2，3-二芳基-1，3-苯并噁嗪的合成及對利什曼原蟲CYP51活性的初步研究

唐子龍, 韓新亞, 李新興, 許志峰, 萬義超

(1.湖南科技大學(xué) 理論有機化學(xué)與功能分子教育部重點實驗室， 湖南 湘潭 411201;2.華中師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 武漢 430079; 3.衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 湖南 衡陽 421002)

2，3-二芳基-1，3-苯并噁嗪的合成及對利什曼原蟲CYP51活性的初步研究

唐子龍1*, 韓新亞2, 李新興1, 許志峰3, 萬義超1

(1.湖南科技大學(xué) 理論有機化學(xué)與功能分子教育部重點實驗室， 湖南 湘潭 411201;2.華中師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 武漢 430079; 3.衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 湖南 衡陽 421002)

首次對2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1，3-苯并噁嗪(1)與利什曼原蟲CYP51的相互作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)化合物1對利什曼原蟲CYP51表現(xiàn)出較強的抑制活性，且作用方式類似于底物與利什曼原蟲CYP51的I型結(jié)合方式.該研究不僅發(fā)現(xiàn)了一種新型非唑類針對利什曼原蟲CYP51的抑制劑：1，3-苯并噁嗪，而且也為創(chuàng)制新型作用方式的CYP51抑制劑研究提供了依據(jù).

2，3-二芳基-1，3-苯并噁嗪； 利什曼原蟲； CYP51； 活性

1，3-苯并噁嗪衍生物是一類重要的含氮雜環(huán)化合物，具有抗癌[1-3]、抗血小板聚集[4]、抗細(xì)菌和真菌[5-6]、抗結(jié)核病[7-8]、殺蟲[9]等廣泛的生物活性[10-12].本課題組曾報道2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1，3-苯并噁嗪(1)具有良好的抑制水稻紋枯病菌的活性(100%，500 μg/mL)[13]，同時對蚜蟲也具有一定的活性[14].這里將報道化合物1(見圖1)對利什曼原蟲(Leishmania infantum)的殺蟲活性.文獻(xiàn)對1，3-苯并噁嗪類化合物的殺蟲活性雖有報道[9，14]，但是相對較少，特別是對利什曼原蟲的殺蟲活性還未見報道.利什曼原蟲是引起利什曼病的病原體.利什曼病的臨床特征主要表現(xiàn)為長期不規(guī)則的發(fā)熱、脾臟腫大、貧血、消瘦、白細(xì)胞減少和血清球蛋白的增加，如不予合適治療，患者大都在病后1～2 a內(nèi)因并發(fā)其他疾病而死亡.本病多發(fā)于地中海國家及熱帶和亞熱帶地區(qū)，大約危及世界上90多個國家[15]，我國主要發(fā)生在新疆、甘肅、四川、陜西、山西和內(nèi)蒙古等地區(qū).至今，利什曼病幾乎沒有防治的疫苗，只有少量中等治療效果的藥物.CYP51(甾醇14α-去甲基化酶)是生物甾醇合成過程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)其活性和功能受到抑制，就不能有效供給生物甾醇C-14α甲基羥基化所需氧原子，導(dǎo)致C-14α位去甲基化反應(yīng)受阻，生物甾醇合成減少或被完全阻斷，最后導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡[16-17].因此，利什曼原蟲所含CYP51成了化學(xué)藥物治療利什曼病的潛在靶標(biāo)[15].所以，為了尋找殺利什曼原蟲的高活性化合物，獲得治療利什曼病的高效藥物，本文研究了化合物1對利什曼原蟲CYP51的抑制活性以及二者的作用方式.

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of compound 1

1實驗部分

1.1儀器與試劑

NMR用Bruker Avance II-500 M核磁共振儀測定；紅外(IR)用PE-2000型傅里葉變換紅外光譜儀測定；熔點用WRS-1B數(shù)字熔點儀測定(未校正)；元素分析用PE 2400 II元素分析儀測定；質(zhì)譜使用Thermo Finnigan LCQ質(zhì)譜儀測定；雙光束紫外-可見分光光度計(Perkin Elmer，UV-Lambda35/*)；分析天平(Sartorius，BT25S)；移液器(eppendorf)；分子對接采用Sybyl-X1.3軟件.磷酸鉀鹽緩沖液和所用試劑或溶劑均為分析純或化學(xué)純.

1.2化合物1的合成[13]

將2-((對甲苯基氨基)甲基)苯酚(1.07 g， 5 mmol)與鄰硝基苯甲醛(0.98 g， 6.5 mmol)溶于三氯甲烷與環(huán)己烷的混合溶液中 (100 mL，V/V=1/7 )并加入到250 mL圓底三頸燒瓶中，加入含有四氯化錫(0.26 g， 20%mol)的三氯甲烷溶液，安裝分水器，通入氮氣，加熱回流5 h (TLC檢測)，反應(yīng)完后，加三乙胺調(diào)節(jié)體系的pH值等于8，然后加入100 mL乙酸乙酯，分別用水(50 mL×2次)與氯化鈉飽和溶液(50 mL×2次) 洗滌有機相，有機相用無水硫酸鈉干燥，減壓脫溶得黃色油狀物，用乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶得黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率80%.m.p. 152.6～153.0 ℃.

1H NMR (CDCl3， 500MHz，δ): 2.25 (s， 3H， CH3)， 4.00 (d，J=17.0 Hz， 1H， CH2)， 4.19 (d，J=17.0 Hz， 1H， CH2)， 6.85 (s， 1H， CH)， 6.86～6.89 (m， 1H)， 7.00～7.06 (m， 6H)， 7.17～7.20 (m， 1H)， 7.44～7.47 (m， 2H)， 7.61～7.64 (m， 1H)， 7.71～7.74 (m， 1H);13C NMR (CDCl3， 125MHz，δ): 20.74， 47.12， 85.52， 116.72， 120.45， 120.86 (2C)， 121.13， 124.45， 126.72， 128.41， 128.76， 129.21， 129.80 (2C)， 131.84， 132.76， 132.99， 146.74， 149.08， 152.60; IR (KBr， ν): 3 083，3 021，2 972，2 920，1 610，1 585，1 530，1 513，1 486，1 456，1 437，1 386，1 363，1 337，1 292，1 276，1 268，1 224，1 198，1 144，1 109，1 034，1 024，1 015，978，961，935，852，839，820，782，757，736，714 cm-1; MS (ESI): 347 [M+H]+; Anal Calcd for C21H18N2O3: C 72.82; H 5.24; N 8.09. Found: C 73.11; H 5.26; N 8.05．

1.3化合物1與利什曼原蟲CYP51結(jié)合光譜實驗[17]

稱取適量質(zhì)量的化合物1，使用DMSO將其溶解配成0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L，2 mmol/L，5 mmol/L濃度梯度的化合物1儲液備用.使用磷酸鉀緩沖液將利什曼原蟲CYP51稀釋到2 μmol/L，并將其分別加入實驗組和對照組的石英比色皿中進(jìn)行基線校準(zhǔn).然后使用移液器，每次加入1 μL適當(dāng)濃度的化合物1，常溫反應(yīng)3 min后掃描記錄光譜吸收，重復(fù)上述操作直至隨著化合物1的加入吸收光譜沒有明顯變化為止.結(jié)合常數(shù)Kd由Ifree(自由化合物濃度)與ΔA(吸光度差值)擬合得到的logistic回歸方程求出，[Ifree]=[Itotal]-E×ΔA/ΔAmax；其中，[I]和[E]是滴定體系中的化合物1的濃度和利什曼原蟲CYP51的濃度，ΔA是給定化合物濃度下光譜波峰與波谷吸收值之間的差值，ΔAmax是飽和狀態(tài)下的ΔA.

1.4化合物1與利什曼原蟲CYP51分子對接[15]

選擇利什曼原蟲CYP51的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3L4D)為模板，在Sybyl-X1.3中對其進(jìn)行加氫處理.使用Sybyl-X1.3構(gòu)建化合物1并對其進(jìn)行力場和電荷優(yōu)化，使用Surflex-Dock模塊將化合物1對接到利什曼原蟲CYP51的晶體結(jié)構(gòu)中，綜合考慮化合物1和利什曼原蟲CYP51的結(jié)構(gòu)信息以及對接打分，選擇出化合物1與利什曼原蟲CYP51可能的結(jié)合方式.

2結(jié)果與討論

2.1化合物1與利什曼原蟲CYP51結(jié)合光譜

[17]，以藥物酮康唑(CYP51抑制劑)為對照樣品，考察了化合物1與利什曼原蟲CYP51的結(jié)合能力.結(jié)合光譜實驗表明，隨著滴定濃度的增加，化合物1與利什曼原蟲CYP51呈現(xiàn)明顯的結(jié)合，表現(xiàn)在約394 nm處有波峰，430 nm處出現(xiàn)波谷，是細(xì)胞色素P450的典型I型結(jié)合光譜(圖2).可能的原因是化合物1與利什曼原蟲CYP51的結(jié)合使得卟啉環(huán)中的鐵原子由原來的6配位變成了5配位的高自旋狀態(tài)，最高吸收峰藍(lán)移形成I型結(jié)合光譜.這種類似于底物與利什曼原蟲CYP51的I型結(jié)合光譜，既為發(fā)現(xiàn)新型作用方式的CYP51抑制劑提供了參考，也將為非唑類CYP51抑制劑的研發(fā)提供依據(jù).目前，使用的唑類藥物多為CYP51抑制劑，它們與CYP51的結(jié)合光譜通常表現(xiàn)為II型結(jié)合，而且由于唑類藥物的長期使用，已有不少藥物產(chǎn)生抗性[18].解決這一問題的方法之一，就是創(chuàng)制具有新型作用方式的CYP51抑制劑或非唑類CYP51抑制劑.

圖2 化合物1與利什曼原蟲CYP51結(jié)合光譜Fig.2 Difference spectra obtained with compound 1 and L. infantum CYP51

為了具體評價化合物1的結(jié)合能力，測定了化合物1與利什曼原蟲CYP51的結(jié)合常數(shù)Kd.如圖3所示，以反應(yīng)體系中游離化合物1的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度差值ΔA為縱坐標(biāo)，擬合得到化合物1與利什曼原蟲CYP51的結(jié)合常數(shù)Kd=7.7±1.4 μM，表明化合物1具有較強的結(jié)合能力(酮康唑：Kd=0.05±0.002μM).

圖3 化合物1飽和滴定曲線(X軸代表自由化合物1濃度(Ifree)，Y軸代表吸光度差值ΔA)Fig.3 Compound 1 binding saturation curve(The X-axis represents the concentration of the unbound compound 1 (Ifree); the Y-axis represents absorbance difference ΔA)

2.2化合物1與利什曼原蟲CYP51結(jié)合方式

為了探究化合物1與利什曼原蟲CYP51可能的結(jié)合方式，將化合物1對接到利什曼原蟲CYP51的活性空腔內(nèi)[15]，綜合考慮打分以及化合物1和利什曼原蟲CYP51活性空腔結(jié)構(gòu)信息，選擇了如圖4所示的化合物1與利什曼原蟲CYP51的結(jié)合構(gòu)象.從這個構(gòu)象中可以看出，利什曼原蟲CYP51的活性空腔是較為疏水的，化合物1中帶硝基的苯環(huán)與V460、L355有疏水相互作用；帶甲基的苯環(huán)伸向了F109、A286、F104和F289形成的疏水口袋；苯并噁嗪環(huán)所含苯基與F289形成π-π相互作用.

圖4 化合物1與L. infantum CYP51可能的結(jié)合模式圖Fig.4 Possible complex of compound 1 and L. infantum CYP51

3結(jié)論

合成了2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1，3-苯并噁嗪1.初步研究了化合物1對利什曼原蟲CYP51的抑制活性，結(jié)果表明化合物1不僅對利什曼原蟲CYP51表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力，且為類似于底物與利什曼原蟲CYP51的I型結(jié)合方式，因此該研究不僅發(fā)現(xiàn)了一種新型非唑類針對利什曼原蟲CYP51的抑制劑：1，3-苯并噁嗪，也為發(fā)現(xiàn)新型作用方式的CYP51抑制劑研究提供了參考.

參考文獻(xiàn)：

[1] WANG S， LI Y， YOU Q， et al. Novel hexacyclic camptothecin derivatives. Part 1: Synthesis and cytotoxicity of camptothecins with an a-ring fused 1，3-oxazine ring [J]. Bioorg Med Chem， 2008， 18: 4095-4097.

[2] CHEN S， LI X， WAN S， et al. Synthesis of novel benzoxazinone compounds as Epidermal growth factor receptor (EGRF) Tyrosine kinase inhibitors [J]. Synth Commun， 2012， 42: 2937-2946．

[3] BENAMEUR L， BOUAZIZ Z， NEBOIS P， et al. Synthesis of furonaphth[1，3]oxazine and furo[1，3]oxazinoquinoline derivatives as precursors for an o-quinonemethide structure and potential antitumor agents [J]. Chem Pharm Bull， 1996， 44: 605-608．

[4] IHMAID S K， AI-RAWI J M A， BRADLEY C J， et al. Synthesis， DNA-PK inhibition， anti-platelet activity studies of 2-(N-substituted-3-aminopyridine)-substituted-1，3-benzoxazines and DNA-PK and PI3K inhibition， homology modelling studies of 2-morpholino-(7，8-di and 8-substituted)-1，3-benzoxazines [J]. Eur J Med Chem， 2012， 57: 85-101．

[5] TANG Z， XIA Z， CHANG S， et al. Synthesis and fungicidal activity of novel 2-aryl-3-(1，3，4-thiadiazolyl)-6(8)-methyl-1，3-benzoxazines [J]. Bioorg Med Chem Lett， 2015， 25: 3378-3381．

[6] KONDA S， RAPARTHI S， BHASKAR K， et al. Synthesis and antimicrobial activity of benzoxazine sulfonamide derivatives [J]. Bioorg Med Chem Lett， 2015， 25: 1643-1646．

[7] NEMECEK P， MOCAK J， LEHOTAY J， et al. Prediction of anti-tuberculosis activity of 3-phenyl-2H-1，3-benzoxazine-2，4(3H)-dione derivatives [J]. Chem Papers， 2013， 67: 305-312.

[8] WAISSER K， PETRLIKOVA E， PERINA M， et al. A note to the biological activity of benzoxazin derivatives containing the Thioxo Group [J]. Eur J Med Chem， 2010， 45: 2715-2719．

[9] SHAKIL N A， PANDEY A， SINGH M K， et al. Synthesis and bioefficacy evaluation of new 3-substituted-3，4-dihydro-1，3-benzoxazines [J]. J Environ Sci Health B: Pestic， 2010， 45(2): 108-115．

[10] PASTERNAK A， GOBLE S D， STRUTHERS M， et al. Discovery of a potent and orally bioavailable CCR2 and CCR5 dual antagonist [J]. ACS Med Chem Lett， 2010， 1: 14-18．

[11] GARG V， KUMAR A， CHAUDHARY A， et al. Synthesis， biological evaluation and molecular docking studies of 1，3-benzoxazine derivatives as potential anticancer agents [J]. Med Chem Res， 2013， 22: 5256-5266．

[12] COBURN C A， MEINKE P T， CHANG W， et al. Discovery of MK-8742: an HCV NS5a inhibitor with broad genotype activity [J]. Chem Med Chem， 2013， 8: 1930-1940．

[13] TANG Z， CHEN W， ZHU Z， et al. Synthesis of 2，3-diaryl-3，4-dihydro-2H-1，3-benzoxazines and their fungicidal activities [J]. J Heterocyclic Chem， 2011， 48: 255-260．

[14] 唐子龍， 焦文杰， 陳衛(wèi)文， 等. 1，3-苯并噁嗪衍生物的合成及其殺蟲活性 [J].華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2014， 48(5): 677-683．

[15] HARGROVE T Y， WAWRZAK Z， LIU J， et al. Substrate preferences and catalytic parameters determined by structural characteristics of sterol 14 α-demethylase (CYP51) from Leishmania infantum [J]. J Biol Chem， 2011， 286: 26838-26848．

[16] 楊姣艷， 廖明軍， 楊 劭. 甾醇14α-去甲基化酶 (CYP51) 的研究進(jìn)展 [J]. 生物工程學(xué)報， 2008， 24(10): 1681-1688．

[17] WARRILOW A G S， MARTEL C M， PARKER J E， et al. Azole binding properties of Candida albicans sterol 14-α demethylase (CaCYP51)[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2010， 54(10): 4235-4245．

[18] CHAI X， ZHANG J， CAO Y， et al. New azoles with antifungal activity: Design， synthesis， and molecular docking [J]. Bioorg Med Chem Lett， 2011， 21: 686-689．

Synthesis of 2,3-diaryl-1,3-benzoxazine and preliminarystudies on its activity againstLeishmaniainfantumCYP51

TANG Zilong1, HAN Xinya2, LI Xinxing1, XU Zhifeng3, WANG Yichao1

(1.Key Laboratory of Theoretical Organic Chemistry and Functional Molecule of Ministry of Education,Hunan University of Science and Technology, Xiangtan, Hunan 411201;2. School of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079;3.School of Chemistry and Material Science, Hengyang Normal University, Hengyang, Hunan 421002)

The interaction of 2-(2-nitrophenyl)-3-(4-methylphenyl)-1,3-benzoxazine (1) andLeishmaniainfantumCYP51 was preliminarily investigated for the first time. The results indicated that compound 1 exhibited relatively strong inhibitory activity with I type mode of action similar to the model between the substrate andLeishmaniainfantumCYP51. The study has not only discovered a new kind of non-azole inhibitor (1,3-benzoxazine) againstLeishmaniainfantumCYP51, but also provided experimental basis for the discovery of new CYP51 inhibitory with new mode of action.

2,3-diaryl-1,3-benzoxazine;Leishmaniainfantum; CYP51; activity

2016-09-28.

國家自然科學(xué)基金項目(21372070)；國家科技支撐計劃項目子課題(2011BAE06B01)；理論有機化學(xué)與功能分子教育部重點實驗室開放基金項目(LKF1402).

1000-1190(2017)01-0052-04

O626

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: zltang67@aliyun.com.