胰島素與瘦素之間是一個(gè)雙向的反饋調(diào)節(jié)，即胰島素刺激瘦素分泌、瘦素抑制胰島素分泌，一旦這種平衡被破壞，胰島素對(duì)瘦素的靈敏度減弱，則引起胰島素抵抗。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T2DM組血清AST、ALT、HA水平均明顯升高，ALB水平明顯降低；臨床病理學(xué)表現(xiàn)主要為肝細(xì)胞水腫、脂肪變性、點(diǎn)狀壞死伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肝纖維組織增生等。肝臟11β－HSD1、GR蛋白表達(dá)明顯升高；肝組織Insulin R、Leptin R mRNA表達(dá)明顯升高。筆者認(rèn)為發(fā)生T2DM時(shí)肝內(nèi)11β－HSD1蛋白表達(dá)增強(qiáng)并激活GC活性，GC通過與肝細(xì)胞內(nèi)GR受體的結(jié)合發(fā)揮拮抗胰島素的作用，使肝組織對(duì)胰島素的靈敏度降低，從而使胰島素刺激瘦素分泌的功能下降；可見機(jī)體通過上調(diào)肝組織Insulin R、Leptin R mRNA表達(dá)是一種改善胰島素抵抗的代償反應(yīng)。棉酚組血清AST、ALT、HA水平均明顯下降，ALB水平明顯升高，肝纖維化程度明顯減輕；提示棉酚具有保護(hù)T2DM大鼠肝臟的作用。同時(shí)，肝臟 11β－HSD1、GR蛋白表達(dá)明顯下降，PEPCK、G6Pase mRNA表達(dá)亦明顯下降，提示棉酚可抑制肝臟11β－HSD1蛋白表達(dá)，一方面降低肝內(nèi)有活性的GC濃度，從而使肝內(nèi)GR表達(dá)亦相應(yīng)減少，改善肝組織對(duì)胰島素的靈敏度；另一方面減弱了GC刺激糖異生的作用，使血糖降低，糖異生關(guān)鍵酶PEPCK、G6Pase mRNA表達(dá)減少。此外，棉酚還能抑制肝組織Insulin R、Leptin R mRNA表達(dá)水平，可能參與降低糖尿病胰島素水平、改善胰島素抵抗的作用。在NAFLD發(fā)病過程中，高糖致線粒體內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生過多導(dǎo)致組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激是關(guān)鍵因素[16]。肝內(nèi)氧化應(yīng)激增加，肝星形細(xì)胞被激活并分裂增殖，使肝星形細(xì)胞具有肌纖維母細(xì)胞分泌膠原纖維的功能，促進(jìn)肝纖維化[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)棉酚組大鼠活化的肝星形細(xì)胞數(shù)目明顯減少，肝纖維化程度明顯減輕，可能與棉酚改善胰島素抵抗、減少糖異生有關(guān)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[6]，T2DM大鼠大腦皮層、海馬組織內(nèi)GR蛋白表達(dá)明顯升高，經(jīng)棉酚治療后，GR蛋白表達(dá)明顯下降，與本實(shí)驗(yàn)中肝臟GR蛋白表達(dá)結(jié)果相反。筆者考慮原因在于兩者形成機(jī)制不同：（1）肝組織局部有活性的GC增多主要是刺激GR蛋白表達(dá)使之與過多的GC結(jié)合以發(fā)揮拮抗胰島素的作用，而棉酚可抑制11β－HSD1的表達(dá)，使無活性的GC轉(zhuǎn)化成有活性的GC的量減少，因此GR也相應(yīng)減少。而在腦內(nèi)GC與GR結(jié)合的作用主要是對(duì)HPA軸起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，局部有活性的GC對(duì)神經(jīng)元的損害導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少、GR減少，使GC對(duì)HPA的抑制作用減弱，因此HPA對(duì)應(yīng)激反應(yīng)持久亢進(jìn)，分泌GC水平升高，從而進(jìn)一步加重了腦神經(jīng)元的損害，形成惡性循環(huán)。棉酚通過抑制11β－HSD1的表達(dá)，使局部有活性的GC減少，可減輕GC對(duì)神經(jīng)元的損害，因此，大腦皮層、海馬組織內(nèi)GR蛋白表達(dá)增強(qiáng)。

棉酚曾是一種實(shí)用的男性口服避孕藥而被廣泛應(yīng)用臨床，但高劑量（20～30mg/kg）會(huì)抑制11β類固醇脫氫酶－2而出現(xiàn)低血鉀，因此逐步停止使用；后來有研究證實(shí)低劑量（15mg/kg）無低血鉀的不良反應(yīng)[18]，本課題組前期研究結(jié)果亦與其一致[5－6]。因此，低劑量棉酚可明顯減輕T2DM合并NAFLD大鼠纖維化病變，其機(jī)制可能與其抑制組織11β－HSD1、Leptin R、Insulin R mRNA表達(dá)有關(guān)。

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2017-02-21）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.9.2017-326

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