酶解法提取紫甘薯多糖及其生物活性研究

吳遠耀，汪勁松，張新潮，王衛(wèi)東，潘繼承

(湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

酶解法提取紫甘薯多糖及其生物活性研究

吳遠耀，汪勁松，張新潮，王衛(wèi)東，潘繼承*

(湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

紫甘薯勻漿經(jīng)過木聚糖酶處理、熱水浸提、乙醇沉淀、除蛋白、脫色得到紫甘薯粗多糖，通過DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析得到4種多糖組分，并對其抗氧化活性進行了研究。結(jié)果表明，采用木聚糖酶提取紫甘薯多糖的最適條件為：酶添加量0.02%、酶解時間60 min、酶解溫度55 ℃。紫甘薯多糖具有較好的抑制鄰苯三酚自氧化活性和清除·OH能力，是一種效果好、安全性高的新型天然抗氧化物質(zhì)。

酶解法；紫甘薯多糖；木聚糖酶；抗氧化活性

紫甘薯原產(chǎn)于美洲，生長環(huán)境寬泛、容易栽培。引種于日本的紫甘薯，其莖葉和根塊中除含有各種營養(yǎng)成分外，還含有豐富的花青素和多糖，紫甘薯水提液具有抗突變和抗氧化能力[1]。研究表明，紫甘薯根塊具有抗氧化和降血糖的作用，可用于預(yù)防心血管疾病和糖尿病，有治療肝功能障礙等保健功能[2]。多糖的生物活性是目前研究的熱點，如抗氧化、抗腫瘤、抗突變、抑菌等?，F(xiàn)今多糖的研究多集中在真菌、海洋植物和藥用植物上，對日常生活中的果蔬研究較少。由于紫甘薯為甘薯變種，目前大部分研究都圍繞甘薯進行[3]，對紫甘薯多糖研究較少。作者以紫甘薯為原料，利用木聚糖酶提取紫甘薯多糖，并研究了其相應(yīng)的生物活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮紫甘薯，市售。

木聚糖酶(酶活≥10 000U·g-1，生化級)，湖北匯特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

95%乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、98%濃硫酸，均為分析純。

ORION型pH計，TGL-16LA型高速冷凍離心機，GL-2M型冷凍離心機，BS-1E型振蕩培養(yǎng)箱，KDM型調(diào)溫電熱套，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 紫甘薯多糖的提取與分離純化

(1)將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫甘薯粉。

(2)酶處理紫甘薯粉。稱取5 g紫甘薯粉，加入40 mL蒸餾水調(diào)成勻漿，按一定比例加入木聚糖酶，于55 ℃、200 r·min-1恒溫搖床中培養(yǎng)1 h，于75 ℃恒溫水浴5 min讓酶失活[4]。

(3)酶解液離心取上清液，向其中加入3 倍體積的無水乙醇[5]，4 ℃過夜。

(4)離心，取沉淀，用蒸餾水溶解沉淀。

(5)脫蛋白。配制sevage溶液(氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比，下同)；按提取液∶sevage溶液=4∶1(體積比)加入sevage溶液脫蛋白，反復(fù)脫5次，每次30 min，充分振蕩，離心取上清液[6]。

(6)脫色。活性炭使用前烘干數(shù)天。將活性炭按3%的比例加入到提取液中，振蕩30 min，6 500 r·min-1離心10 min，反復(fù)脫2次至溶液透徹，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液(即粗多糖)，保存至4 ℃冰箱。

(7)采用DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析分離純化粗多糖。將適量處理好的DEAE-Cellulose裝柱，用pH值7.4、50 mmol·L-1的PBS緩沖液平衡。將粗多糖上樣，分別用0.3 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1、2 mol·L-1的NaCl溶液洗脫，流速控制為1.0 mL·min-1，每管收集10 mL。

1.2.2 清除羥基自由基能力的測定[7]

用FeSO4+H2O2產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，以氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示·OH的量。反應(yīng)液中加入多糖200 μL，加入H2O2啟動反應(yīng)，以不加多糖的反應(yīng)液為對照溶液。測510 nm處的吸光值，多糖對·OH的清除率按式(1)計算：

(1)

式中：A0為對照溶液的吸光值；A1為樣品溶液的吸光值。

1.2.3 多糖對鄰苯三酚自氧化的抑制作用的測定

取100μL多糖、1.8 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol·L-1，4 mmol·L-1EDTA，pH值8.2)和1.0 mL雙蒸水于反應(yīng)瓶中，25 ℃水浴保溫10 min，加入100μL鄰苯三酚(3 mmol·L-1)，混合后每隔30 s測325 nm處的吸光值A(chǔ)325，得出A325隨時間的變化曲線，以回歸方程的斜率作為鄰苯三酚的自氧化速率v(△A·min-1)。以不加多糖的反應(yīng)液為對照溶液。多糖對鄰苯三酚自氧化的抑制率按式(2)計算：

(2)

式中：v0、v1分別為對照溶液和樣品溶液的自氧化速率。

1.2.4 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定。標準曲線的繪制：稱取恒重的無水葡萄糖0.5 g，溶于500 mL雙蒸水中，配制1.0 g·L-1的葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加蒸餾水補足至1 mL，分別加入5%苯酚1 mL混勻，再加入濃硫酸5 mL，振蕩混勻放置30 min。以蒸餾水作為空白對照。以波長490 nm處的吸光值為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 木聚糖酶添加量對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響

分別將0.02%、0.06%、0.10%的木聚糖酶添加到紫甘薯勻漿中，固定酶解溫度為55 ℃、酶解時間為60 min，考察木聚糖酶添加量對紫甘薯多糖得率(以提取液總糖濃度表示，下同)和·OH清除率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶添加量對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響

由圖1可以看出，隨著酶添加量的增大，多糖得率(總糖濃度)和酶添加量不呈線性關(guān)系。酶添加量為0.02%時，多糖得率最高；在0.02%～0.06%酶添加量范圍內(nèi)，隨著酶添加量增大，多糖得率反而明顯降低；在0.06%～0.10%酶添加量范圍內(nèi)，隨著酶添加量增大，多糖得率上升，這可能是由于可溶性多糖含量相應(yīng)增加。但是隨著酶添加量增大，多糖清除·OH能力下降。這可能是由于具有清除·OH能力的多糖被木聚糖酶降解。

2.2 酶解時間對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響

固定酶解溫度為55 ℃、酶添加量為0.02%，考察酶解時間對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時間對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響

由圖2可以看出，隨著酶解時間的延長，多糖得率和·OH清除率逐漸上升；酶解60 min時，多糖得率和·OH清除率均達到最高；酶解時間超過60 min后，多糖得率和·OH清除率均開始下降。原因是，酶解時間太長，超過60 min后，木聚糖酶將粗多糖和木聚糖降解成更小的分子，多糖得率和清除·OH能力受到影響。

2.3 酶解溫度對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響

固定酶添加量為0.02%、酶解時間為60 min，考察酶解溫度對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對紫甘薯多糖得率和·OH清除率的影響

由圖3可以看出，隨著酶解溫度的升高，多糖得率和·OH清除率均上升；酶解溫度為55 ℃時，多糖得率和·OH清除率達到最高；酶解溫度超過55 ℃后，多糖得率和·OH清除率下降。

綜上，木聚糖酶處理紫甘薯勻漿提取紫甘薯多糖的最適條件為：木聚糖酶添加量0.02%、酶解時間60 min、酶解溫度55 ℃。

2.4 多糖的分離純化

將處理后的紫甘薯多糖粗提液經(jīng)DEAE-Cellulose陰離子交換柱分離純化，依次用0.3 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1、2 mol·L-1NaCl溶液洗脫收集組分，根據(jù)層析圖譜的出峰情況判斷所得多糖組分。

圖4為用苯酚-硫酸法檢測，以波長490 nm處吸光值為縱坐標、收集管數(shù)為橫坐標繪制的洗脫曲線。

由圖4可以看出，洗脫曲線有4個峰，收集相應(yīng)的組分，得到4個多糖組分，分別命名為PPSP Ⅰ、PPSP Ⅱ、PPSP Ⅲ、PPSP Ⅳ。

2.5 多糖抗氧化活性測定結(jié)果

2.5.1 對鄰苯三酚自氧化的抑制作用

以緩沖溶液為對照，比較紫甘薯多糖4個組分對鄰苯三酚自氧化的抑制作用，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，多糖PPSP Ⅰ、PPSP Ⅱ、PPSP Ⅲ、PPSP Ⅳ4個組分對鄰苯三酚自氧化的抑制率均超過40%，其中PPSP Ⅱ?qū)︵彵饺幼匝趸囊种坡蔬_到78%。表明紫甘薯多糖具有較好抗氧化的活性。

圖5 4種紫甘薯多糖組分和VC對鄰苯三酚自氧化的抑制率

2.5.2 清除羥基自由基能力

·OH是對機體危害最大的自由基。以消除Feton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH量為依據(jù)，判斷紫甘薯多糖的清除·OH活性。以緩沖溶液為空白對照，以維生素C(VC)為陽性對照，比較紫甘薯多糖4個組分和VC對·OH的清除率，結(jié)果見圖6。

圖6 4種紫甘薯多糖組分和VC對·OH的清除率

由圖6可以看出，4個多糖組分展現(xiàn)出不同的清除·OH能力，其中多糖PPSP Ⅰ的·OH清除率可達到VC清除率的一半。

2.5.3 多糖抗氧化性活性分析

紫甘薯多糖各組分對鄰苯三酚自氧化的抑制作用和清除·OH活性不同，PPSPⅡ?qū)︵彵饺幼匝趸囊种谱饔米顝?，PPSPⅠ對·OH的清除活性最強，所有組分都具有一定的抗氧化活性。導(dǎo)致紫甘薯多糖各組分抗氧化性不同的原因可能是多糖結(jié)構(gòu)不同，多糖鏈越長、空間結(jié)構(gòu)越緊密，多糖空間結(jié)構(gòu)展開需要溫度越高，而多糖空間結(jié)構(gòu)展開越多，抗氧化性越強。

3 結(jié)論

采用酶解法提取紫甘薯多糖，確定最佳提取工藝條件為：木聚糖酶添加量0.02%(酶活≥10 000 U·g-1)、酶解時間60 min、酶解溫度55 ℃。用DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析對紫甘薯多糖進行分離，得到了4種多糖組分。結(jié)果表明，紫甘薯多糖在體外具有清除·OH能力和抗氧化作用，為紫甘薯多糖保健品開發(fā)提供了依據(jù)。

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Enzymolysis Extraction of Polysaccharides from Purple Sweet Potato and Its Biological Activity

WU Yuan-yao，WANG Jing-song，ZHANG Xin-chao，WANG Wei-dong，PAN Ji-cheng*

(CollegeofLife，HubeiNormalUniversity，Huangshi435002，China)

Inthispaper，crudepolysaccharidesfrompurplesweetpotatowereobtainedbymeansofxylanasehydrolysis，hotwaterextraction，ethanolprecipitation，deproteinanddecolorization.ThefourpurepolysaccharideswereharvestedwithDEAE-Celluloseanionexchangechromatography.Inaddition，theirantioxidantactivitywasdiscussed.Theoptimalextractionconditionsofpolysaccharideswereasfollows:xylanasedosageof0.02%，enzymolysistimeof60min，enzymolysistemperatureof55 ℃.Polysaccharidesfrompurplesweetpotatoshowedhigherinhibitionactivityforpyrogallolauto-oxidationandscavengingrateon·OH，andtheycanbeusedaseffectiveandsafenaturalantioxidants.

enzymolysis;polysaccharidefrompurplesweetpotato；xylanase；antioxidantactivity

2016-12-17

吳遠耀(1988-)，男，湖北鄂州人，碩士研究生，研究方向：生物大分子，E-mail:741917544@qq.com；

潘繼承，教授，E-mail:992708747@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.012

O629.12

A

1672-5425(2017)03-0049-04

吳遠耀，汪勁松，張新潮，等.酶解法提取紫甘薯多糖及其生物活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(3)：49-52.