黃精炮制過程中甾體皂苷的變化研究

王倩++劉星++許敏++李海舟

摘要：目的甾體皂苷在炮制過程中發(fā)生的化學(xué)變化，目前很少有研究。本研究為進一步開發(fā)利用藥用植物中的甾體皂苷提供思路。方法從黃精中分離原料化合物薯蕷皂苷，用水合反應(yīng)釜模擬炮制過程對單體進行轉(zhuǎn)化，TLC確定完全轉(zhuǎn)化時的溫度與時間，運用正向和反向硅膠柱層析，分離2個主要化合物。結(jié)果通過LC-MS、NMR等波譜解析法，確定薯蕷皂苷在炮制過程中轉(zhuǎn)化為延齡草苷和薯蕷皂苷元。結(jié)論現(xiàn)代炮制研究對比了黃精炮制前后薯蕷皂苷的變化，本研究與以往黃精炮制不同，發(fā)現(xiàn)炮制過程中甾體皂苷確實發(fā)生了很重要的變化，生成次級苷和苷元。

關(guān)鍵詞：黃精；炮制；甾體皂苷；薯蕷皂苷

中圖分類號：R283文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2017）05-0072-04

[WT5HZ][JZ]Study on the Change of Steroidal Saponins in the Processing of Polygonatum

[WT5BZ][JZ]WANG Qian， LIU Xing， XU Min， LI Hai-zhou

[WT5"BX][JZ]（School of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， Yunnan）

[WTHZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To study the chemical changes of steroidal saponins in the process of Polygonatum and provide a way to further develop steroidal saponins in medicinal plants. Methods： Dioscin was isolated from Polygonatum sibiricum and hydration reactor simulation was used to concoct a process to transform monomer. The temperature and time of the complete conversion were determined by TLC. Two main compounds were separated by forward and reverse silica gel column chromatography. Results： By LC-MS and NMR wave spectrum analysis， dioscin was determined to be transformed into disogluside and diosgenin in the process of preparation. Conclusion： The changes of dioscin before and after the processing by present method are compared， different from traditional processing， and it is found that the steroidal saponins in the process has greatly changed， producing secondary glycosides and aglycones.

[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Polygonatum， preparation， steroidal saponins， dioscin

[JP2]甾體皂苷具有多種生物活性[1]，廣泛存在于單子葉植物的百合科、石蒜科、薯蕷科和蒺藜科等植物中；中藥有黃精、穿山龍、知母、麥冬、玉竹等。國內(nèi)早有以含甾體皂苷為主成分的中成藥應(yīng)用于臨床，如中藥制劑“心腦舒通”、“冠心寧”、“麥冬湯劑”等。黃精始載于《名醫(yī)別錄》，《中國藥典》2015版規(guī)定黃精為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Collet Hemsl、黃精Polygonatum sibiricum Red或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根莖[2]，最早我國唐朝的孫思邈在《千金翼方》中提到黃精“九蒸九曝”的炮制方法[3]，發(fā)生麥拉德反應(yīng)，產(chǎn)生有毒物質(zhì)5-羥甲基糠醛（5-HMF）[4]。黃精中含有多種甾體皂苷以薯蕷皂苷為主，用中藥材中單體轉(zhuǎn)化模擬炮制的研究報道還很少。分析炮制前后發(fā)生的化學(xué)變化，為研究甾體皂苷炮制理論和減毒增效機制的科學(xué)性提供實踐參考。[JP]

1儀器與材料

11儀器電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DF-35型粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司生產(chǎn)）；DK-8D型電熱恒溫水槽；Water purifier 實驗室專用超純水機；BS/BT系列電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)）；EYELAN-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司生產(chǎn)）；SK-2200HP型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)）；SHZ-D（III）型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；Bruker DRX-500，Bruker AM-400及AVANCEIII-600型超導(dǎo)核磁共振儀（Bruker BioSpin group，Germany）；API QSTAR TOF質(zhì)譜儀（Applied Biosystem Corporation，Canada）；JASCO DIP-370型數(shù)顯旋光儀（JASCO Co，Ltd，USA）測定旋光度；分析型HPLC為Agilent1200型高效液相色譜儀（Agilent Technologies Co，Ltd，USA）；色譜柱為ZORBAX SB-C18（Agilent，46×250 mm，1 mL/min）。[JP2]

12柱色譜材料薄層層析（TLC）正向硅膠板為G型和H型（青島海洋化工廠生產(chǎn)）；制備TLC采用G型薄層正向硅膠板（青島海洋化工廠生產(chǎn)）；[HJ2.3mm]拌樣硅膠80-100目，柱層析硅膠100-200目和200-300目（青島海洋化工廠生產(chǎn)）；反向填充材料 Lichroprep RP-18（40-63μm）；MCI填充材料MCI-gel CHP-20P（日本Mitsubishi化學(xué)公司生產(chǎn)）；ODS（YMC*Gel ODS-A，50μm，YMC CoLtdJapan）；MERCK Silica gel 60（MERCK，Darmstadt，Germany）；TLC顯色劑為5% H2SO4-EtOH溶液、A試劑（茴香醛/濃硫酸/乙醇=1∶[KG-*2]1∶[KG-*2]18，v/v）、Ehrlich試劑（對-二甲氨基苯甲醛∶[KG-*2]濃鹽酸∶[KG-*2]甲醇=1 g∶[KG-*2]35 mL∶[KG-*2]75 mL）[JP]

13試劑實驗用溶劑工業(yè)級甲醇、氯仿、二氯甲烷等，經(jīng)過重蒸后使用；分析純?yōu)樘旖蚧瘜W(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；色譜純甲醇、乙腈為德國Merck公司生產(chǎn)；超純水由實驗室純水系統(tǒng)ULUPURE HYRO-40系統(tǒng)獲得。

14材料黃精根莖于2015年8月采購于云南宣威，共10 kg。本樣品由昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李海舟教授鑒定為滇黃精Polygonatum kingianum CollEt Hemsl。樣品標(biāo)本現(xiàn)存放于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院藥物化學(xué)與生物學(xué)實驗室，標(biāo)本號為KMUST20150808。

2實驗方法

21目標(biāo)單體化合物薯蕷皂苷的分離純化

211分離純化取滇黃精干燥根莖5 kg，經(jīng)粉碎后用75%甲醇-水提取2次，每次24 h。將提取液合并，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到粗提物。用少量甲醇溶解，以80-100目硅膠拌樣，經(jīng)200-300目硅膠柱層析，用氯仿-甲醇（9：1，5：1，2：1，1：1，0：1）依次洗脫得到5個部分（Fr1-Fr5）。Fr1（10 g）經(jīng)反相硅膠柱層析ODS，用純水及20%，40%，60%，80%，100%甲醇-水依次洗脫得到單糖、呋甾和螺甾3個部分（Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3）。Fr1-3（52 g）經(jīng)YMC-ODS反相柱層析（20%-100%甲醇-水，梯度洗脫），分離純化得到目標(biāo)化合物薯蕷皂苷（20 g）。

212結(jié)構(gòu)鑒定薯蕷皂苷，白色無定形粉末，A試劑顯綠色，Ehrlich試劑不顯色，說明該化合物為螺甾烷型化合物。根據(jù)正離子ESI–MS給出[M+H]+峰，m/z869，結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)推出化合物分子式為C45H72O16。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ 530（1H，brd，J = 45 Hz，H-6），088（3H，s，H-18），106（3H，s，H-19），115（3H，d，J = 68 Hz，H-21），070（3H，d，J = 50 Hz，H-27），499（1H，d，J = 86 Hz，H-1′Glu），586，（1H，brs，H-1″Rha），164（3H，d，J = 62 Hz，H-6″Rha），641（1H，brs，H-1Rha），177（3H，d，J=61 Hz，H-6Rha）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ 372（C-1），294（C-2），767（C-3），380（C-4），1407（C-5），1217（C-6），314（C-7），313（C-8），500（C-9），368（C-10），208（C-11），394（C-12），402（C-13），562（C-14），319（C-15），806（C-16），622（C-17），164（C-18），194（C-19），415（C-20），150（C-21），1089（C-22），313（C-23），289（C-24），302（C-25），663（C-26），175（C-27），986（C-1′），774（C-2′），765（C-3′），772（C-4′），774（C-5′），605（C-6′），1009（C-1″），710（C-2″），708（C-3″），756（C-4″），691（C-5″），181（C-6″），1007（C-1），710（C-2），711（C-3），723（C-4），684（C-5），182（C-6）其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[5]基本一致，故確定化合物1為薯蕷皂苷（Dioscin）。

22薯蕷皂苷單體模擬炮制過程

221模擬炮制取薯蕷皂苷2 g，加少量甲醇和水60℃恒溫水浴鍋中溶解，配制成20 mg/mL的溶液。取30 mL溶液倒入水合反應(yīng)釜中，在鼓風(fēng)干燥箱中100℃反應(yīng)6 h，模擬炮制過程。

222水合反應(yīng)后分離純化將炮制后的轉(zhuǎn)化溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，稱量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。將17 g轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)反相硅膠柱層析ODS，用純水及30%，60%，90%，100%甲醇-水依次洗脫得到3個部分（Fr1、Fr2、Fr3）。Fr2經(jīng)500-600目硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇（100：1，50：1，40：1，30：1，20：1，10：1）依次梯度洗脫得到化合物2和化合物3。

223結(jié)構(gòu)鑒定化合物2，白色無定型粉末，A試劑顯綠色，Ehrlich試劑不顯色，說明該化合物為螺甾烷型化合物。ESI–MS：m/z 577[M+H]+；結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)推出化合物分子式為C33H52O8。1H NMR（600 MHz，in pyridine-d5）δH：064（3H，d，J=51 Hz，CH3-27），078（3H，s，CH3-18），090（3H，s，CH3-19），109（3H，d，J=69 Hz，CH3-21），503（1H，d，J=84 Hz），526（brs，H-6）。13C NMR（150 MHz，in pyridine-d5）δC：392（t，C-1），321（t，C-2），784（d，C-3），418（t，C-4），1408（s，C-5），1216（d，C-6），321（t，C-7），317（d，C-8），501（d，C-9），370（s，C-10），210（t，C-11），373（t，C-12），398（s，C-13），565（d，C-14），315（t，C-15），810（d，C-16），627（d，C-17），162（q，C-18），193（q，C-19），403（d，C-20），150（q，C-21），1091（s，C-22），301（t，C-23），291（t，C-24），305（d，C-25），667（t，C-26），172（q，C-27），1025（d，C-1′），753（d，C-2′），785（d，C-3′），716（d，C-4′），780（d，C-5′），627（t，C-6′）；其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[6，7，8]基本一致，故確定化合物2結(jié)構(gòu)為（25R）-spirost-5-en-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranoside，即延齡草苷（Trillin）。

化合物3，白色無定型粉末，A試劑顯綠色，Ehrlich試劑不顯色，說明該化合物為螺甾烷型化合物。ESI–MS：m/z 415[M+H]+；結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)推出化合物分子式為C27H42O3。1H NMR（600 MHz，in pyridine-d5），δH：358（1H，m，H-3），538（1H，d，J=47 Hz，H-6），375（1H，m，H-16），105（3H，s，H-18），131（3H，s，H-19），096（3H，d，J=71 Hz，H-21），356（2H，m，H-26），095（3H，d，J=63 Hz，H-27）；13C NMR（150 MHz，in pyridine-d5），δC：398（t，C-1），322（t，C-2），711（d，C-3），434（t，C-4），1419（s，C-5），1209（d，C-6），325（t，C-7），321（d，C-8），503（d，C-9），369（s，C-10），211（t，C-11），377（t，C-12），404（s，C-13），566（d，C-14），317（t，C-15），810（d，C-16），628（d，C-17），163（q，C-18），195（q，C-19），419（d，C-20），150（q，C-21），1092（s，C-22），305（t，C-23），291（t，C-24），316（d，C-25），667（t，C-26），172（q，C-27）；其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[9]基本一致，故確定化合物3結(jié)構(gòu)為（25R）-Spirost-5-en-3β-ol，即薯蕷皂苷元（Diosgenin）。

23黃精生藥材炮制

231炮制過程取200 g黃精切片（切片后可能會縮短炮制時間），用超聲波法，提取溶劑選擇75%乙醇，料液比15：1，PH=6的條件下超聲提取2 h。提取后的溶液過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干制成浸膏，稱取少部分浸膏，配成50 g/L的溶液，于水合反應(yīng)釜中在100℃鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)6h，進行炮制。

232炮制前后薯蕷皂苷的變化分析取炮制前后兩部分浸膏，HPLC檢測薯蕷皂苷的變化情況。色譜條件：C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水梯度洗脫；檢測波長：203 nm；柱溫：35℃；流速：10 mL/min。見圖1-5。

3結(jié)果討論

黃精中甾體皂苷單體化合物薯蕷皂苷，經(jīng)水合反應(yīng)模擬炮制過程，通過提取分離和LC-MS、NMR結(jié)構(gòu)鑒定，確定了HPLC圖譜顯示的薯蕷皂苷模擬炮制后新產(chǎn)生的兩個單體化合物分別是延齡草苷和薯蕷皂苷元?？梢娊?jīng)過炮制過程，結(jié)構(gòu)不同的甾體皂苷發(fā)生了轉(zhuǎn)化，薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化為次級苷和苷元。從藥材方面分析，通過HPLC圖譜比較，發(fā)現(xiàn)黃精飲片炮制前薯蕷皂苷含量很高，黃精飲片經(jīng)炮制，炮制后薯蕷皂苷含量微弱，另外兩種化合物延齡草苷和薯蕷皂苷元含量增大，說明薯蕷皂苷經(jīng)炮制后轉(zhuǎn)化成延齡草苷和薯蕷皂苷元。通過薯蕷皂苷單體模擬炮制前后變化與藥材中薯蕷皂苷的炮制前后變化，證明在黃精炮制過程中甾體皂苷發(fā)生了轉(zhuǎn)化，據(jù)此推測該化合物的變化可能與含薯蕷皂苷類中藥材的藥效和藥效成分有相關(guān)。

[FL）][HJ2.45mm][SD1，1][FQ（21*3。175mm，X，DY-W][SQ+1mm][CD=175mm]

[KG（0.1mm]本研究建立了一種以化繁為簡、模擬炮制、完全轉(zhuǎn)化、規(guī)律分析的方法，以解毒增效為指征，從化學(xué)成分改變研究著手，通過HPLC圖譜定性分析，驗證了薯蕷皂苷在炮制過程中的變化規(guī)律。通過對薯蕷皂苷炮制前后主要甾體皂苷類化學(xué)成分變化的定性分析，基本明確了其變化規(guī)律，以黃精炮制前后物質(zhì)基礎(chǔ)的變化為重點，進一步驗證藥材中化學(xué)成分變化規(guī)律與實驗結(jié)果預(yù)測相吻合。在今后甾體皂苷研究中，應(yīng)注重轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生物活性及作用機制方面，明確藥效部位，利用天然植物轉(zhuǎn)化有效成分開發(fā)新藥。與以往藥材飲片炮制方法相比，本研究更能貼近與飲片炮制前后化學(xué)成分的真實變化情況，同時用單體進行模擬轉(zhuǎn)化研究具有定向性、轉(zhuǎn)化條件具有可控性、方法簡單環(huán)保可行，進一步可產(chǎn)制加工一體化，為含甾體皂苷類中藥材深度研究提供實踐意義與理論參考。[KG）]

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