紅花槭離體培養(yǎng)及標(biāo)準(zhǔn)化繁殖

郭小芳,呂秀立,余 剛,張 瑩

(1德州世紀(jì)風(fēng)園藝科技創(chuàng)新有限公司,德州253500;2上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院,上海200232;

3上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心,上海200232;4國家林業(yè)種質(zhì)資源平臺-上海子平臺,上海200232;5陜西省西安植物園,西安710061)

槭樹科(Aceraceae)植物約200種,主要分布于北半球溫帶地區(qū),我國約150種,各地都有分布,主產(chǎn)長江流域及其以南地區(qū)。我國自20世紀(jì)80年代開始進行槭樹屬植物的引種繁育研究,在育苗技術(shù)上積累了一定的種植經(jīng)驗[1-2]。紅花槭變異較大,各個性狀及每個性狀之間的相對性狀變異廣泛,多樣性非常豐富,但其性狀的變異并沒有隨立地條件不同而發(fā)生較大波動,由此認為各個性狀的變異是可遺傳的[5]?！﹃柤t’(A.rubrum‘Red Sunset’)和‘十月紅’(A.rubrum‘October Glory’)是上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院于2004年從北美地區(qū)引進的優(yōu)良品種,經(jīng)過十幾年的觀察發(fā)現(xiàn),其在上海地區(qū)表現(xiàn)出良好穩(wěn)定的彩葉效果[3],耐炎熱,耐干旱,適應(yīng)上海氣候,符合上海市彩化需要,已用于上海的諸多綠化市政工程中。北京、天津等地園林綠化工程中已用優(yōu)良苗木上萬株,市場需求旺盛[4]。引種到山東以來,兩個品種也表現(xiàn)出良好的觀賞性和適應(yīng)性,青島、淄博等地每年的紅花槭種苗產(chǎn)量均在萬株以上,但價格較高[6],為了滿足市場需求及降低種苗成本,本試驗開展了‘夕陽紅’和‘十月紅’規(guī)?；缂夹g(shù)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘夕陽紅’(A.rubrum‘Red Sunset’):變色時間較早,一般在12月初開始變色,彩葉期長達20 d,整株色彩豐富,通常橙色、金色、紅色共存,且層次分明,絢爛多彩。

‘十月紅’(A.rubrum‘October Glory’):變色時間較晚,通常繼‘夕陽紅’落葉之后在12月底開始變色,彩葉期長達20 d,變色整齊度高,整株全紅,顏色紅艷亮麗。

‘夕陽紅’與‘十月紅’二者配置種植,彩葉期可延續(xù)50 d左右,豐富冬季景觀。從‘夕陽紅’與‘十月紅’健壯無病蟲害植株上取帶腋芽莖段作為外植體,進行組織培養(yǎng)。

1.2 滅菌方法

不同季節(jié)取樣后,去除枝葉,將莖段剪成2 cm長,每節(jié)帶一個腋芽或頂芽。流水沖洗2 h,于超凈工作臺上,先用72%的乙醇浸泡30 s,再用不同的滅菌劑浸泡不同時間,最后用無菌水沖洗5—6次,接種于初代培養(yǎng)基中進行初始誘導(dǎo)。篩選最佳滅菌劑、滅菌時間和取樣季節(jié)。

1.2.1 氯化汞的不同滅菌時間對外植體存活率的影響

設(shè)置0.15%(質(zhì)量體積比,g∕L,下同)氯化汞 6 個不同滅菌時間(4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、15 min),比較不同滅菌時間對外植體成活率的影響,重復(fù)3次。存活率=存活數(shù)∕接種數(shù)×100%。

1.2.2 不同滅菌劑對外植體存活率的影響

用氯化汞和次氯酸鈉配制6種滅菌劑,分別為0.10%氯化汞、0.15%氯化汞、0.20%氯化汞、5%次氯酸鈉溶液、10%次氯酸鈉溶液和15%次氯酸鈉溶液。滅菌時間均為8 min,重復(fù)3次,存活率計算方法同上。

1.2.3 取材季節(jié)對外植體存活率的影響

從1月份至12月份連續(xù)取材,進行取材季節(jié)對外植體存活率影響的比較。滅菌采用0.15%的氯化汞浸泡8 min,存活率計算方法同上。

1.3 配方設(shè)計

借鑒現(xiàn)有報道中篩選出的適宜培養(yǎng)基[7-8],及在此基礎(chǔ)上探索出的培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)階段采用MS、1∕2MS和WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同種類及不同濃度的激素。

生根階段采用WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,NAA、IBA分別設(shè)0.1 mg∕L、0.5 mg∕L和1.0 mg∕L 3個梯度。

各種培養(yǎng)基的pH調(diào)為5.75,蔗糖3%,瓊脂0.64%,分裝后在高壓滅菌鍋中121℃條件下保持18 min。

1.4 培養(yǎng)條件

無菌苗于光照條件下培養(yǎng),光照強度為1 500 lx,光周期12 h∕d,溫度25℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每種處理調(diào)查20個,重復(fù)3次,統(tǒng)計誘導(dǎo)率、芽增殖率、生根率和移栽成活率。采用Excel 2007和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法進行多重比較(α=0.05)。

誘導(dǎo)率=出芽外植體數(shù)∕接種數(shù)×100%;增殖率=增殖株數(shù)∕接種數(shù);

生根率=生根株數(shù)∕接種數(shù)×100%;移栽成活率=成活數(shù)∕移栽數(shù)×100%。

1.6 移栽馴化

生根試管苗洗凈培養(yǎng)基后,移栽于草炭和珍珠巖的混合基質(zhì)中,移栽初期保濕控溫。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌材料的獲得

2.1.1 氯化汞的不同滅菌時間對外植體存活率的影響

使用0.15%的氯化汞滅菌,滅菌時間為4 min時,外植體全部污染;12 min時雖然能獲得無菌外植體,但由于滅菌時間過長,存活率較低,僅為5%。存活率最高的滅菌時間是8 min,與其他處理相比,存活率顯著提高到15%(表1),因此篩選最佳滅菌時間為8 min。

表1 氯化汞的不同滅菌時間對外植體存活率的影響Table 1 Effects of different sterilization time of mercuric chloride on the survival rate of explants

2.1.2 不同滅菌劑對外植體存活率的影響

滅菌時間為8 min,探索了不同滅菌劑對外植體存活率的影響。當(dāng)氯化汞濃度為0.1%時,外植體污染嚴(yán)重,沒有得到無菌苗;當(dāng)氯化汞濃度為0.2%時,外植體則全部死亡。與氯化汞處理結(jié)果比較,次氯酸鈉溶液的滅菌效果顯著降低(表2),且用次氯酸鈉滅菌后發(fā)現(xiàn)外植體褪色至無色,切割時呈軟腐狀(圖1a)。次氯酸鈉對紅花槭外植體的傷害強于氯化汞,不適宜用于紅花槭外植體滅菌。因此,篩選0.15%氯化汞為最佳滅菌劑。

表2 不同滅菌劑對外植體存活率的影響Table 2 Effects of different sterilization agent on the survival rate of explants

2.1.3 不同取材季節(jié)對外植體存活率的影響

10月份至次年2月份秋冬季取休眠芽誘導(dǎo),結(jié)果顯示:外植體污染率高,存活率僅為0.5%,后期誘導(dǎo)不出無菌苗(表3)。3—5月份取外植體滅菌,與其他月份相比,存活率顯著提高,其中4月份取樣的存活率最高(20%),莖段兩端受消毒液侵害易死亡,但有腋芽的節(jié)部良好(圖1b),后期能夠萌發(fā)出無菌苗。因此,確定4月份為最佳取材時間。

表3 不同取材時間對外植體存活率的影響Table 3 Effects of sampling time on the survival rate of explants

2.2 誘導(dǎo)和分化

無菌莖段于培養(yǎng)基(1)、(2)中培養(yǎng)30 d后,頂芽和腋芽都沒萌發(fā),后期逐漸形成紅色致密的愈傷組織。提高BA、KT濃度,添加低濃度NAA的培養(yǎng)基(3)、(4)依然不能促進頂芽和側(cè)芽的萌發(fā),僅培養(yǎng)基(4)中萌發(fā)了1株側(cè)芽。借鑒有關(guān)學(xué)者篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基WPM+6-BA 2.0 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L[7],培養(yǎng)至60 d也沒形成叢生芽,莖段完全愈傷化。培養(yǎng)基(6)、(7)中,莖段形成愈傷組織,沒有出現(xiàn)無菌苗的萌發(fā)。在培養(yǎng)基(8)中,培養(yǎng)90 d后,少量外植體開始萌動,腋芽生長,但葉片容易變黃脫落,生長慢。在添加細胞分裂素2ip的培養(yǎng)基(9)、(10)中,二者誘導(dǎo)率略有提高,無菌苗葉色嫩綠,長勢較旺,但基部也易形成大團愈傷組織(圖1c)。可見,初代培養(yǎng)以培養(yǎng)基MS+2ip 0.5 mg∕L+GA30.5 mg∕L比較適宜,與其他處理相比,兩種紅花槭的誘導(dǎo)率顯著提高,分別為25%和15%(表4)。

表4 不同激素及不同激素水平對芽誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects of different hormone and different hormone concentrations on bud induction

無菌苗長至1 cm高,從外植體上切下,繼代于增殖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至20 d,沒有分化;培養(yǎng)至40 d,開始出現(xiàn)分化;培養(yǎng)至60 d,試管苗高度為2.5 cm,分化率達到最高。此時培養(yǎng)基干涸不適宜繼續(xù)培養(yǎng),需轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中,因此培養(yǎng)周期設(shè)為60 d,既節(jié)約成本,又達到分化最大值。不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素種類及濃度對增殖率的影響差異顯著(表5),WPM培養(yǎng)基較適合增殖培養(yǎng)。在添加細胞分裂素2ip及TDZ的培養(yǎng)基中,試管苗顏色嫩綠長勢旺盛,與其他處理相比,培養(yǎng)基WPM+2ip 1.0 mg∕L+TDZ 0.002 mg∕L+GA30.5 mg∕L增殖效果最佳,兩個品種分別達到1.35和1.45(圖1d)。

表5 不同激素及不同激素水平對芽增殖的影響Table 5 Effects of different hormone and different hormone concentrations on bud multiplication

挑選健壯一致的試管苗,培養(yǎng)于WPM+2ip 1.0 mg∕L+TDZ 0.002 mg∕L+GA30.5 mg∕L培養(yǎng)基中,設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)至60 d時統(tǒng)計培養(yǎng)情況。不同溫度對紅花槭增殖影響顯著,溫度為28℃時,增殖率分別為1.95和1.90,顯著高于其他處理(表6)。試管苗較整齊,葉色濃綠,平均高度可達3 cm,基部愈傷組織明顯減小,有利于后期生根(圖1e),這與紅花槭本身是喜陽植物有關(guān)。

表6 不同溫度對芽增殖的影響Table 6 Effects of different temperature on bud multiplication

2.3 生根培養(yǎng)

添加NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)試管苗生根,速度比較快,但易引起試管苗基部愈傷化,不利于后期移栽;添加IBA的培養(yǎng)基雖然誘導(dǎo)生根時間長,但基部沒有愈傷組織。兩種生長素單獨使用時,培養(yǎng)至30 d,生根率均為50%左右;添加兩種生長素的培養(yǎng)基,生根率可達85%以上(表7),根白色細長,可長至2—4 cm,形成完整的試管苗。二者濃度以0.5 mg∕L最合適,既沒有愈傷組織形成,也能在最短時間內(nèi)誘導(dǎo)生根,生根率分別達到85%和90%(圖1f),顯著高于其他處理。

表7 不同激素及不同激素水平對生根的影響Table 7 Effects of different hormone and different hormone concentrations on rooting

2.4 試管苗移栽

選擇根系發(fā)達、根長2 cm、生長健壯、無黃葉爛葉的試管苗,溫室內(nèi)先放置3 d以適應(yīng)光照、溫度等外界條件的變化;再開瓶放置3 d以適應(yīng)干濕度的變化,取出試管苗,洗凈根部瓊脂,種植于事先備好的基質(zhì)中?；|(zhì)采用透氣良好的進口草炭,長度4 mm左右,以草炭∶珍珠巖=2.5∶1的比例調(diào)成混合基質(zhì),于種前2 d澆透,種后澆一遍1 500倍的多菌靈。通過增加小膜風(fēng)口達到早晚降濕;通過拉遮陽網(wǎng)、將小膜風(fēng)口適當(dāng)關(guān)小達到中午降溫保濕效果,特殊情況下向小膜內(nèi)壁噴水保濕。緩苗前需補水,補水的量以當(dāng)天蒸發(fā)完為佳;緩苗后干透澆透,并適當(dāng)延長光照時間來培育健壯種苗。兩遍肥水之間加一遍清水,EC值控制在250—500 μS∕cm,肥料按寶力豐∶銨鈣鎂=7∶3的比例混合。5—7 d施一遍殺菌藥,及時防治根蛆。

圖1 紅花槭離體培養(yǎng)及標(biāo)準(zhǔn)化繁育過程Fig.1 In vitro culture and standardized propagation process of Acer rubrum

移植一個月后,新根發(fā)滿半個穴盤孔,成活率在90%以上(圖1g);繼續(xù)養(yǎng)護2個月,根部已經(jīng)形成土球(圖1h),高度為10 cm,可作為成品苗發(fā)售。2個月以上的生根苗需移植入直徑為8 cm的小缽中,以利后期生長(圖1i);培養(yǎng)5個月后,高度可達40 cm,可用于林地綠化及上山造林(圖1j、1k)。通過以上步驟的精細管理,培育高度為40 cm的紅花槭商品苗需要5個月時間,成活率可達80%以上。

3 討論

目前對美國紅楓的組培研究已有多篇報道,紅花槭‘白蘭地’品種已建立了離體培養(yǎng)體系[7],但后期沒有形成規(guī)模化生產(chǎn);以實生苗的葉片和嫩莖段為外植體、以種胚為材料進行研究,也僅誘導(dǎo)出愈傷組織,沒有植株再生的報道[8]。本項目篩選表現(xiàn)優(yōu)良的兩個紅花槭品種,進行了系統(tǒng)開發(fā)研究,克服了高大喬木離體培養(yǎng)時啟動困難、培養(yǎng)周期長、易愈傷化等諸多問題,建立了完善的繁殖體系,并進行了規(guī)?；a(chǎn)。目前兩個品種已生產(chǎn)出40萬株整齊一致的優(yōu)質(zhì)種苗,在一定程度上滿足了市場需求,對加快兩品種的造林綠化具有重要意義,并將對我省乃至整個華北地區(qū)工廠化育苗技術(shù)的推廣和應(yīng)用起到良好的示范作用,產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益,同時在高大木本植物的繁殖上積累了豐富經(jīng)驗。

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