座滴法制備雞蛋白溶菌酶晶體與生長(zhǎng)因素探究

張曉婷，唐建國(guó)*，張 羽，王 瑤，黃林軍，劉繼憲，王彥欣，張曉琳，李 瀟，Matt J. Kipper, Christopher D. Snow*

（1. 國(guó)家雜化材料技術(shù)國(guó)際聯(lián)合研究中心，國(guó)家高分子雜化材料國(guó)際合作基地，青島大學(xué)雜化材料研究院，青島大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266071; 2. 科羅拉多州立大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，科羅拉多 柯林斯堡80523，美國(guó)）

科研與開發(fā)

座滴法制備雞蛋白溶菌酶晶體與生長(zhǎng)因素探究

張曉婷1，唐建國(guó)1*，張 羽1，王 瑤1，黃林軍1，劉繼憲1，王彥欣1，張曉琳1，李 瀟1，Matt J. Kipper2, Christopher D. Snow2*

（1. 國(guó)家雜化材料技術(shù)國(guó)際聯(lián)合研究中心，國(guó)家高分子雜化材料國(guó)際合作基地，青島大學(xué)雜化材料研究院，青島大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266071; 2. 科羅拉多州立大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，科羅拉多 柯林斯堡80523，美國(guó)）

蛋白質(zhì)晶體學(xué)的不斷發(fā)展，使得蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶方法也日趨增多。首次采用了座滴法結(jié)晶法，探究不同濃度雞蛋白溶菌酶溶液，不同溫度、NaCl濃度，是否添加mPEG對(duì)晶體形貌尺寸的影響。通過顯微鏡以及掃描電鏡觀察蛋白質(zhì)晶體形貌特征，不同條件下的晶體形貌變化，最終獲得晶體生長(zhǎng)的最適溫度以及濃度條件。

雞蛋白溶菌酶（HEWL）晶體；座滴法結(jié)晶；溫度；沉淀劑濃度；mPEG

尋找蛋白質(zhì)結(jié)晶的最適生長(zhǎng)條件和晶體生長(zhǎng)方法，一直以來是晶體培養(yǎng)領(lǐng)域的目標(biāo)。在某種程度上來說，晶體的生長(zhǎng)是科學(xué)理論與長(zhǎng)久的經(jīng)驗(yàn)積累得出的[1]。結(jié)晶方法的不同也會(huì)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)晶體。大多數(shù)的蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)多采用以下幾種方法結(jié)晶。

氣相擴(kuò)散法，主要有懸滴法（The Hanging Drop Method）和座滴法（The sitting-drop method）兩種[2-4]。相對(duì)于分批法，蛋白質(zhì)溶液緩慢地形成過飽和溶液，晶體生長(zhǎng)的速度可控[5]。懸滴法中，蛋白質(zhì)與沉淀劑液滴置于處理后的蓋玻片上，凹槽中放置沉淀劑。蓋玻片反置于生長(zhǎng)盤的凹槽之上，油酯密封[6]。但在懸滴法中，如果液滴表面張力過小，會(huì)在蓋玻片表面展開，導(dǎo)致濃度的分布不均，無法獲得晶體[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)采取座滴法，可以直接使用顯微鏡觀察，無需處理蓋玻片，蛋白質(zhì)液滴不會(huì)鋪展開。減弱了晶體在懸滴法中受到的重力影響[9]。晶體長(zhǎng)成后，便于轉(zhuǎn)移與交聯(lián)。該方法需要的蛋白質(zhì)較少，這對(duì)于探究晶體生長(zhǎng)條件十分方便。在蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)時(shí)，溶菌酶是常用的蛋白質(zhì)，而雞蛋白溶菌酶(Hen-egg white Lysozyme簡(jiǎn)稱HEWL)，是溶菌酶群中重要的研究對(duì)象，而HEWL是第一個(gè)三維結(jié)構(gòu)已知的酶[10]。HEWL化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在pH=4～7范圍內(nèi)，100 ℃處理1 min仍保持原酶活性，在堿性環(huán)境中該酶對(duì)熱穩(wěn)定性較差，但交聯(lián)后的晶體耐強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以及高溫等極端化學(xué)環(huán)境[11]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

所用化學(xué)試劑均為分析純，離心后去除雜質(zhì)。醋酸鈉，醋酸，氯化鈉,戊二醛（≥50%）均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，聚乙二醇單甲醚5000（mPEG-5000）購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司。雞蛋白溶菌酶（HEWL）、晶體生長(zhǎng)液（30%w/v mPEG5000, 1.0 mol/L NaCl, 0.05 mol/L NaAc pH4.6）與 24孔坐滴晶體生長(zhǎng)盤以及透明晶體密封膠帶均購(gòu)于Hampton research 公司。

所用到的儀器有德國(guó) Brand 數(shù)字可調(diào)式單道移液槍（量程范圍2～20μL），梅特勒恒溫磁力攪拌器，重慶奧特體視連續(xù)變倍顯微鏡，TGL-16M湘儀冷凍離心機(jī)，掃描電子顯微鏡（JSM-7500F日本電子株式會(huì)社），雷磁pH計(jì)。

1.2 雞蛋白溶菌酶(HEWL)溶液的配制

在室溫下，使用pH配制pH=6.4的0.05 mol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液作為溶劑。配制20、30、40、50 g/L的HEWL的醋酸鈉溶液。

1.3 晶體生長(zhǎng)沉淀劑的制備

本實(shí)驗(yàn)使用的晶體沉淀劑分別為購(gòu)于 Hampton research的晶體生長(zhǎng)液，以及不同濃度的NaCl、不同pH的NaAc、聚乙二醇單甲醚（mPEG）混合溶液，配制濃度為4 mol/L的NaCl溶液，0.1 mol/L的pH 4.6 NaAc溶液，母液稀釋法配制不同NaCl濃度的沉淀劑。

1.4 座滴法制備雞蛋白溶菌酶(HEWL)晶體

一定濃度的 HEWL的醋酸鈉溶液，吸取大于100μL的沉淀劑于B中，1～10μL 的HEWL蛋白質(zhì)溶液于A中，并從B中1～10μL沉淀劑于A中，使得A中蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑形成過飽和溶液，膠帶密封，恒溫靜置生長(zhǎng)。待晶體生長(zhǎng)完成后，加入少量戊-二醛溶液密封交聯(lián)，長(zhǎng)期保存(圖1)。

1.5 不同溫度下的晶體生長(zhǎng)

按照表1制備HEWL的醋酸鈉溶液。在15、25、30 ℃下，生長(zhǎng)晶體。沉淀劑中還含有30%w/v MPEG、0.05 mol/L NaAc pH=4.6。

圖1 座滴法晶體生長(zhǎng)裝置Fig.1 Sitting-drop method device

表1 不同溫度下晶體生長(zhǎng)條件Table 1 Crystal growth conditions at different temperatures

1.6 不同NaCl濃度下晶體生長(zhǎng)

按照表2配制沉淀液，在25 ℃下，選擇40 g/L HEWL溶液，生長(zhǎng)晶體。

表2 不同濃度的NaCl溶液Table 2 Different concentrations of NaCl solution

1.7 mPEG-5000對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響

對(duì)表2中的NaCl溶液，添加30%w/v 的mPEG。在25 ℃下，40 g/L的HEWL溶液，生長(zhǎng)晶體。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞蛋白溶菌酶晶體（HEWL）表征

圖2a中，HEWL晶體為六方晶體和四方晶體，無色透明，有明顯的邊界。選取四方晶體進(jìn)行洗滌交聯(lián)后，晶體由無色透明，變?yōu)橥该鳒\黃色。戊二醛與蛋白質(zhì)中氨基結(jié)合，發(fā)生了分子間交聯(lián)，蛋白質(zhì)變性[12,13]，晶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)，可以承受高能電子束掃描。圖2c和圖2d為晶體的SEM測(cè)試圖，在HEWL晶體中，存在大量水通道，在樣品制備過程中，真空干燥使HEWL晶體表面發(fā)生了失水皺縮，HEWL晶體內(nèi)部蛋白質(zhì)濃度升高，可以觀察到晶體表面析出新的 HEWL蛋白質(zhì)，產(chǎn)生新的小尺寸HEWL片晶[14-17]。

圖2 a、b為晶體交聯(lián)前與交聯(lián)后的顯微鏡圖片; c、d為晶體的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 a b for the crystal before and after crosslinking microscope pictures, c d for the SEM image of the crystal

2.2 溫度對(duì)HEWL晶體生長(zhǎng)的影響

圖3可見，低溫下，成核迅速，但生長(zhǎng)速度低，產(chǎn)生大量的微晶。溫度升高，晶體成核慢，生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)生大尺寸的不規(guī)則晶體。在 15 ℃時(shí)，發(fā)現(xiàn)低濃度的蛋白質(zhì)溶液會(huì)產(chǎn)生小尺寸的晶體，產(chǎn)生了孿晶[18]。

該溫度下 HEWL溶液迅速達(dá)到飽和或過飽和狀態(tài)，導(dǎo)致晶核成核快，晶核數(shù)目多，晶體尺寸變小。25 ℃，HEWL在濃度20～40 g/L時(shí)，晶體的形貌大多為規(guī)則的四方晶體，存在極少的孿晶，隨著蛋白質(zhì)濃度增加，晶體尺寸逐漸增大。在 30 ℃，溫度過高，形貌發(fā)生變化，晶體為尖銳的星型，晶體數(shù)量隨著濃度的增大而增多。當(dāng)HEWL溶液濃度達(dá)到50 g/L時(shí)，均由于濃度過大，導(dǎo)致晶核數(shù)目過多，無大尺寸晶體生成[18-20]。

圖3 15 ℃時(shí)HEWL濃度分別為20 ～ 50 g/L的HEWL晶體（a-d）；25 ℃時(shí)HEWL濃度分別為20 ～ 50 g/L HEWL晶體（e-h）；30 ℃時(shí)HEWL濃度分別為20 ～50g/L HEWL晶體（標(biāo)尺均為100 μm）Fig.3 HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystals at 15 ℃(a-d); HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystals at 25 ℃(e-h); HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystal at 30 ℃(scale = 100 μm)

可以得出結(jié)論，溫度低于25 ℃，晶體生成數(shù)目會(huì)隨蛋白質(zhì)溶液濃度升高而增多，因低溫迅速結(jié)晶而產(chǎn)生孿晶。而溫度高于25 ℃，晶體生長(zhǎng)會(huì)發(fā)生晶體變形，晶核生長(zhǎng)過程因升溫而加速，晶核無法良好的生長(zhǎng)，形貌發(fā)生改變。因此溫度過高或過低都無法得到形貌良好的晶體[21]。

2.3 不同NaCl濃度下晶體生長(zhǎng)

圖4可以看出，NaCl濃度影響晶體的生長(zhǎng)，隨著NaCl濃度的增加，晶體尺寸由小增大，尺寸分布呈現(xiàn)曲線變化，晶型為棒狀晶。在濃度為1.3 mol/L時(shí)，棒狀晶體的數(shù)量減少，長(zhǎng)徑比增大，晶體尺寸增大。在d圖中，NaCl濃度過大，導(dǎo)致晶核增多，晶體無法繼續(xù)生長(zhǎng)，棒狀晶體的尺寸減小，易斷裂。晶體在濃度為1.3 mol/L時(shí)達(dá)到最佳，濃度繼續(xù)增大，則晶體會(huì)由于沉淀劑濃度增大，晶核增多，無法形成完美晶型的四方晶體。過飽和的蛋白質(zhì)溶液可以經(jīng)過熱力學(xué)誘導(dǎo)而分離成2個(gè)介穩(wěn)的濃度相差較大的液相，即不穩(wěn)定區(qū)(labile region)和亞穩(wěn)區(qū)(metastable region)。由圖4f中蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)相圖來看，晶體生長(zhǎng)需要達(dá)到高的過飽和度，如果過飽和度太小，成核速率慢，晶體未生成，這個(gè)狀態(tài)為亞穩(wěn)區(qū)。在非穩(wěn)區(qū)或者結(jié)晶區(qū)的任一點(diǎn)，溶液自發(fā)結(jié)晶，在溫度不變時(shí)，溶液濃度會(huì)逐漸下降，直至飽和線界限。因此，溶液需要在亞穩(wěn)區(qū)或非穩(wěn)定區(qū)才能結(jié)晶。當(dāng)濃度繼續(xù)增大，達(dá)到沉淀區(qū)，會(huì)產(chǎn)生無序結(jié)構(gòu)，造成大量晶核生成。因而蛋白質(zhì)溶液與NaCl溶液的濃度需要在非穩(wěn)區(qū)范圍內(nèi)。

圖4 25 ℃下，40 g/L HEWL溶液，HEWL晶體（無mPEG，標(biāo)尺均為100 μm）Fig.4 25 ℃, 40 g/L HEWL, HEWL crystals (no mPEG, scale are 100 μm)

2.4 mPEG對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響

對(duì)比圖4，可以發(fā)現(xiàn)圖5晶體的形狀由棒狀晶體變?yōu)樗姆骄w，晶體尺寸均一、形狀規(guī)則。晶體的生長(zhǎng)過程中會(huì)受到液相流動(dòng)的影響，導(dǎo)致晶體發(fā)生變形以及晶格缺陷增多，也會(huì)使得晶體無法生成。圖5在晶體生長(zhǎng)的沉淀劑中加入mPEG后，溶液粘度增大，降低了體系流動(dòng)性和晶體生長(zhǎng)速度，晶體不易變形。

圖5 加入30%w/v mPEG后，不同NaCl濃度生長(zhǎng)出的晶體Fig.5 After adding 30%w/v mPEG, HEWL crystallization of different NaCl concentration

3 結(jié) 論

座滴法（the sitting-drop method）結(jié)晶法，改進(jìn)了懸滴法中對(duì)于玻片的硅化過程，避免了蛋白質(zhì)溶液液滴表面張力不足而導(dǎo)致的平鋪在玻片表面，同時(shí)更加方便利用顯微攝像技術(shù)記錄檢測(cè)蛋白質(zhì)晶體情況。HEWL蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)過程受溫度、濃度、以及mPEG的影響,晶體生長(zhǎng)存在最佳環(huán)境條件，本體系在溫度為25 ℃,NaCl濃度處于1.1～1.5 mol/L之間，且加入mPEG的條件下，可以獲得形狀尺寸良好的HEWL四方晶體。

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科思創(chuàng)一季度凈利潤(rùn)4.68億歐元 聚氨酯業(yè)務(wù)表現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)

科思創(chuàng)于4月25日公布了其第一季度財(cái)報(bào)。數(shù)據(jù)顯示，公司第一季度凈利潤(rùn)由去年同期的1.82億歐元飆升至4.68億歐元。其中，聚氨酯業(yè)務(wù)呈現(xiàn)出的三倍增長(zhǎng)起到了至關(guān)重要的作用。

截至2017年3月，公司第一季度營(yíng)業(yè)額為35.9億歐元，同比增長(zhǎng)24.7%，息稅折舊及攤銷前利潤(rùn)也強(qiáng)勢(shì)上行近66.5%，達(dá)到了8.46億歐元。第一季度營(yíng)業(yè)利潤(rùn)為6.88億歐元，較去年同期的3.4億歐元上漲一倍有余。

科思創(chuàng)首席執(zhí)行官Patrick Thomas對(duì)此贊譽(yù)有加：“公司展現(xiàn)出了強(qiáng)勁的增長(zhǎng)勢(shì)頭，其息稅折舊及攤銷前利潤(rùn)也已連續(xù)九個(gè)月處于上行軌道之中。”

科思創(chuàng)聚氨酯業(yè)務(wù)第一季度營(yíng)業(yè)利潤(rùn)從去年同期的1.17億歐元躥升至3.96億歐元，營(yíng)業(yè)額也上漲35%，達(dá)18.9億歐元。其中，聚碳酸酯業(yè)務(wù)營(yíng)業(yè)利潤(rùn)為 1.84億歐元，較去年同期漲幅達(dá) 44.9%。涂料、膠黏劑以及各類特殊化學(xué)品業(yè)務(wù)利潤(rùn)也小漲3.4%，收于1.23億歐元。

據(jù)科思創(chuàng)宣稱，第一季度銷售額所顯現(xiàn)出的 24.7%的增長(zhǎng)是由多項(xiàng)因素共同推動(dòng)的，比如第一季度總銷售量與平均銷售價(jià)格分別上升了9%與13.4%，以及聚氨酯售價(jià)抬升25.8%等。

科思創(chuàng)首席財(cái)務(wù)官Frank Lutz對(duì)此表示：“公司第一季度的活躍表現(xiàn)更堅(jiān)定了我們對(duì)整個(gè)2017財(cái)年的信心。其原因顯而易見——全球建筑業(yè)以及北美與亞太地區(qū)家具、床墊業(yè)的市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，無疑為公司第一季度的迅猛增長(zhǎng)提供了動(dòng)力?！?/p>

科思創(chuàng)曾與2015年宣布永久關(guān)閉位于西班牙塔拉戈納的MDI裝置，這一計(jì)劃在公布后隨即擱淺。若非科思創(chuàng)維持裝置運(yùn)轉(zhuǎn)至今，也不會(huì)有當(dāng)下的一片欣欣向榮。

同時(shí)，科思創(chuàng)早在2016年6月就計(jì)劃對(duì)位于德國(guó)北部城市布倫斯比特爾的一處工廠進(jìn)行改建，力爭(zhēng)到2018年實(shí)現(xiàn)產(chǎn)能倍增。屆時(shí)，該廠MDI年產(chǎn)能將達(dá)到40萬噸每年。

盡管科思創(chuàng)并未在周二的報(bào)告中公布具體數(shù)字，但有關(guān)人士稱：第一季度的成功極大提振了公司在實(shí)現(xiàn)原定營(yíng)銷目標(biāo)方面的信心。據(jù)預(yù)測(cè)，與過去三年平均水準(zhǔn)相比，公司2017年度凈現(xiàn)金流將呈現(xiàn)出較為明顯的漲幅。

Study on Growth Factors of Hen-Egg White Lysozyme Crystallization by Sitting-drop Method

ZHANG Xiao-ting1,TANG Jiang-guo1*,ZHANG Yu1,WANG Yao1,HUANG Lin-jun1,LIU Ji-xian1,WANG Yan-xin1,ZHANG Xiao-lin1,LI Xiao1,Matt J. Kipper2,Christopher D. Snow2*

（1. The National Base of International Scientific and Technological Cooperation on Hybrid Materials, The International Cooperation Base of National Polymer Hybrid Materials, Institute of Hybrid Materials of Qingdao University, Department of Material Science and Engineering, Qingdao University, Shandong Qingdao 266071，China；2. Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado State University Colorado Fort Collins, CO 80523, USA）

The development of protein crystallography promotes the improvement of crystallization method of protein crystals. In this paper, effect of hen egg white lysozyme concentration, temperature, NaCl concentration and adding mPEG or not on size and pattern of protein crystals was investigated. The crystal morphology of the protein was observed by microscope and Scanning Electron Microscope, and the optimum temperature and concentration conditions were obtained in the end.

Hen-egg white lysozyme crystals; Sitting-drop method; Temperature; Concentration of precipitant；MPEG

O 743

A

1671-0460（2017）04-0573-04

(1)國(guó)家自然科學(xué)基金(#51273096，#51373081，#51473082);

(2)國(guó)家高端外國(guó)專家項(xiàng)目(GDW20143500164, GDT20153500059, GDW20143500164)；

(3)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“政府間國(guó)際科技合作”重點(diǎn)專項(xiàng)(2016YFE10800) ;

(4)國(guó)家創(chuàng)新引智計(jì)劃“111計(jì)劃”。

2017-03-13

張曉婷（1992-），女，山東省濰坊市人，研究生，碩士，2017年畢業(yè)于青島大學(xué)材料學(xué)，研究方向：蛋白質(zhì)晶體稀土雜化材料。E-mail：17864215552@163.com。

唐建國(guó)（1958-），男，教授，博士，高分子雜化材料研究。E-mail：jianguotangde@hotmail.com。