保加利亞乳桿菌D-乳酸脫氫酶同工酶基因在大腸桿菌中的表達

黃艷娜,劉振民,游春蘋

(乳業(yè)生物技術國家重點實驗室,上海乳業(yè)生物工程技術研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

保加利亞乳桿菌D-乳酸脫氫酶同工酶基因在大腸桿菌中的表達

黃艷娜,劉振民,游春蘋*

(乳業(yè)生物技術國家重點實驗室,上海乳業(yè)生物工程技術研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

通過對保加利亞乳桿菌ATCC11842的D-乳酸脫氫酶基因的克隆,分離獲得了ldb0101、ldb0813、ldb1010、ldb1147和ldb2021五種同工酶基因,并分別構建重組質粒轉化大腸桿菌JM109,實現(xiàn)D-LDH同工酶基因的表達。結合重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵實驗和D-乳酸的合成,初步確定D-乳酸脫氫酶Ldb0101和Ldb1010在保加利亞乳桿菌中對D-乳酸的合成起著重要的作用。

保加利亞乳桿菌,D-乳酸脫氫酶,D-乳酸,基因克隆表達

保加利亞乳桿菌是乳酸菌家族中的重要一員,作為發(fā)酵劑而被廣泛應用于食品工業(yè)中[1-2]。眾所周知,保加利亞乳桿菌以合成D-乳酸為主,基本不合成L-乳酸[3-6]。有研究表明,D-乳酸脫氫酶(D-LDH)和L-乳酸脫氫酶(L-LDH)分別來自兩個完全不同的家族,因此二者的蛋白序列同源性較低,僅有27%～37%[7]。van de Guchte等報道了保加利亞乳桿菌中存在五種D-乳酸脫氫酶同工酶(Ldb0101,Ldb0813,Ldb1010,Ldb1147,Ldb2021)[8],但對其功能特性沒有做詳細的說明。而目前對L.bulgaricusD-DLH的報道多集中于對其蛋白結構的研究。如Holton等研究了Ldb1010酶的蛋白構象[7];Bernard等將L.bulgaricus的D-乳酸脫氫酶基因ldhA在E.coli中表達,結果表明該酶與L.caseiD-HicDH同源[9];另外,Razeto報道了L.bulgaricusD-LDH(同Ldb0101)的閉合域、底物特異性和催化活性[10]。而目前對其他D-LDH同工酶的功能與特性未見報道,且對負責L.bulgaricusD-乳酸合成的關鍵酶尚無明確的結論。因此,本研究的開展將有助于了解L.bulgaricus不同D-乳酸脫氫酶同工酶催化合成D-乳酸的能力,為該酶的利用或菌種的分子改造提供依據(jù)。

重組DNA技術是目前酶學研究的常用手段[11-12]。為了解保加利亞乳桿菌中不同D-LDH同工酶的功能特性,本研究以Lactobacillusdelbrueckiispp.bulgaricusATCC11842(以下簡稱L.bulgaricusATCC11842)為研究對象,以其基因組DNA為模板,克隆其五種D-LDH同工酶基因,以pUC18為表達載體,在大腸桿菌中過量表達,通過搖瓶發(fā)酵實驗研究該酶催化合成D-乳酸的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌JM109 本實驗室保存,L.bulgaricusATCC11842 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC);表達載體pUC18 寶生物工程大連有限公司。

限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶,dNTP Mixture、預染低分量蛋白Marker,DNA Marker和凝膠回收試劑盒 寶生物工程大連有限公司;細菌基因組提取試劑盒和質粒提取試劑盒 天根北京有限公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳相關試劑、硫酸卡那霉素和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 生工生物工程上海股份有限公司;引物設計與DNA測序分析 上海生工生物工程有限公司。

表1 引物設計

MRS培養(yǎng)基(Oxid,Hampshire,England)用于保加利亞乳桿菌的培養(yǎng);LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L)用于大腸桿菌及其重組菌的培養(yǎng)。

重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基采用M9培養(yǎng)基。將LB活化后的重組菌按照2%的接種量接種于M9培養(yǎng)基中添加終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素,37 ℃搖床220 r/min微好氧培養(yǎng)20 h,測定D-乳酸和L-乳酸的合成。

Biophotometer Plus核酸蛋白測定儀 德國艾本德股份公司;5424R臺式離心機 德國艾本德股份公司;Nanodrop 2000C微量分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司;MIR-154恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋電器集團;MB-102恒溫震蕩金屬浴 杭州博日科技有限公司;Proflex PCR儀 美國ABI公司;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因克隆 參照細菌基因組提取試劑盒所述抽提保加利亞乳桿菌基因組。根據(jù)Genbank中公布的L.bulgaricusATCC11842D-乳酸脫氫酶的基因序列(ldb0101,ldb0813,ldb1010,ldb1147和1db2021),設計特異性引物(表1)。PCR擴增條件為:94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸l min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組質粒的構建 分別將PCR產(chǎn)物和載體pUC18按表1所示進行限制性內切酶雙酶切,膠回收純化后,采用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物熱激轉化到E.coliJMl09感受態(tài)細胞,37 ℃復蘇1 h后涂布終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB平板,培養(yǎng)12 h后,挑單菌落至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)10 h,進行菌液PCR驗證,并送生工生物工程上海股份有限公司測序。對重組菌進行質粒抽提,限制性內切酶雙酶切驗證,

1.2.3 目的基因在大腸桿菌中的表達 將過夜培養(yǎng)的重組菌按照1%的接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)期前期,添加終濃度為0.5 mmol/L IPTG進行誘導,誘導時間為4 h,以空質粒重組菌和未誘導重組菌為對照,收集菌體進行全細胞聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.2.4 菌體濃度的測定 菌體濃度采用濁度法測量。將新鮮培養(yǎng)的菌液適當稀釋后,采用Eppendorf Biophotometer Plus核酸蛋白測定儀測定細胞濃度(OD600)。

1.2.5 乳酸的測定 分別將新鮮培養(yǎng)的重組大腸桿菌的種子按照2%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL藍口瓶中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h,發(fā)酵液于4 ℃,12000 r/min離心10 min,收集上清。稀釋到適當濃度后,采用D-乳酸和L-乳酸檢測試劑盒(Megazyme international Ireland)測定D-乳酸和L-乳酸的濃度。

1.2.6 質粒穩(wěn)定性實驗 根據(jù)菌體OD600將培養(yǎng)液樣品稀釋至10-6～10-7,涂在不含氨芐青霉素抗性的LB平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,待長出菌落后,將單菌落分別接種于LB抗性平板上(含100 μg/mL氨芐青霉素抗性),37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜,統(tǒng)計菌落數(shù),其中以菌落數(shù)/接種菌落數(shù)的比值為該質粒的穩(wěn)定性。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 搖瓶發(fā)酵實驗中每個菌株設置三次生物學重復,每個實驗重復三次,采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結果與討論

2.1D-乳酸脫氫酶的基因克隆

以保加利亞乳桿菌基因組為模板,以表1所示為引物,PCR擴增D-乳酸脫氫酶同工酶基因。瓊脂糖凝膠電泳均獲得特異大小的條帶(圖1),測序得到該片段長度為1152 bp,并與Genbank的L.bulgaricusATCC11842的ldb0101(CAI96942.1,1002 bp)、ldb0813(CAI97635.1,969 bp)、ldb1010(CAI97812.1,1002 bp)、ldb1147(CAI97949.1,957 bp)和ldb2021(CAI98759.1,1047 bp)基因序列完全一致,證明克隆的基因正確。

圖1 D-乳酸脫氫酶基因PCR擴增電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of D-lactate dehydrogenase genes注：M:Marker;1,ldb0101;2,ldb0813; 3,ldb1010;4,ldb1147;5,ldb2021。

2.2 表達D-乳酸脫氫酶基因的重組大腸桿菌的構建

對重組菌進行質粒抽提,并采用限制性內切酶進行雙酶切驗證,瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。從圖中可看出,所抽提的重組質粒均顯示了正確大小的片段,表明所挑選單克隆均為陽性。

圖2 重組質粒雙酶切驗證電泳圖Fig.2 Agarose gelelectrophoresis of double restriction enzyme digestion of recombinant plasmids注：1,pUC18ldb0101;2,pUC18ldb0813;3,pUC18ldb1010; 4,pUC18ldb1147;5,pUC18ldb2021;M:Marker。

2.3 重組蛋白的聚丙烯酰氨凝膠電泳

重組菌的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖3所示。與對照JM109和空質粒JM109/pUC18相比,重組菌JM109/pUC18ldb0101、JM109/pUC18ldb0813、JM109/pUC18ldb1010和JM109/pUC18ldb2021均有特異蛋白表達,且蛋白大小正確,大小為35 kDa左右。從SDS-PAGE圖中可以看出,在上樣量相同的情況下，五種不同的D-LDH同工酶在E.coli中的表達強度不同,以Ldb0101和Ldb1010重組蛋白的表達量最高,其次為Ldb0813和Ldb2021,而Ldb1147蛋白未見明顯表達。原因尚不明確,但這也從側面反應了各D-LDH同工酶在保加利亞乳桿菌中的表達水平。

圖3 重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.3 Extracellular protein profiles on SDS-PAGE of engineered E. coli carrying different D-LDH genes注：泳道1,JM109;泳道2,JM109/pUC18;泳道3,0 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb0101;泳道4,0.5 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb0101;泳道5,0 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb0813;泳道 6,0.5 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb0813;泳道 7,0 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb1147;泳道 8,0.5 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb1147;泳道9,0.5 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb2021;泳道10,0.5 mmol/L IPTG JM109/pUC18ldb1010。

2.4 重組大腸桿菌D-乳酸合成的搖瓶發(fā)酵實驗

為了解不同D-乳酸脫氫酶催化丙酮酸合成D-乳酸的性能,本研究對表達D-LDH基因的重組大腸桿菌進行微好氧搖瓶發(fā)酵實驗,并以表達空質粒重組菌為對照,結果如表2所示。與對照相比,表達D-LDH基因的重組菌細胞的生長均受到不同程度的抑制,其中以JM109/pUC18ldb1010細胞濃度最低,這主要是由于重組蛋白的表達所帶來的代謝負荷所致[14]。而從D-乳酸的合成情況來看,重組大腸桿菌JM109/pUC18ldb0101較其他菌表現(xiàn)出更好的合成性能,最終D-乳酸的含量為949.6 mg/L;其次為菌株JM109/pUC18ldb1010,D-乳酸的濃度為673.9 mg/L。相比之下,其余兩株重組菌D-乳酸合成能力均較低,而JM109/pUC18ldb1147和對照菌株JM109/pUC18不合成D-乳酸。從搖瓶發(fā)酵的結果發(fā)現(xiàn),重組菌合成D-乳酸的能力與SDS-PAGE中重組蛋白的表達量呈正相關。因此,結合重組蛋白的表達和D-乳酸的合成,推測Ldb0101和Ldb1010在保加利亞乳桿菌合成D-乳酸的過程中起著較其他同工酶更為重要的作用。

表2 重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵合成乳酸的性能比較

如表2所示,各重組菌的L-乳酸的含量均較低。JM109/pUC18ldb0101和JM109/pUC18ldb1010L-乳酸的濃度較對照無顯著差異,而其余三株重組菌L-乳酸含量較對照均有所下降。綜合D-乳酸和L-乳酸的合成,JM109/pUC18ldb0101和JM109/pUC18ldb1010具有較其他重組菌優(yōu)良的乳酸合成性能。

Hao pei等[13]對L.bulgaricus2038進行了全基因組測序和功能注釋,他們認為,L-LDH在細胞中是不表達的,而D-LDH在體內表達水平較高,其中l(wèi)dhD1(LBU0066)表達量最高,密碼子適應指數(shù)(Condon adaption index,CAI)為0.575,而ldhD2(LBU0860)和ldhD3(LBU1637)表達水平適中,CAI分別是0.369和0.320。這也就表明了保加利亞乳桿菌中D-LDH同工酶的表達確實存在著不同程度的差異[15],這在本研究中重組D-LDH蛋白的表達中也可以得到證實。另外,從上述研究也可以發(fā)現(xiàn),不同的保加利亞乳桿菌菌株含有不同的D-LDH同工酶,具有菌株差異性。

2.5 重組質粒的穩(wěn)定性分析

根據(jù)本文1.2.6所述的方法,本實驗測定了重組大腸桿菌的質粒穩(wěn)定性(結果未顯示)。結果表明,各重組菌均可以表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,好氧發(fā)酵12 h各重組菌的質粒穩(wěn)定性均保持在98%以上,且差異不顯著。

3 結論

為了解保加利亞乳桿菌五種D-乳酸脫氫酶同工酶基因對細胞合成D-乳酸的作用,本研究以L.bulgaricusATCC11842基因組DNA為模板,克隆得到D-LDH同工酶基因(ldb0101、ldb0813、ldb1010、ldb1147和ldb2021),構建重組質粒并轉化大腸桿菌JM109,共構建五株重組菌株,實現(xiàn)了D-LDH同工酶基因在大腸桿菌中的表達。對重組菌進行了微好氧搖瓶發(fā)酵實驗,結果顯示JM109/pUC18ldb0101和JM109/pUC18ldb1010較其他重組菌合成更多的D-乳酸,其中JM109/pUC18ldb0101合成量最高,其次為JM109/pUC18ldb1010。因此,綜合重組蛋白在大腸桿菌中的表達量和D-乳酸的合成兩個方面,推測D-乳酸脫氫酶Ldb0101和Ldb1010對保加利亞乳桿菌D-乳酸的合成起著較為重要的作用,其他三種D-LDH同工酶的功能有待進一步研究。

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Over-expression ofD-lactate dehydrogenase isoenzyme genes fromLactobacillusdelbrueckiispp.bulgaricusinEscherichiacoli

HUANG Yan-na,LIU Zhen-min,YOU Chun-ping*

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Dairy Research Institute,Bright Dairy & Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

FiveD-LDH isoenzyme genes(ldb0101,ldb0813,ldb1010,ldb1147 and ldb2021)fromL.bulgaricusATCC11842 were separated and over-expressed inEscherichiacoliJM109 using pUC18 as the expression plasmid. The shake-flask fermentation of recombinantE.coliindicated that theD-LDH enzymes Ldb0101 and Ldb1010 played more important roles inD-lactic acid biosynthesis inL.bulgaricus.

Lactobacillusbulgaricus;D-lactate dehydrogenase;D-lactic acid ATCC11842;gene clone and expression

2016-09-06

黃艷娜(1980-)，女，博士，工程師，研究方向：益生菌代謝工程及代謝調控，E-mail:huangyanna@brightdairy.com。

*通訊作者:游春蘋(1982-)，女，博士，高級工程師，研究方向：益生菌代謝工程及代謝調控，E-mail:youchunping@brightdairy.com。

國家“十二五”科技支撐計劃(2013BAD18B01，2013BAD18B02)；上海市閔行區(qū)領軍人才項目(201443)；上?？茖W技術委員會項目(16DZ2280600)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0159-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.021