乳酸不依賴于丙酮酸參與調(diào)節(jié)C2C12細(xì)胞線粒體功能維持的研究

孫景權(quán)，葉建平，謝敏豪

缺氧情況下，細(xì)胞通過糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，在大多數(shù)情況下乳酸以乳酸鹽（如乳酸鈉）形式存在于機(jī)體中。糖經(jīng)過糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，然后丙酮酸在乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的作用下產(chǎn)生乳酸。安靜狀態(tài)下血漿中乳酸濃度是0.5～2 mmol/L，骨骼肌和紅細(xì)胞被認(rèn)為是產(chǎn)生乳酸的主要位點(diǎn)。盡管骨骼肌在安靜狀態(tài)下不停地生成和利用乳酸，但是劇烈運(yùn)動(dòng)引起乳酸生成量增加，能夠達(dá)到10～20 mmol/L[1-4]。人體一次高強(qiáng)度無氧運(yùn)動(dòng)后骨骼肌中乳酸濃度甚至達(dá)到40 mmol/L[5]。另外，脂肪組織也是乳酸的重要來源[6-7]。當(dāng)葡萄糖含量豐富的情況下，在胰島素作用下脂肪組織能夠?qū)?0%以上的糖轉(zhuǎn)化成乳酸[8-9]。

乳酸通過其質(zhì)子串聯(lián)（Proton-linked）的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Monocarboxylate Transporters，MCTs）進(jìn)出細(xì)胞[10]。傳統(tǒng)生物化學(xué)理論認(rèn)為，乳酸是缺氧條件下葡萄糖的一個(gè)中間代謝產(chǎn)物，在氧氣充足情況下，乳酸進(jìn)入細(xì)胞后，主要在LDH作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶（Pyruvate Dehydrogenase，PDH）作用下生成乙酰輔酶A，進(jìn)而進(jìn)入糖異生途徑生成葡萄糖或是三酸羧循環(huán)途徑生成ATP[11]。這條途徑稱之為乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸途徑。但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳酸是機(jī)體一個(gè)重要信號(hào)物質(zhì)，乳酸在細(xì)胞中發(fā)揮信號(hào)分子作用。研究發(fā)現(xiàn)：乳酸能夠結(jié)合其受體G蛋白偶聯(lián)受體81（G Protein-Coupled Receptors 81，GPR81）發(fā)揮自分泌和旁分泌作用，從而抑制小鼠及大鼠脂肪組織和脂肪細(xì)胞的脂解作用[12]。因此目前學(xué)者們認(rèn)為，代謝物乳酸可能直接作為信號(hào)分子物質(zhì)影響細(xì)胞功能。

線粒體功能的維持需要線粒體各種酶的作用，而這些功能酶會(huì)受到許多小分子物質(zhì)調(diào)節(jié)。α-硫辛酸是一種重要的小分子物質(zhì)，它的作用是脂化修飾某些蛋白。脂化修飾是線粒體存在的一種蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，這種修飾作用是PDH和其他酶類（如α-酮戊二酸脫氫酶）功能維持所必需的。在線粒體中，α-硫辛酸是通過脂肪酸合成酶II系統(tǒng)（FattyAcid Synthase II system，F(xiàn)AS II）由乙酰輔酶A合成，這也是線粒體具有合成內(nèi)源性脂肪酸功能的體現(xiàn)[13]。丙二酸單酰輔酶A酰基載體蛋白?；D(zhuǎn)移酶（malonyl CoA-acyl carrier protein（ACP）transacylase，MCAT）是FASII復(fù)合物中一個(gè)主要組成成分，它是維持線粒體功能所必需的[14-15]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠增加線粒體功能，但是MCAT在其中所起的作用還未知。

乳酸作為運(yùn)動(dòng)性代謝產(chǎn)物，其是否影響骨骼肌細(xì)胞線粒體功能目前鮮見報(bào)道。本研究采用C2C12肌管細(xì)胞模擬骨骼肌細(xì)胞，假設(shè)乳酸參與調(diào)節(jié)C2C12肌管細(xì)胞中線粒體功能的維持，即乳酸調(diào)節(jié)MCAT蛋白表達(dá)量。另外，常規(guī)認(rèn)為乳酸通過轉(zhuǎn)化為丙酮酸發(fā)揮作用，那么乳酸發(fā)揮調(diào)節(jié)C2C12肌管細(xì)胞中線粒體功能作用是否依賴于丙酮酸途徑目前尚未見報(bào)道。本研究通過采用乳酸和丙酮酸等化學(xué)藥物處理C2C12肌管細(xì)胞后，觀察細(xì)胞內(nèi)MCAT蛋白含量及PDH脂化狀態(tài)的變化情況，進(jìn)而研究乳酸是否參與調(diào)節(jié)C2C12肌管細(xì)胞線粒體功能維持以及這一作用是否依賴于丙酮酸途徑，為深入開展運(yùn)動(dòng)鍛煉增加骨骼肌線粒體功能的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠成肌細(xì)胞細(xì)胞株C2C12（CRL-1772）購買于美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection）（馬納薩斯，維吉尼亞州）。首先將細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿加10 mL培養(yǎng)基（高糖DMEM，10%胎牛血清/FBS，1%慶大霉素），在37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期檢查是否出現(xiàn)支原體污染現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞匯合約80%時(shí)，加入1 mL的0.25%胰酶37℃消化細(xì)胞，加新培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/mL，鋪入6孔板。當(dāng)6孔板中細(xì)胞融合到90%～95%時(shí)，將C2C12細(xì)胞培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基（高糖DMEM，2%馬血清，1%慶大霉素）。當(dāng)用乳酸或是丙酮酸等化學(xué)藥物處理細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基換成含0.25%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）的高糖DMEM（GIBCO 11960）過夜，與次日進(jìn)行藥物處理。

1.2 細(xì)胞處理

C2C12細(xì)胞分化5天后，肌管細(xì)胞使用血清-饑餓培養(yǎng)基（高糖DMEM，不含丙酮酸，0.25%BSA，GIBCO，貨號(hào)：11960）過夜。次日，使用乳酸鈉（Sigma L7022）、丙酮酸鈉（Sigma-Aldrich P2256）進(jìn)行處理。乳酸鈉和丙酮酸鈉溶解在H2O中待用，4℃保存，儲(chǔ)存濃度為1 mol/L。

1.3 蛋白質(zhì)提取及濃度測(cè)定

用細(xì)胞裂解液（50 mmol/L KCl，1%NP-40，25 mmol/L HEPES pH7.8，10 μg/mL leupeptin，20 μg/mL aprotinin，125 μmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L Na3VO4）裂解細(xì)胞，收集在1.5 mL離心管裂解液中。用超聲儀對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲，此操作在冰上完成。4°C、12 000 g離心15 min。將上清液作為細(xì)胞蛋白提取液分裝至預(yù)冷離心管中。總蛋白濃度測(cè)定采用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量分析試劑盒（Life technologies，Eugene，Oregon，Prod#23225），采用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)試方法依照說明書進(jìn)行。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量

按照實(shí)驗(yàn)室以前方案進(jìn)行[16]，每樣品孔加50～100μg細(xì)胞總蛋白量。簡單概括如下，按照樣品：4×樣品緩沖液=50μL：15μL比例混合在一起，100℃煮沸5 min，冰上放置5 min，800 g離心2 min，用移液槍抽取適量樣品加入自制8%SDS-PAGE膠（見表1）的樣品槽內(nèi)，電壓50～100 V；轉(zhuǎn)膜，電壓為50 V，時(shí)間2 h；轉(zhuǎn)膜后1×PBS沖洗1次，共10 min；5%脫脂牛奶緩沖液封閉1 h；用1×PBS沖洗3次，每次10 min；然后加一抗4℃過夜；次日取出，1×PBS沖洗3次，每次10 min；鼠或是兔抗二抗孵育1 h；1×PBS沖洗3～5次，每次10 min；加底物顯影液后進(jìn)行曝光。蛋白名稱及試劑提供公司如下：主要抗脂化的抗體lipoylation（437695）購買于Calbiochem?（Darmstadt，Germany）；抗體 PDHE2（ab66511）購買于Abcam（Cambridge，MA，USA）；β-actin（C4，sc-47778），抗體MCAT（H-146，sc-366137）購買于Santa Cruz Biotechnology（Dallas，TX）。β-actin作為內(nèi)參蛋白。用化學(xué)發(fā)光方法將蛋白信號(hào)曝光于膠片中，使用Image J來分析每個(gè)條帶的光密度強(qiáng)度。

表1 8%SDS-PAGE膠配方Table1 8%SDS-PAGE Gel Formula

1.5 PDH活性測(cè)試

細(xì)胞裂解液中PDH活性測(cè)試采用PDH活性微板測(cè)定試劑盒（Abcam，ab109902），操作步驟依照試劑盒所提供說明書進(jìn)行。最后，在室溫條件下使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測(cè)，波長450 nm，檢測(cè)方法使用動(dòng)力學(xué)程序，每20 s讀一次數(shù)，共檢測(cè)60 min，讀數(shù)過程中96孔板震動(dòng)搖勻。將時(shí)間作為x軸，OD值作為y軸，繪制曲線，曲線的斜率作為PDH活性大小。

1.6 丙酮酸含量測(cè)試

細(xì)胞中丙酮酸含量測(cè)定使用丙酮酸比色法測(cè)定試劑盒（K609-100，BioVision，Milpitas CA，USA），測(cè)試方法依照說明書進(jìn)行。最后，使用酶標(biāo)儀（Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer，BIO-RAD，California，USA）在波長570 nm下讀取吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中丙酮酸含量，根據(jù)公式：樣品中丙酮酸濃度=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中丙酮酸含量（nmol）/加入樣品含量（μL）×樣品稀釋倍數(shù)。相對(duì)丙酮酸含量用樣品中蛋白濃度校準(zhǔn)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Xˉ±SD）方式表示，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，顯著水平取P＜0.05，非常顯著水平P＜0.01。作圖軟件采用Excel 2010和GraphPad Prism 5。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸增加C2C12肌管細(xì)胞MCAT蛋白表達(dá)量

本研究通過觀察肌管細(xì)胞中MCAT蛋白表達(dá)量研究乳酸對(duì)線粒體功能維持的影響。由圖1可知，與對(duì)照組相比，16 mmol/L乳酸以時(shí)間效應(yīng)方式顯著增加細(xì)胞中MCAT的蛋白表達(dá)量（P＜0.01），這種誘導(dǎo)作用在0.5 h出現(xiàn)，一直持續(xù)到8 h，而且存在時(shí)間依賴性現(xiàn)象（圖1 A）。另外，在劑量相應(yīng)上，處理后4 h，2～64 mmol/L乳酸均能夠非常顯著增加細(xì)胞中MCAT蛋白表達(dá)量（P＜0.01），其中16 mmol/L乳酸效果最為明顯（圖1 B）。

圖1 乳酸對(duì)MCAT蛋白表達(dá)量的影響Figure1 The Effect of Lactate on Protein Expression of MCAT

2.2 乳酸增加C2C12肌管細(xì)胞中PDH脂化狀態(tài)和活性

本研究通過觀察肌管細(xì)胞中PDH脂化信號(hào)水平研究乳酸對(duì)線粒體功能的影響。由圖2可知，與對(duì)照組相比，16 mmol/L乳酸以時(shí)間效應(yīng)的方式非常顯著增加C2C12肌管細(xì)胞中PDH脂化信號(hào)水平（P＜0.01），這種誘導(dǎo)作用在0.5 h出現(xiàn)，一直持續(xù)到8 h（圖2 A）。同時(shí)本研究觀察乳酸對(duì)C2C12肌管細(xì)胞中PDH活性的影響。與對(duì)照組相比，8～16 mmol/L乳酸能夠增加肌管細(xì)胞中PDH活性，并且16 mmol/L效果最顯著（P＜0.01）（圖2 B）。這些數(shù)據(jù)證明乳酸處理增加了PDH脂化信號(hào)水平。

圖2 乳酸對(duì)PDH脂化狀態(tài)和活性的影響。Figure2 The Effect of Lactate on Lipoylation Level and Activity of PDH

2.3 丙酮酸對(duì)C2C12肌管細(xì)胞MCAT蛋白表達(dá)量和PDH脂化水平的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，16 mmol/L丙酮酸在時(shí)間效應(yīng)上不能增加肌管細(xì)胞中MCAT蛋白表達(dá)量（P＞0.05），甚至在8 h處理后顯著降低細(xì)胞中MCAT蛋白表達(dá)量（P＜0.05）（圖3 A）。這表明丙酮酸不能影響MCAT蛋白表達(dá)量。同時(shí)，與對(duì)照組相比，16 mmol/L丙酮酸在時(shí)間效應(yīng)上雖然有增加PDH脂化信號(hào)水平的趨勢(shì)但無顯著性（P＞0.05），且在8 h處理后顯著降低細(xì)胞中PDH脂化信號(hào)水平（P＜0.05）（圖3 B）。由此證明丙酮酸不影響線粒體功能酶MCAT蛋白表達(dá)量和PDH脂化信號(hào)水平。

圖3 丙酮酸對(duì)C2C12肌管細(xì)胞MCAT蛋白表達(dá)量和PDH脂化水平的影響。Figure 3 The Effect of Pyruvate on Protein Expression of MCAT and Lipoylation Level of PDH in C2C12 Myotube Cells

2.4 乳酸增加C2C12肌管細(xì)胞中丙酮酸含量和MCAT蛋白表達(dá)量不依賴于丙酮酸

由圖4可知，與對(duì)照組相比，16 mmol/L乳酸處理肌管細(xì)胞后，C2C12肌管細(xì)胞中丙酮酸含量顯著增高（P＜0.05）（圖4 A）。而且，當(dāng)使用乳酸脫氫酶抑制劑棓黃素（Galloflavin）處理肌管細(xì)胞后，乳酸增加細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量這一作用減弱（P＜0.05）（圖4 B）。這說明乳酸能夠轉(zhuǎn)化丙酮酸，丙酮酸可能介導(dǎo)了乳酸活性。為了驗(yàn)證這種可能性，本研究使用Galloflavin處理肌管細(xì)胞后，細(xì)胞中MCAT蛋白含量非常顯著降低（P＜0.01），但是Galloflavin處理并不能減弱乳酸增加MCAT蛋白表達(dá)量的作用（P＜0.05）（圖4 C）。這些數(shù)據(jù)表明，丙酮酸可能不參與介導(dǎo)乳酸增加MCAT蛋白表達(dá)量的作用。

3 分析與討論

眾所周知，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠增加骨骼肌細(xì)胞中線粒體氧化功能即ATP產(chǎn)生的能力[17-18]、琥珀酸脫氫酶含量、I型肌纖維數(shù)量比例[19]。但是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞線粒體功能增加的分子機(jī)制還不清楚。乳酸作為葡萄糖代謝物，長期以來被認(rèn)為是葡萄糖無氧酵解的副產(chǎn)物或是廢物，主要被用于作為能源物質(zhì)進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP或者是在肝臟中糖異生成葡萄糖[1，20-22]。近年來學(xué)者們注意到乳酸一個(gè)新的角色——分子信號(hào)物質(zhì)[23-24]，如乳酸通過結(jié)合其受體GPR81后能夠通過降低腺苷酸環(huán)化酶活性進(jìn)一步降低細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)量[25-26]。那么乳酸是否會(huì)影響骨骼肌細(xì)胞中線粒體功能維持蛋白MCAT蛋白表達(dá)量和PDH活性和表達(dá)量目前未見報(bào)道。本研究采用C2C12肌管細(xì)胞模擬研究乳酸對(duì)骨骼肌細(xì)胞線粒體功能蛋白MCAT和PDH的影響，為后續(xù)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌線粒體功能增強(qiáng)的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)水平上，生理濃度范圍內(nèi)（4～64 mmol/L）的乳酸增加了C2C12肌管細(xì)胞中線粒體功能維持相關(guān)蛋白PDH和MCAT的蛋白含量及活性。

圖4 乳酸增加C2C12肌管細(xì)胞中丙酮酸含量和MCAT蛋白表達(dá)量不依賴于丙酮酸。Figure 4 The Increases of Pyruvate Content and Protein Expression of MCAT by Lactate in C2C12 Myotube Cells Independently of Pyruvate

本研究觀察乳酸是否影響MCAT蛋白表達(dá)量和PDH脂化水平。MCAT是一個(gè)線粒體蛋白，它是線粒體功能維持的必需物質(zhì)。有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在兩條脂肪酸合成途徑，存在于胞漿內(nèi)的是I型脂肪酸（Type I Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS I），存在于線粒體的是II型脂肪酸合成（Type II Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS II）[27]。FASII是線粒體功能維持所必需的[13，27]。硫辛酸是 FASII合成的其中產(chǎn)物之一[13，28]。硫辛酸是哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)脂化修飾所必需物質(zhì)[29-30]。在線粒體中，MCAT控制辛酸的合成，辛酸是硫辛酸的前體[27]。MCAT利用丙二酰輔酶A作為底物來合成硫辛酸。硫辛酸通過脂化來修飾線粒體功能酶[29]。脂化是一種動(dòng)態(tài)的和可逆的轉(zhuǎn)錄后修飾。PDH是線粒體功能酶，它是通過脂化修飾來激活[29]。激活后的PDH促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而增強(qiáng)脂肪酸合成和ATP產(chǎn)生。因此MCAT通過合成α-硫辛酸使PDH和αKDH硫辛酸化[31]。因?yàn)镸CAT是線粒體功能維持所必需的一個(gè)重要酶，MCAT失活將導(dǎo)致線粒體功能紊亂[13，31-32]。盡管線粒體中MCAT活性是已知的，但是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)MCAT蛋白表達(dá)量的因素還是未知的。本研究數(shù)據(jù)表明：乳酸誘導(dǎo)MCAT蛋白表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸誘發(fā)PDH和αKDH硫辛酸化信號(hào)水平增加，這說明乳酸增強(qiáng)了MCAT酶活性。另外，Takeshi等研究發(fā)現(xiàn)：乳酸能夠明顯增加L6細(xì)胞線粒體功能相關(guān)蛋白Cyt c和PGC-1α表達(dá)量[33]?；赑DH、αKDH、Cyt c和PGC-1α是線粒體功能標(biāo)志蛋白酶，本研究認(rèn)為乳酸同時(shí)參與調(diào)節(jié)線粒體功能蛋白增加。因此，本研究提供了一個(gè)乳酸參與調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞線粒體功能維持的分子機(jī)制。

乳酸能夠調(diào)節(jié)線粒體功能蛋白MCAT蛋白表達(dá)量和PDH活性，進(jìn)而影響線粒體功能的維持。常規(guī)認(rèn)為，乳酸常被認(rèn)為是肝臟糖異生的底物或者在許多外周組織中經(jīng)過三羧酸循環(huán)生成ATP而作為能源物質(zhì)發(fā)揮作用[11，34]。在這一過程中需要LDH的幫助，它能將乳酸催化生成丙酮酸，進(jìn)一步進(jìn)行糖異生或者產(chǎn)生ATP。因此乳酸這一作用是否依賴于丙酮酸途徑值得研究。本研究將研究重點(diǎn)集中于丙酮酸上。研究數(shù)據(jù)表明：乳酸發(fā)揮作用不依賴于丙酮酸。本研究通過檢測(cè)丙酮酸對(duì)C2C12肌管細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)，丙酮酸處理C2C12肌管細(xì)胞后并不能增加細(xì)胞中MCAT的蛋白表達(dá)量，這一結(jié)果與乳酸誘發(fā)肌管細(xì)胞MCAT蛋白表達(dá)是不一致的，這說明乳酸誘發(fā)MCAT表達(dá)不依賴于丙酮酸。FASII的重要作用是合成線粒體功能酶所需的α-硫辛酸，α-硫辛酸是PDH發(fā)揮功能所必需的小分子物質(zhì)，在合成α-硫辛酸過程中MCAT是限速酶[14-15]。因此，檢測(cè)PDH脂化信號(hào)水平可間接反映MCAT的活性。本研究檢測(cè)丙酮酸處理后細(xì)胞中PDH脂化信號(hào)水平發(fā)現(xiàn)，丙酮酸不能明顯增加PDH脂化信號(hào)水平，這一作用與乳酸顯著增加PDH脂化信號(hào)水平是不一致的。因此，乳酸增加PDH脂化信號(hào)水平不依賴于丙酮酸。這些數(shù)據(jù)清楚的表明，乳酸參與調(diào)節(jié)肌管細(xì)胞線粒體功能不依賴于丙酮酸。另外，胞漿中丙酮酸通過線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入線粒體內(nèi)[35，36]。在線粒體內(nèi)，丙酮酸被PDH轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行代謝[37]。盡管本研究研究發(fā)現(xiàn)丙酮酸與乳酸結(jié)果不同，但是乳酸處理C2C12肌管細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量明顯升高。而且當(dāng)使用乳酸脫氫酶抑制劑Galloflavin（Galloflavin均能夠抑制乳酸脫氫酶亞型A和B活性，它能夠抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸和ATP的合成量[38]）后，乳酸增加細(xì)胞中丙酮酸含量的作用減弱，因此這些結(jié)果均說明部分乳酸轉(zhuǎn)化成了丙酮酸。另外，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制LDH活性后，肌管細(xì)胞中MCAT蛋白表達(dá)量降低，然而卻不能逆轉(zhuǎn)乳酸增加MCAT蛋白表達(dá)量的作用。因此本研究認(rèn)為丙酮酸不參與乳酸增加MCAT蛋白表達(dá)量作用。鑒于部分乳酸轉(zhuǎn)化的丙酮酸不參與乳酸調(diào)節(jié)線粒體功能維持的作用，因此，這部分丙酮酸在C2C12細(xì)胞中所發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步研究。基于以上研究可以得出，丙酮酸可能不參與乳酸調(diào)節(jié)C2C12肌管細(xì)胞線粒體功能維持的作用。

本研究的結(jié)果將對(duì)研究乳酸是否參與調(diào)節(jié)體內(nèi)骨骼肌組織中線粒體功能維持具有積極的意義，也為進(jìn)一步研究運(yùn)動(dòng)代謝產(chǎn)物乳酸是否參與調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)線粒體功能增強(qiáng)提供新思路。然而，由于體外肌管細(xì)胞與體內(nèi)骨骼肌組織整體系統(tǒng)存在差異和受限于本研究采用的乳酸濃度是否完全適用于體內(nèi)骨骼肌組織中乳酸濃度等原因，因此，利用體外實(shí)驗(yàn)所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一定能真實(shí)地反映體內(nèi)骨骼肌組織中線粒體功能維持的確切機(jī)制，尚需更多在體研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持。

4 結(jié)論

乳酸影響C2C12細(xì)胞中線粒體功能維持并調(diào)節(jié)線粒體功能蛋白MCAT蛋白表達(dá)量，并且這一作用不依賴于丙酮酸途徑。

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