大青楊再生體系的優(yōu)化1)

姜洋 劉煥臻 李開隆

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

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大青楊再生體系的優(yōu)化1)

姜洋 劉煥臻 李開隆

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

采用正交試驗設計，研究不同培養(yǎng)基和不同激素質量濃度配比對大青楊無菌苗葉片植株再生體系的影響，優(yōu)化大青楊植株再生體系。結果表明：對大青楊不定芽誘導的影響最大為激素NAA，其次是培養(yǎng)基類型，最后是激素6-BA；不定芽增殖的影響最大是NAA，其次是培養(yǎng)基類型，最后是6-BA；對叢生苗生根的影響最大是激素類型，然后是培養(yǎng)基類型；培養(yǎng)基類型和激素的質量濃度對大青楊再生體系有著較明顯的影響。最適宜大青楊分化的培養(yǎng)基為：WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，誘導率達100%；最適宜大青楊叢生芽增殖的培養(yǎng)基為：MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，芽健壯；最適宜大青楊生根的培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1 mg/L IBA，經過14 d生根，生根率達100%。

大青楊；再生體系；培養(yǎng)基；正交試驗設計

大青楊(PopulusussuriensisKom.)是東北林區(qū)的鄉(xiāng)土樹種[1]，耐寒、速生，是分布區(qū)內山地營造速生豐產用材林的主要樹種之一[2]。其木質較軟，韌性好，材質潔白而致密，耐腐朽，是造紙及膠合板材極好的原料。隨著東北天然林的停止采伐，可用于營造大青楊人工林的林地多是荒山荒地和退耕還林地等。地條件就需要抗旱、耐瘠薄、適應性強的大青楊新品種。分子育種與常規(guī)育種相比，具有目的性強、育種周期短、可以打破物種間雜交不親和的界限等優(yōu)點[3]。大青楊抗逆基因工程育種逐漸引起人們重視[4]。

建立高效的再生體系是進行遺傳轉化的基礎[5]。盡管國內外對青楊的組織培養(yǎng)進行了大量的研究，但對大青楊的再生體系的研究卻鮮有報道。僅李世承[6]以大青楊嫩葉、新梢為材料進行植物組織培養(yǎng)，而對影響不定芽誘導分化主要因子則沒有進行相應的研究。郭斌[7]以美洲黑楊×大青楊的5個雜種無性系為對象建立離體培養(yǎng)體系及葉片再生體系，各個無性系的葉片再生能力差異顯著，特別適合于177無性系，靳春蓮對大青楊建立了組培體系，并對遺傳轉化作了研究，但其建立的組培體系轉化率低，并對組培體系缺乏系統的研究。鑒于此，為了得到大青楊植株高效的再生體系。本文以大青楊無菌苗葉片為外植體，研究不同培養(yǎng)基類型、不同激素組合配比對其不定芽誘導、增殖和生根能力的影響，以期獲得大量的優(yōu)質的無菌苗，為大青楊遺傳改良和快速繁育提供依據。

1 材料與方法

以東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室保存的大青楊組培苗為材料，開展大青楊再生體系研究。

不定芽誘導：取生長3周的大青楊組培苗，用解剖刀把葉片組織切成0.5～1.0 cm2的小塊，然后葉片背面向下接種在分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的種類和添加激素的配比按照三因素(培養(yǎng)基類型為第一因素A、6-BA不同質量濃度為第二因素B、NAA不同質量濃度為第三因素C)三水平的正交試驗設計方法進行。培養(yǎng)基類型包括，MS、WPM、B5；激素6-BA設計3種不同質量濃度(0.3、0.5和0.8 mg/L)，激素NAA設計3種不同質量濃度(0.02、0.05、0.10 mg/L)(表1)。每種處理接種6～10個外植體，每個處理重復3次。2周后觀察并記錄不定芽的生長狀況。

表1 不同培養(yǎng)基及激素配比對大青楊葉片不定芽誘導情況

注：表中同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

不定芽增殖：依據不定芽增殖(表2)在MS和WPM分別加入質量濃度為0.05、0.06、0.08、0.10 mg/L 6-BA和0.01、0.02、0.03、0.04 mg/L NAA(培養(yǎng)基類型為第一因素A、6-BA不同質量濃度為第二因素B、NAA不同質量濃度為第三因素C)配制培養(yǎng)基。將不定芽團接種于上述按照正交試驗設計的不同處理組合培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基放在3個不定芽增殖的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中接種2個不定芽團，置于組培室中進行培養(yǎng)。2周后觀察不定芽的增殖的情況。

表2 不同培養(yǎng)基及激素配比對大青楊不定芽增殖的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

叢生苗生根培養(yǎng)：將經過不定芽增殖培養(yǎng)的大青楊，用消毒后的剪子剪下，轉移到以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基并附加IBA和NAA 2種激素的培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基類型為第一因素A、IBA不同質量濃度為第二因素B、NAA不同質量濃度為第三因素C)(表3)，處理組合按照正交試驗設計實施，每個處理配制10瓶，在每瓶中接種3棵大青楊幼苗，置于組培室中進行培養(yǎng)，2周之后統計大青楊組培苗的生根數量。

數據統計與分析：采用EXECL進行數據整理和平均數的計算，采用SPSS 19.0軟件對試驗結果進行方差分析和多重比較分析，試驗數據為百分數，數據經過反正弦轉化后，進行方差分析和多重比較，篩選適合大青楊再生體系每個時期適宜的培養(yǎng)基和激素配比。

不定芽誘導率=(產生的不定芽的葉片數/接種的葉片總數)×100%；

生根率=(生根的組培苗數/全部的組培苗數)×100%。

表3 同培養(yǎng)基及激素配比對大青楊生根的影響

注：表中部分數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 大青楊葉片誘導不定芽組培體系

將帶有傷口的大青楊無菌苗葉片接種到三因素、三水平的正交試驗設計的培養(yǎng)基上，14 d后記錄觀察試驗結果(表1和圖1)，結果說明，9個試驗處理組合不定芽誘導率差異達到顯著水平(0.05水平)，其中L2、L4和L5組合最好，不定芽的誘導率達到100%。極差分析說明，NAA對大青楊葉片分化的影響最大，其次是6-BA，再次是培養(yǎng)基的種類。

方差分析(表4)說明，培養(yǎng)基種類激素6-BA、NAA等不同質量濃度對大青楊葉片分化誘導作用都有極顯著水平的差異。通過多重比較說明，在大青楊不定芽誘導中，NAA的影響大于培養(yǎng)基類型的影響，大于6-BA的影響。從分析結果來看A2B2C2最高，即大青楊葉片誘導不定芽生成的最佳培養(yǎng)基為WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。因為正交試驗組合中沒有出現在正交實驗表中，所以單獨將此組合單獨做一個試驗(圖2)。從培養(yǎng)結果來看，該組合培養(yǎng)出的不定芽翠綠，生芽率到達100%。

圖1 大青楊葉片不定芽誘導(組培14 d發(fā)芽的葉片)

表4 不同培養(yǎng)基及激素配比對大青楊葉片不定芽誘導的方差分析

變異系數來源平方和自由度均方F培養(yǎng)基類型3333．620021666．8148．986??6-BA質量濃度1924．22302962．1125．187??NAA質量濃度5947．159422973．58016．032??

注：** 表示在0.01水平差異顯著。

2.2 大青楊不定芽增殖培養(yǎng)體系的優(yōu)化

將分化14 d的叢生芽放入MS、WPM 2種不同培養(yǎng)基、添加不同質量濃度的6-BA和NAA的激素進行不定芽增殖培養(yǎng)，15 d后觀察不定芽數、測定苗高并進行方差分析，結果(表5)表明，不同質量濃度的NAA對苗高和出芽數的影響都達到了極顯著水平，而6-BA沒有作用，不同培養(yǎng)基對苗高的影響達到極顯著水平。培養(yǎng)中加入NAA能促進不定芽增殖，并且在每個組合中，NAA質量濃度為0.01時出芽數量最高。出芽數最多的是L1組合，平均苗高最高的是L14組合。從多重比較可以看出，L1與其他組合差異性顯著。綜上結果，在大青楊不定芽增殖培養(yǎng)基中，NAA的影響大于培養(yǎng)基類型的影響，大于6-BA的影響。大青楊不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，叢生苗粗壯且出芽較多，葉片嫩綠色。

圖2 WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA條件下不定芽誘導情況

表5 不同培養(yǎng)基及激素對大青楊不定芽增殖影響的方差分析

變異系數來源因變量離差平方和自由度均方F值培養(yǎng)基出芽數量23．8331 3．0001．027苗 高487．3581487．3587．341??6-BA質量濃度出芽數量19．66736．5562．244苗 高86．229328．7431．183NAA質量濃度出芽數量53．500317．8336．106??苗 高992．6763330．8926．131??

注：** 表示在0.01水平差異顯著。

2.3 大青楊生根體系的優(yōu)化

在MS、1/2MS培養(yǎng)基及不同質量濃度的IBA、NAA對大青楊試管苗生根誘導15 d觀察結果表明，L1 1/2MS+0.1 mg/L IBA的生根最好，平均生根數最高，達到7根。各個組合根生長情況(圖3)中可以發(fā)現,L1、L2、L5、L6都長出須根且根健壯。加入NAA的L3、L4、L7、L8產生黃色愈傷小塊或產生輻射性的短根。方差分析(表6)說明，激素類型極顯著影響組培苗生根，IBA能促進試管苗須根的形成，而NAA對管苗根的形成沒有作用。在大青楊生根培養(yǎng)中，激素類型的影響大于培養(yǎng)基類型的影響。綜上分析，最適合大青楊組培苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L IBA。

圖3 大青楊生根培養(yǎng)

變異來源平方和自由度均方F培養(yǎng)基類型 0．7381 0．7380．132 激素類型649．6983216．56638．726??

注：** 表示在0.01水平下差異顯著。

2.4 移栽煉苗

大青楊生根苗經煉苗后移栽至由V(草泥炭)∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)=3∶1∶1的混合基質中，30 d后幼苗開始長出新葉，根系牢固，長成成苗(圖4)。

3 結論與討論

組織培養(yǎng)方法的優(yōu)化是基因工程育種的基礎例如抗除草劑玉米[8]、抗蟲楊樹[9-10]等轉基因新品種或新品系的獲得，都是建立在一個行之有效的組培優(yōu)化體系基礎上。

雖然早在20世紀30年代，國外就開始了對楊屬植物組織培養(yǎng)的研究[11]，我國于20世紀70年代對楊屬植物進行組織培養(yǎng)研究，分別開展了。小葉楊(PopulussimoniiCarr)、小黑楊(Populussimonii×Populusnigra)、青楊(PopuluscathayanaRehd.)等楊樹離體花藥培養(yǎng)研究[12]。近年來對青楊派植物組織培養(yǎng)的研究也取得了不少進展，李開隆[13]對香楊(Populuskoreana)的頂芽和腋芽進行組織培養(yǎng)和植株研究。李世承以大青楊嫩葉、新梢為材料進行植物組織培養(yǎng)。靳春蓮建立大青楊組培體系。這些為大青楊的研究奠定了重要的基礎，但對于大青楊再生體系優(yōu)化研究還未有。組培體系的再生效率也亟需提高。

圖4 大青楊生根苗移栽效果

在大青楊再生體系優(yōu)化中，外源激素的配比和培養(yǎng)基類型對植物的生長發(fā)育影響較大。本實驗中6-BA和NAA之間的質量濃度配比與培養(yǎng)基類型不同對不定芽分化、不定芽增殖的誘導率和出芽數影響不同。從不定芽分化實驗中可以發(fā)現，培養(yǎng)基類型不同，組培苗所呈現出來的狀態(tài)不同(表1，圖1)，加入MS培養(yǎng)基中的芽的狀態(tài)呈現乳白色并且稀疏，而其他兩種類型培養(yǎng)基在分化中，葉片愈傷部位首先出現黃色愈傷小塊，其后在愈傷小塊上長有芽點。在不定芽誘導過程中，通過不定芽誘導體系進行直觀分析得出WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA有助于大青楊分化(表1，圖1)。隨后的驗證實驗中，證實了此組合出芽率為100%，芽點翠綠(圖2)。章林[14]在對銀中楊的組培研究中也發(fā)現，在質量濃度為0.5 mg/L 6-BA時，促進嫩芽的分化和生長，且達到最高的分化率。在不定芽增殖過程中，杜曉艷[15]等發(fā)現6-BA是適合青楊不定芽誘導分化的細胞分裂素，但是不定芽的質量下降，當6-BA質量濃度達到0.2 mg/L時出現了明顯的苗徒長，莖細長現象。當NAA質量濃度達到0.1 mg/L時，不定芽發(fā)生黃化死亡現象，所以低濃度的NAA有助于青楊生長發(fā)育。所以，本研究試驗設計中激素濃度都在此濃度最高值以下。實驗結果說明，大青楊葉片在MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA處理中培養(yǎng)出來的莖較嫩、較多，此處理是最高效的處理組合。IBA和NAA為最常用于木本植物生根的激素，結合本試驗研究，發(fā)現楊樹最基本的培養(yǎng)基為MS和1/2MS。在生根培養(yǎng)試驗組合中，1號組合(1/2MS+0.1 mg/L IBA)對大青楊的生根最有利，且苗的長勢較好，根系較為發(fā)達，葉片綠，莖段粗壯(表6，圖3)。同時發(fā)現加入低質量濃度的IBA有助于大青楊的生根，加入NAA發(fā)現產生氣生根和愈傷小塊，不利于大青楊的生根培養(yǎng)。尤其是在對大青楊遺傳轉化過程，較多的根有利于植物篩選過程的培養(yǎng)，以及后期移栽過程中對充足養(yǎng)分的吸收。另外，本研究采用葉片作為外植體[17]材料，其便于裁剪，接觸光的面積大，也便于農桿菌充分高效地侵染。所以，本研究優(yōu)化的高效再生體系能為大青楊的遺傳轉化奠定良好的基礎。

[1] 蘇曉華，黃秦軍，張香華，等.中國大青楊基因資源研究[J].林業(yè)科學研究，2001，14(5)：472-478.

[2] 劉玉庭，方旭東.黑龍江省林區(qū)大青楊培育的研究[J].林業(yè)勘查設計，2001(3)：37-38.

[3] 張美玲,陳洪偉,王紅利，等.植物遠緣雜交育種現狀與展望[J].安徽農業(yè)科學,2015,43(1):11-17.

[4] 何承忠，張有慧，馮夏蓮，等.我國青楊派楊樹基因資源及其遺傳育種研究進展[J].西北林學院學報，2005，20(2)：124-129.

[5] 于志水，金紅，苘勝軍，等.黑楊派楊樹組培再生系統的研究[J].遼寧林業(yè)科技，2002(6)：11-13.

[6] 李世承，李晶，佟鳳琴，等.山楊、大青楊、毛白楊組織培養(yǎng)的研究[J].遼寧大學學報(自然科學版)，1995，22(2)：59-62.

[7] 郭斌，游陽，季樂翔，等.美洲黑楊與大青楊雜種無性系離體培養(yǎng)和葉片再生體系的建立[J].中國農學通報，2011，27(25)：13-19.

[8] 孫越，劉秀霞，李麗莉，等.兼抗蟲、除草劑、干旱轉基因玉米的獲得和鑒定[J].中國農業(yè)科學，2015，48(2)：215-228.

[9] 郭同斌，嵇保中，諸葛強，等.轉Bt基因楊樹(NL-80106)對楊小舟蛾抗蟲性研究[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版)，2004，28(6)：5-9.

[10] 魏振.楊樹抗蟲性研究進展[J].中國森林病蟲,2007,26(1):25-28.

[11] 朱大保.國外楊樹組培微繁技術的進展[J].北京林業(yè)大學學報,1990,12(1):84-91.

[12] 欒鹖慧,蘇曉華,張冰玉，等.楊屬(PopulusL.)種質資源遺傳學評價研究進展[J].植物學報,2011,46(5):586-595.

[13] 李開隆，靳春蓮，李明德，等.香楊的組織培養(yǎng)和植株再生[J].植物生理學通訊，2009，45(3)：281.

[14] 章林，陳建軍，陸志民，等.銀中楊組培快繁技術的研究[J].吉林林業(yè)科技，2003，32(3)：7-10.

[15] 杜曉艷，韓素英，梁國魯，等.青海青楊高效再生體系的建立[J].林業(yè)科學研究，2011，24(6)：701-706.

OptimizingPopulusussuriensisRegeneration System//

Jiang Yang, Liu Huanzhen, Li Kailong(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(4)：28-32.

By orthogonal experiments, we studied the effects of different media and different hormone combinations on the regeneration system ofPopulusussuriensisleaves, and optimized the regeneration system. The concentration of NAA had the strongest inducing effect on adventitious buds, types of culture medium had the moderate, concentration of 6-BA had the weakest induding effect. The effects of concentration of NAA during proliferation of adventitious buds was more than types of culture medium, and more than concentration of 6-BA. The effect of hormone was more than culture medium type during rooting. The types of culture medium and the concentration of hormone had significant effect on the regeneration system. The most suitable medium for differentiation of adventitious buds was WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA, with the inducing rate of 100%. The most suitable medium for buds proliferation was MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA, and the plantlets were healthy. The most suitable medium for rooting was 1/2 MS+0.1 mg/L IBA with the rooting rate of 100%.

PopulusussuriensisKom.; Regeneration system; Medium; Orthogonal experimental design

姜洋，男，1991年4月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，碩士研究生。E-mail:395121052@qq.com。

李開隆，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，教授。E-mail:likailongnefu@sohu.com。

2016年11月21日。

Q943.1

1)“十三五”國家科技計劃課題(2016YFD0600404)。

責任編輯：潘 華。