半纖維素降解菌J-25的篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究

姜立春,王成紅,劉 羽,林壽露,趙麗萍,阮期平

(綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽 621000)

半纖維素降解菌J-25的篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究

姜立春,王成紅,劉 羽,林壽露,趙麗萍,阮期平*

(綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽 621000)

以腐爛的木材為菌源,經(jīng)過初篩、復(fù)篩,采用半纖維素水解圈法和胞外酶測定法進(jìn)行菌株篩選獲得一株半纖維素高效降解菌株J-25。通過對菌株J-25的16S rDNA進(jìn)行測序分析,鑒定為纖維單胞菌屬命名為Cellulomonassp. J-25。對菌株J-25進(jìn)行產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果表明:菌株J-25發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化條件為:培養(yǎng)時(shí)間為60 h、溫度30 ℃、初始pH為7.0、麩皮濃度為20 g/L、酵母粉濃度為10 g/L、裝液量為50 mL(250 mL三角瓶),半纖維素酶活性可達(dá)到62.8 U/mL。最適酶反應(yīng)條件為:pH為6.5、溫度為40 ℃、底物濃度為15 g/mL、反應(yīng)時(shí)間為30 min。這些將為半纖維素的生物降解提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

半纖維素,降解菌,產(chǎn)酶條件,酶學(xué)性質(zhì),16S rDNA

半纖維素是植物性材料的有效組成成份之一,約占15%～30%,是陸生植物細(xì)胞壁的一種主要組分,較集中于初級與次級細(xì)胞壁中。半纖維素是由己糖與戊糖構(gòu)成的異質(zhì)多糖[1],探討半纖維素生物轉(zhuǎn)化具有重要的實(shí)踐價(jià)值,如在生物制漿,將其轉(zhuǎn)化為單糖和酒精,處理造紙廠廢水的環(huán)境污染等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。半纖維素酶是分解半纖維素的一類酶的總稱,主要由內(nèi)切酶、外切酶和糖苷水解酶組成[3]。微生物產(chǎn)生的半纖維素酶將半纖維素降解產(chǎn)生術(shù)糖和其它少量單糖[4]。有利于廢棄農(nóng)作物還田,改善植物的營養(yǎng)狀況,還能夠使農(nóng)作物抵抗某些病原微生物的致病作用,減輕病蟲害,增加產(chǎn)量[5]。全桂靜等[5]使用半纖維素作為唯一碳源,通過平板水解圈與搖瓶發(fā)酵相結(jié)合方法,篩選分離純化到1株半纖維素酶高產(chǎn)菌株Hc-3,鑒定該菌株屬于曲霉屬(Aspergillus)。張慶芳等[6]以木聚糖作為唯一碳源,分離獲得1株降解半纖維素中木聚糖的高效菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為曲霉屬(Aspergillus)。張寧寧等[7]以半纖維素為唯一碳源,從溫泉中分離到1株降解半纖維素酶的嗜熱菌DT-1,經(jīng)16S rDNA序列比較分析,初步鑒定該菌株屬于Geobacillusthermocatenulatus。

本研究以腐朽木材為菌源,篩選獲得的一株半纖維素降解菌進(jìn)行了菌株鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化,并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析,以期提高半纖維素酶的活性,為纖維的生物降解提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本采集 使用無菌取樣鏟采集腐爛木材或長期存放木材下面的土壤作為篩選菌源,用無菌袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室,于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀器(Thermol Research Inc);Gel-Doc XR分子凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf);凈化工作臺(SB-JC-1A);紫外分光光度計(jì)(Uitrospec 3300pro);恒溫培養(yǎng)搖床(HZ-9211K);微量可調(diào)移液器(Eppendorf)等。

pMD18-T試劑盒、X-gal和IPTG、DNA膠回收試劑盒和氨芐青霉素購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,引物的合成和DNA測序由上海生物工程技術(shù)有限公司完成,DNS試劑、木聚糖溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基及配方 初篩培養(yǎng)基(100 mL):木聚糖0.5 g,酵母粉0.1 g,KH2PO40.1 g,NH4NO30.1 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.5 g,瓊脂1.5 g。

透明圈測定培養(yǎng)基(100 mL)[8]:K2HPO42.0 g,NH4NO32.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,酵母膏5.0 g,半纖維素20.0 g,pH7.2。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(100 mL):木聚糖0.5 g,KH2PO40.1 g,NH4NO40.4 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.5 g。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5g,瓊脂2.2%,水1000 mL,pH7.4～7.6,固體平板加2.0%瓊脂。上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌 20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 將樣品制成菌懸液。將菌懸液稀釋后均勻涂布于篩選平板上,27 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,將純化后的單菌落點(diǎn)種于透明圈培養(yǎng)基上,27 ℃恒溫培養(yǎng),測量水解圈的直徑D(mm)及菌落的直徑d(mm),并計(jì)算D/d值,進(jìn)行初篩。復(fù)篩測定發(fā)酵液酶活力。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察 將細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)32 ℃培養(yǎng)30 h后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察,放于4 ℃冰箱中保存。選擇單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2 生理生化 菌株J-25生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]中的方法。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》,對篩選獲得的菌株J-25進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2.3 DNA提取與擴(kuò)增16S rDNA基因 細(xì)菌基因組DNA提取:提取基因組DNA參考Kim等[10]方法,對其方法略有修改。0.9%瓊脂糖電泳檢測。

采用細(xì)菌通用引物P27f:5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′,P1492r:5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′對菌株進(jìn)行16S rDNA基因片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:37.5 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、4 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)、1.0 μL P27f引物(20 pmol/μL)、1.0 μL P1492r引物(20 pmol/μL)、2 μL模板、0.5 μL TaqDNA聚合酶,反應(yīng)總體積為50 μL。擴(kuò)增熱循環(huán)體系:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s;經(jīng)35個循環(huán)后,72 ℃延伸18 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后,其產(chǎn)物回收純化與pMD-19T載體連接,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞JM109,篩選陽性重組子郵寄上海英俊生物科技有限公司測序。

1.2.2.4 16S rRNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將菌株的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast序列比對與相似性分析,下載與該序列相似性較高的核酸序列用于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。將在數(shù)據(jù)庫中下載的相關(guān)菌株16S rRNA序列,采用Clustal X軟件包[11]進(jìn)行多序列比對分析,用Mega 6.0軟件程序中的Neighbor-Joining法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

1.2.3 半纖維素酶活性測定 粗酶液1.0 mL,加1.5 mL pH=4.8的1%木聚糖溶液(對照用1.0 mL稀釋酶液加3.0 mL pH=4.8的醋酸緩沖液,不加木聚糖溶液),50 ℃水溶60 min,取出后,再吸取4.0 mL DNS試劑搖勻,立即沸水浴反應(yīng)10 min,冷卻后,補(bǔ)加水定容到25 mL,于550 nm下測OD值。一個半纖維素酶單位定義為:1.0 mL酶液于50 ℃ pH=4.8條件下,每分鐘分解1.0%木聚糖溶液產(chǎn)生一微克還原糖(以木糖)的酶量定義為一個半纖維素酶活力單位。酶活力計(jì)算公式:U=(A×N×1000)/60,式中:A=OD550 nm下的吸收值相對應(yīng)的木糖濃度;N=酶的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過改變單一因素,并保持其他發(fā)酵條件不變,以下實(shí)驗(yàn)每個條件制作三個平行。培養(yǎng)時(shí)間:將菌株J-25接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(接種量為1%)。置于32 ℃ 160 r/min搖床上進(jìn)行培養(yǎng),觀察并記錄其生長狀況,每12 h測定記錄一次,共5 d;碳源(濃度10 g/L)分別為麩皮、玉米粉、半纖維素、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖,在碳源確定的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)在5、10、15、20、25和30 g/L條件下分析碳源濃度;而氮源(濃度5 g/L)為蛋白胨、豆粕、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨,在氮源確定的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)在1、5、10、15和20 g/L條件下分析氮源濃度;實(shí)驗(yàn)考察不同初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10),不同裝液量(10、30、50、80、100、120 mL/250 mL三角瓶),不同培養(yǎng)溫度(20、24、27、30、33、37、40 ℃)等條件對該菌株產(chǎn)酶的影響[13-14]。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

1.2.5.1 pH對酶活力的影響 pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的1.0%木聚糖溶液1.5 mL分別加入粗酶液0.5 mL,搖勻,50 ℃水浴60 min,取出后,用DNS法測定酶活力。

1.2.5.2 溫度對酶活力的影響 調(diào)節(jié)最適pH,使酶反應(yīng)體系在10、20、30、40、50、60 ℃下保溫60 min,取出后,用DNS法測定不同溫度下的酶活力。

1.2.5.3 底物濃度對酶活力的影響 濃度為1、5、10、15、20 g/L的木聚糖溶液1.5 mL,分別加入粗酶液0.5 mL,搖勻,50 ℃水浴60 min,取出后,用DNS法測定酶活力。

1.2.5.4 反應(yīng)時(shí)間對酶活力的影響 調(diào)節(jié)最適pH,使酶反應(yīng)體系在50 ℃水浴鍋中分別保溫10、20、30、40、50、60 min,取出后,用DNS法測定酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測定結(jié)果利用Microsoft Excel軟件制圖以及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)每個條件制作3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 半纖維素降解菌的篩選

經(jīng)過平板分離,挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株共6株。在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵后測定酶活性,選出木聚糖酶活性較高的菌株3株,挑取酶活最高的菌株J-25進(jìn)行產(chǎn)酶條件分析和酶學(xué)性質(zhì)研究。菌株J-25在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后,菌落圓形,邊緣整齊,乳白色,凸起圓球狀,革蘭氏染色陽性,菌體形態(tài)為短桿狀,呈單個或成對排列。

2.2 菌株J-25生理生化鑒定

菌株J-25的V-P反應(yīng)呈陰性,甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽性,吲哚實(shí)驗(yàn)呈弱陽性,糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的葡萄糖、乳糖和蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均呈陽性,即菌能分解三種糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣,接觸酶陽性。

2.3 菌株J-25系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將克隆得到的半纖維素降解菌株J-25的16S rDNA序列片段經(jīng)過測序后,序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知的核酸序列進(jìn)行Blast比對和相似性分析。結(jié)果表明,菌株J-25的16S rDNA序列與NCBI基因庫中纖維單胞菌屬(Cellulomonas)的16S rDNA同源性最為接近,且一致性均大于97%,表明該菌屬于Cellulomonas。通過CLustal X軟件的多序列比較和MEGA 6.0軟件的分析得到以16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖1。由系統(tǒng)發(fā)育樹表明,在以上15個菌株中,菌株J-25與Cellulomonassp. RP-3(EU303279)菌株同源性達(dá)99%以上,因此,命名為Cellulomonassp. J-25。

圖1 菌J-25與相近序列比較的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of J-25 and related sequences

2.4 菌株J-25產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對半纖維素酶產(chǎn)生的影響 通過將菌株J-25培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化后,測定半纖維素降解酶活,其結(jié)果和數(shù)據(jù)分析見圖2。結(jié)果表明,J-25的酶活力在0～60 h逐漸增大,在60 h時(shí)達(dá)到最大為38.5 U/mL,其后酶活力隨著時(shí)間的增大而呈下降趨勢。所以確定最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of culture time on enzyme production

2.4.2 碳源及濃度對半纖維素酶產(chǎn)生的影響 以不同碳源為橫坐標(biāo),測得的酶活力為縱坐標(biāo),其結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,碳源麥麩誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的效果最好,達(dá)到40.6 U/mL;半纖維素次之,為38.1 U/mL;而其它單糖和多糖誘導(dǎo)效果較差。因此,選擇麥麩作為最適碳源。

圖3 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on production of enzymes

碳源則是由于原核生物必須根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì),使得代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化,才能維持自己的生存和繁衍[15]。以不同濃度的麩皮為碳源發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果見圖4。麩皮濃度在5～20 g/L時(shí),隨著濃度的增加,產(chǎn)酶活力逐漸增大,當(dāng)濃度在20 g/L時(shí),酶活力最高達(dá)到42.8 U/mL;在濃度高于20 g/L后,酶活力呈下降趨勢,當(dāng)麩皮濃度達(dá)到一定濃度后,培養(yǎng)液混濁度升高,溶氧度降低所致。因此,最適麩皮濃度為20 g/L。

圖4 麩皮濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of bran concentration on production of enzymes

2.4.3 氮源及濃度對半纖維素酶產(chǎn)生的影響 以不同氮源為橫坐標(biāo),氮源的質(zhì)量濃度為5 g/L;碳源選擇麥麩(15 g/L),對菌株J-25進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果見圖5。結(jié)果表明,不同氮源對菌株J-25產(chǎn)酶活力有一定的影響,其中酵母粉對產(chǎn)酶活力影響最大,酶活力達(dá)到41.8 U/mL,硫酸銨次之,為40.2 U/mL;而硝酸銨效果最差,為28.3 U/mL。因此,選擇酵母粉作為最適碳源。以不同濃度的酵母粉為氮源發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果見圖6。酵母粉濃度在1.0～10 g/L時(shí),隨著濃度的增加,產(chǎn)酶活力逐漸增大,當(dāng)濃度在10 g/L時(shí),酶活力最高達(dá)到43.6 U/mL;在濃度高于10 g/L后,酶活力呈略微下降趨勢,可能是當(dāng)酵母粉濃度達(dá)到一定程度后,抑制了培養(yǎng)液的溶解氧的效率,導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。因此,最適酵母粉濃度為10 g/L。

圖5 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on production of enzymes

圖6 酵母粉濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of yeast powder concentration on production of enzymes

2.4.4 初始pH對半纖維素酶產(chǎn)生的影響 培養(yǎng)基初始pH變化將會使微生物細(xì)胞原生質(zhì)體膜上電荷隨之發(fā)生改變,從而影響微生物對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌,即影響了半纖維素酶的活性。如圖7所示,當(dāng)初始pH在5.0～7.0時(shí),酶活力隨著pH的升高而增大;在pH為7.0時(shí),酶活力達(dá)到最大為45.8 U/mL;當(dāng)pH高于7后,酶活力則隨pH的升高而減弱,表明偏酸或偏堿的環(huán)境均不適合產(chǎn)酶,故最適產(chǎn)酶pH為7.0。

圖7 初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of initial pH on production of enzymes

圖8 裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of loaded liquid on production of enzymes

2.4.5 培養(yǎng)基裝液量對半纖維素酶產(chǎn)生的影響 當(dāng)搖瓶中裝液量較少時(shí),通氣好,則菌體旺盛生長,但是過少的培養(yǎng)基不能滿足其生長產(chǎn)酶,因此酶活力較低;當(dāng)裝液量過高時(shí),影響通氣狀況從而影響菌的生長,導(dǎo)致產(chǎn)酶量發(fā)生變化。結(jié)果如圖8可知,當(dāng)裝液量為10～50 mL時(shí),隨著裝液量的增多,酶的活性逐漸增高,裝液量為50 mL時(shí),產(chǎn)酶活力最高為48.6 U/mL;而裝液量高于50 mL后,產(chǎn)酶活性呈下降趨勢。故最裝液量為50 mL。

2.4.6 發(fā)酵溫度對半纖維素酶產(chǎn)生的影響 從酶反應(yīng)動力學(xué)來看,發(fā)酵溫度升高,酶反應(yīng)速率增大,生長代謝速度加快,但酶本身容易因過熱而失去活性,表現(xiàn)在菌體容易衰老,發(fā)酵周期縮短,影響最終產(chǎn)物。在發(fā)酵過程中,溫度對菌體的生長和酶的產(chǎn)生的影響是不同的[16]。如圖9所示,當(dāng)溫度在20～30 ℃時(shí),隨著發(fā)酵溫度升高,產(chǎn)酶活性也逐漸增大;當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時(shí),半纖維素酶活力達(dá)到最高為62.8 U/mL;溫度繼續(xù)升高反而使產(chǎn)酶活性快速減小。所以,最佳產(chǎn)酶溫度為30 ℃。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of fermentation temperature on production of enzymes

2.5 酶學(xué)特性研究

2.5.1 pH對酶反應(yīng)的影響 pH變化會改變酶分子的空間構(gòu)象,pH過大或過小將會導(dǎo)致酶喪失活性,進(jìn)而使酶解率隨之降低。酶促反應(yīng)在不同pH下,酶分子與底物分子中基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變[17],從而影響酶分子的構(gòu)象以及酶與底物的結(jié)合和催化效率。如圖10所示,當(dāng)pH在5.5～6.5時(shí),隨著pH增大酶活性增高,pH為6.5產(chǎn)酶活力達(dá)到最大為66.8 U/mL;之后隨著pH升高,產(chǎn)酶活力反而下降,可能pH升高抑制了酶的活性。因此,酶促反應(yīng)最適pH為6.5。

圖10 pH對酶反應(yīng)的影響Fig.10 Effects of pH on reaction of enzymes

2.5.2 溫度對酶反應(yīng)的影響 溫度對酶的活性產(chǎn)生一定的影響,如圖11所示,當(dāng)溫度過低時(shí)會抑制酶的活性,使得酶活力較低,隨著溫度升高,酶活力逐漸升高;當(dāng)溫度升到溫度40 ℃時(shí),酶的活性最大為63.8 U/mL。過高時(shí),致使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞,酶活力反而下降。因此,酶促反應(yīng)最適溫度為40 ℃。

圖11 發(fā)酵溫度對酶反應(yīng)的影響Fig.11 Effects of temperature on reaction of enzymes

2.5.3 底物濃度對酶反應(yīng)的影響 如圖12所示,底物濃度對酶反應(yīng)的影響也很明顯,酶的活性先隨底物濃度的增加而增加,當(dāng)?shù)竭_(dá)15 g/L時(shí)達(dá)到最大為64.5 U/mL。在底物濃度較低的條件下,酶催化反應(yīng)速度與底物濃度成正比,酶促反應(yīng)速度將隨底物濃度的增加而變快,當(dāng)酶量飽和時(shí),酶活力則不再上升,當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時(shí),反而酶的活性降低,因?yàn)楫a(chǎn)物對酶促反應(yīng)有了抑制作用。由此可知,最適底物濃度為15 g/L。

圖12 底物濃度對酶反應(yīng)的影響Fig.12 Effects of substrate concentration on reaction of enzymes

2.5.4 反應(yīng)時(shí)間對酶反應(yīng)的影響 隨著酶促反應(yīng)的時(shí)間延長,酶的活性增大,但反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后,隨著時(shí)間的延長已不能有效地增加酶促反應(yīng)活力。由于隨著時(shí)間的延長,酶分子已充分與底物接觸,結(jié)合后酶分子的有效濃度下降,且反應(yīng)產(chǎn)物對酶促反應(yīng)有一定的抑制作用,導(dǎo)致酶促反應(yīng)變化并不明顯。由圖13所示,當(dāng)30 min時(shí),酶的活力最高為67.9 U/mL;而在隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,酶活力變化幾乎不大。因此,酶促反應(yīng)最適時(shí)間為30 min。

圖13 時(shí)間對酶反應(yīng)的影響Fig.13 Effects of time on reaction of enzymes

3 結(jié)論

篩選到一株半纖維素高效降解菌J-25,該菌株V-P反應(yīng)呈陰性,甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽性,吲哚實(shí)驗(yàn)呈弱陽性,能分解葡萄糖、乳糖和蔗糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣,鑒定為纖維單胞菌,命名為Cellulomonassp. J-25。半纖維素降解菌J-25的最佳產(chǎn)酶條件為:培養(yǎng)時(shí)間為60 h、溫度為30 ℃、麩皮濃度為20 g/L、酵母粉濃度為10 g/L、初始pH為7.0、裝液量為50 mL,在此培養(yǎng)條件下,酶的活性可達(dá)到62.8 U/mL。菌株J-25所產(chǎn)半纖維素酶的最適反應(yīng)條件為:pH為6.5,溫度為40 ℃,底物濃度為15 g/L,反應(yīng)時(shí)間為30 min。

國內(nèi)對半纖維素降解菌定量分析報(bào)道還較少,一些研究學(xué)者只做了定性分析[18-19];張寧寧等[20]以溫泉水樣作為研究材料,分離嗜熱菌株DT-1的半纖維素酶活僅達(dá)到200 U/L;劉多濤等[21]以石油井附近的石油污染區(qū)域土樣,獲得菌株DT83半纖維素酶活可達(dá)70 U/mL以上;徐有權(quán)等[22]以田間富含腐爛稻稈的泥土為樣本,篩選獲得短小芽胞桿菌,產(chǎn)半纖維素酶活可達(dá)85.12 U/mL;而本實(shí)驗(yàn)獲得的纖維單胞菌J-25,培養(yǎng)60 h后,其酶活性能夠達(dá)到62.8 U/mL,具有較高的降解半纖維活性。由于Cellulomonassp. J-25對半纖維的降解與菌株分泌的降解酶有關(guān),因此,其降解途徑和機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果豐富了半纖維的生物降解資源庫,為進(jìn)一步研究半纖維的生物降解提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Screening,identification and enzymatic analysis of hemicellulose-degrading strain J-25

IANG Li-chun,WANG Cheng-hong,LIU Yu,LIN Shou-lu,ZHAO Li-ping,RUAN Qi-ping*

(Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutics,Mianyang Normal University,Mianyang 621000，China)

A hemicellulose degrading bacteria was isolated with rotting wood as a source. Hydrolysis spot diameter measurement of hemicellulose plate and extracellular enzyme activity was used. The strain J-25 was identified asCellulomonasby 16S rDNA sequencing analysis,namedCellulomonassp. J-25. And characteristics of enzyme production and enzymatic properties were studied. The results indicated that fermentation conditions for enzyme production of strain J-25 was:temperature 30 ℃,the initial pH of 7.0,bran concentration of 20 g/L,yeast powder concentration of 10 g/L,liquid volume of 50 mL(250 mL flask),hemicellulose activity may reach 62.8 U/mL. The optimum enzyme reaction conditions were as follows:pH6.5,temperature of 40 ℃,substrate concentration of 15 g/mL,the reaction time of 30 min. These will provide experimental evidence for hemicellulose biodegradation.

hemicellulose;degrading-bacteria;fermentation conditions;enzymatic properties;16S rDNA

2016-09-28

姜立春(1977-)，男，博士，副教授，從事應(yīng)用微生物學(xué)與分子生物學(xué)方面研究，E-mail:jiang_lichun @126.com。

*通訊作者:阮期平(1961-)，男，博士，教授，從事微生物學(xué)與生化藥學(xué)方面研究，E-mail: qpruan20141230@163.com。

四川省科技廳項(xiàng)目(2016JY0038)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510639010,201510639066)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0145-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.019