花蟹肉酶解多肽美拉德反應產物的抑菌性研究

陳金斌,奚秀秀

(1.溫嶺市食品藥品檢驗檢測中心,浙江溫嶺 317500;2.寧波大學食品系,浙江寧波 315211;3.上海大學食品系,上海 200444)

花蟹肉酶解多肽美拉德反應產物的抑菌性研究

陳金斌1,奚秀秀2,3

(1.溫嶺市食品藥品檢驗檢測中心,浙江溫嶺 317500;2.寧波大學食品系,浙江寧波 315211;3.上海大學食品系,上海 200444)

本文基于蟹肉酶解多肽與木糖的美拉德反應產物(PXMRPs)對食品常見污染菌的抑制作用,對PXMRPs生產工藝進行優(yōu)化。實驗結果表明,PXMRPs對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌4種常見食品污染菌均有不同程度的抑制作用。采用牛津杯法檢測PXMRPs的抑菌能力,以木糖與花蟹肉酶解多肽質量比、反應溫度和反應時間為自變量進行單因素實驗和正交實驗。獲得最優(yōu)抑菌效果的PXMRPs生產工藝為:木糖與花蟹肉酶解多肽質量比2∶1,反應溫度為120 ℃,反應時間為120 min。PXMRPs對蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值均為15 mg/mL,枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的MIC值分別為20 mg/mL和30 mg/mL。蟹肉酶解多肽與木糖的美拉德反應產物(PXMRPs)因其良好的抑菌性能,具有開發(fā)為天然食品添加劑的可能。

花蟹肉酶解多肽,美拉德反應產物,抑菌性

遠海梭子蟹(Portunuspelagicus),俗稱遠洋梭子蟹、花蟹,隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、軟甲亞綱(Malacostraca)、十足(Decapoda)、爬行亞目(Reptantia)、短尾派(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(Portunus)[1],廣泛分布于我國浙江、福建和廣東等沿海地區(qū),尤以浙江舟山地區(qū)資源豐富。然而,花蟹個體較小、加工困難,長期被加工成蟹糊銷售,不僅造成資源浪費,而且降低了花蟹的經濟價值?；ㄐ冯m小,但仍具有蟹類的鮮香及誘人的滋味,為了提高花蟹的經濟價值,有效利用花蟹制備功能性食品添加劑已成為學者們關注的焦點。前期研究結果表明以花蟹肉為原料具有諸多優(yōu)點,如花蟹肉經酶解可制備高品質抗氧化肽[2],花蟹肉酶解多肽的美拉德反應產物也具有較好的抗氧化屬性[2],這些優(yōu)點為利用花蟹制備功能性食品添加劑提供了一定的理論基礎，相比化學防腐劑抑菌可能會給人體帶來副作用,或者物理滅菌可能會破壞食品的營養(yǎng)成分等,花蟹肉自身具備食用的特點,具備成為一種天然的食用型添加劑的可能。

美拉德反應(Maillard reaction,MR)是羰基化合物與氨基化合物經縮合聚合反應生成高分子量聚合物類黑素的反應,屬于非酶促褐變反應,該反應會產生大量的美拉德反應產物(Maillard reaction produces,MRPs),其中包括了早期的揮發(fā)性化合物,中間產物和大分子量聚合物[3]。MR可以改善食品的色澤和風味,更產生了大量的抗氧化和抗菌性物質[4],能夠有效延長食品的貨架期。目前,關于氨基酸或多肽與各類還原糖發(fā)生美拉德反應增強其抗氧化性和產生特殊香味的研究已有報道[5],然而,對反應賦予多肽強抗菌性原因的研究則較少[6-7],在食品工業(yè)生產具抗菌性的天然食品添加劑缺乏具體的理論指導。

本實驗通過分析不同反應條件對PXMRPs抑菌性的影響,利用正交實驗優(yōu)化反應條件后測出PXMRPs對常見腐敗菌的MIC值,意在充分利用豐富的花蟹資源,減少花蟹資源的浪費,提高花蟹的經濟價值,為PXMRPs的實際應用提供理論基礎,推動美拉德反應產物制備天然防腐劑在食品工業(yè)中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮花蟹肉 舟山市世創(chuàng)水產有限公司提供(蟹肉水分79.1%,蛋白質19.5%,脂肪0.3%,灰分1.1%)。

食品級堿性蛋白酶 南寧龐博有限公司。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂均為化學級,購自上海生物工程有限公司。

測試菌株:金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus)ATCC13565、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC10774、蠟狀芽孢桿菌(Cereabacillus)ATCC10635、大腸桿菌(Escherichiacoil)ATCC25922。

木糖 上海捷瑞生物工程有限公司,其余均為食品級。

超純水 電阻率18.2 MΩ·cm。

電熱恒溫水浴鍋,DK-S22型 上海精宏實驗設備有限公司;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;壓力滅菌鍋 上海安申醫(yī)療器械廠;恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;電熱恒溫油槽DKU-2508型 上海森信實驗儀器有限公司;電子天平TE212-2型 德國賽多利斯股份有限公司;旋轉蒸發(fā)器RE52-2 上海滬西分析儀器廠;超純水儀 Genpure Pro 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花蟹蛋白酶解多肽的制備 花蟹洗凈去殼,絞碎,處理后的花蟹肉水分含量為87%～88%,pH6.8～7.0。將處理好的花蟹肉與超純水1∶2混合,用10 mol/L的NaOH或7 mol/L HCl調節(jié)pH至7.5,再用堿性蛋白酶,加酶量3000 U/g,在51 ℃下酶解3.2 h,再經滅酶、過濾、蒸發(fā)濃縮和冷凍干燥后,得到花蟹肉酶解多肽干品[6],在-40 ℃下儲存,備用。

1.2.2 PXMRPs的制備 依據(jù)前期實驗結果得出,木糖是最適宜與花蟹肉酶解多肽發(fā)生美拉德反應的還原糖之一[2],所以本實驗也以木糖作為花蟹肉酶解多肽反應的還原糖。取木糖與花蟹肉酶解多肽共1 g,溶解于100 mL超純水中,將反應液移至燒瓶后置于油浴中,在冷凝管回流蒸發(fā)水蒸氣的條件下,反應一段時間后立即將反應液轉至冰水浴中冷卻終止反應。反應液再經旋轉蒸發(fā)、冷凍干燥成固體粉末,于-40 ℃下冷凍,備用。

1.2.3 抑菌劑制備 將冷凍的PXMRPs溶解于無菌水中制成濃度為200 mg/mL的抑菌劑溶液備用。

1.2.4 初始菌液的制備 將活化好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的菌液用生理鹽水稀釋至濃度105～106CFU/mL,作為初始菌液。

1.2.5 PXMRPs抑菌圈測定——牛津杯法 在無菌條件下吸取適量菌懸液,移入滅菌培養(yǎng)皿中,倒入15 mL溫度適宜的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,混合均勻,待其冷卻后,在其表面呈正三角形狀放置的3個牛津杯平均分布于整個培養(yǎng)基,在牛津杯中加入100 μL,200 mg/mL的PXMRPs水溶液,每種菌都做兩個平行,以超純水作空白對照[8]。培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24h。采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.6 PXMRPs抑菌圈大小的正交實驗分析 在單因素實驗的基礎上,以木糖與花蟹肉酶解多肽質量比、反應溫度和反應時間為自變量,以抑菌圈直徑為因變量,設計三因素三水平的正交分析實驗,對PXMRPs抑菌性進行反應條件優(yōu)化。

表1 PXMRPs的抑菌性的正交實驗因素水平表

1.2.7 PXMRPs最低抑菌濃度(MIC)測定 對優(yōu)化反應條件后制備的PXMRPs進行MIC測定。將PXMRPs溶解于超純水中,配置成初始質量濃度分別為100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/mL的水溶液,吸取2 mL加入滅菌的培養(yǎng)皿中,并加入18 mL融化的培養(yǎng)基,充分混勻使反應物最終質量濃度為10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/mL。待培養(yǎng)基冷卻后,每個培養(yǎng)基表面移入0.1 mL供試菌液,用涂布棒涂勻,每個樣品做3個平行,并做1個未加反應物的空白對照組[9]。觀察菌體的生長情況,從無菌生長的培養(yǎng)皿中找到最低反應物濃度的培養(yǎng)皿,此皿的反應物濃度即為其MIC值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 本實驗設置3組平行,采用Excel 2010和SAS 8.1軟件進行方差分析、均值比較、顯著性分析和鄧肯多重比較。

2 結果與分析

2.1 PXMRPs對四種細菌的抑菌效果

牛津杯法抑菌實驗室中,可以通過抑菌圈的大小初步判斷抑菌劑抑菌作用的強弱。圖1為在反應溫度120 ℃,反應時間120 min下花蟹肉酶解多肽與木糖1∶1質量比的PXMRPs分別對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌的抑菌圈圖。由圖可知,PXMRPs對4種供試菌都具有抑菌圈,但對金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大,蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈次之,大腸桿菌的抑菌圈最小。4種供試菌中,金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均為革蘭氏陽性菌,大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,可見PXMRPs有著廣譜的抑菌作用,而且對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于陰性。

圖1 PXMRPs對4種菌的抑菌效果Fig.1 Inhibition of bacterial growth by PXMRPs注：1為蠟狀芽孢桿菌抑菌圖,2為枯草芽孢桿菌抑菌圖, 3為金黃色葡萄球菌抑菌圖,4為大腸桿菌抑菌圖。

2.2 單因素對PXMRPs抑菌效果的影響

2.2.1 木糖與花蟹肉酶解多肽質量比對PXMRPs抑菌圈大小的影響 反應物起始pH為7.0,改變反應物中還原糖和花蟹肉酶解多肽的質量比,反應溫度140 ℃,反應時間90 min的條件下制備PXMRPs,其對4種供試菌的抑菌性(用抑菌圈直徑的大小來表示抑菌性的強弱)與反應物中還原糖和花蟹肉酶解多肽質量比的關系如圖2所示,其中牛津杯直徑為7 mm。

由圖2可知,隨著木糖與花蟹肉酶解多肽質量比從1∶3升高到3∶1,4種供試菌的抑菌圈直徑均先上升后下降,由此可見,PXMRPs抑菌性隨著木糖與花蟹肉酶解多肽質量比先上升后下降,在比例達到1∶1時,4種供試菌的抑菌圈直徑均都達到最大值,即抑菌性達到最大值。反應物中當還原糖的含量高于參與反應的氨基化合物時,可能因為除已參與美拉德反應的還原糖外,反應體系中糖類仍有剩余,在后期作為微生物生存的碳源,促進體系微生物的生長繁殖,故在還原糖含量較高時抑菌圈較小。當反應物中花蟹肉酶解多肽較多時,多余的花蟹肉酶解多肽也能為微生物的生長繁殖提供營養(yǎng)物質。因此只有控制木糖與花蟹肉酶解多肽的比例使其反應完全,且得到的抑菌物質最多時,抑菌效果才最強。

圖2 木糖與花蟹肉酶解多肽質量比對 PXMRPs抑菌能力的影響Fig.2 The effects of substrate ratios on the antibacterial ability of PXMRPs

2.2.2 反應溫度對PXMRPs抑菌圈大小的影響 反應物起始pH為7.0,反應物中還原糖和花蟹肉酶解多肽的質量比1∶2,反應時間90 min的條件下,改變反應溫度,制備PXMRPs,其對4種供試菌的抑菌性(用抑菌圈直徑的大小來表示抑菌性的強弱)與反應物中還原糖和花蟹肉酶解多肽質量比的關系如圖3所示。

由圖3可知,隨著反應溫度從110 ℃升高到150 ℃,產物對4種菌的抑菌圈直徑均先快速上升然后緩慢下降,即反應溫度對產物的抑菌性在4種供試菌中的表現(xiàn)趨勢基本相同。方差分析顯示,反應溫度對抑菌圈直徑的組間差異顯著(p<0.05),4種供試菌的抑菌性均在120 ℃時達到最大值。溫度會影響美拉德反應速度,當反應速度較快時,在相同的反應時間內,其產物中的大分子物質(如蛋白黑素)也會較多,雖然高相對分子質量(MI>1000)物質對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果更強[10],但大分子物質從牛津杯中擴散出來的速度較慢,而且也會阻礙其他物質的擴散,抑菌圈也就相對較小。另外當溫度升高時,反應物中蛋白質的熱降解和糖類的焦糖化反應也會加快,使PXMRPs減少而導致產物抑菌性的降低。

圖3 反應溫度對PXMRPs的抑菌能力的影響Fig.3 The effects of reaction temperatures on the antibacterial ability of PXMRPs

2.2.3 反應時間對PXMRPs抑菌圈大小的影響 反應物起始pH為7.0,木糖與花蟹肉酶解多肽質量比1∶2,反應溫度為140 ℃,改變反應時間的條件下,制備得到的PXMRPs,其對4種供試菌的抑菌性與反應溫度的關系如圖4所示。

由圖4可知,隨著反應時間從30 min上升到150 min,產物對4種供試菌的抑菌圈直徑均先上升后下降,在120 min時,4種菌的抑菌圈直徑均達到最大值,方差分析顯示,反應時間120 min時單一菌的抑菌圈直徑與該菌的其余各組之間的差異顯著(p<0.05)。從圖中還可以看出,當反應時間為30、60 min時,其抑菌圈直徑均為7 mm左右,而牛津杯的直徑也為7 mm,可知,在反應時間為30、60 min時,PXMRPs沒有抑菌性,而當反應時間達到90 min時,抑菌性才慢慢開始增強,在反應時間超過120 min后,抑菌性又慢慢開始下降。由此可見,PXMRPs中具有抑菌的物質是在反應的中期開始形成,而且這種物質會在后續(xù)的反應中繼續(xù)參與反應產生其他不具備抑菌性的物質。

圖4 反應時間對PXMRPs的抑菌能力的影響Fig.4 The effects of reaction time on the antibacterial activity of PXMRPs

2.3 正交實驗優(yōu)化PXMRPs抑菌性較強的反應條件

在單因素的基礎上,影響PXMRPs抑菌性的因素主要有木糖與花蟹肉酶解多肽的質量比、反應溫度和反應時間。隨著反應條件的變化,PXMRPs對4種菌的抑菌性趨勢基本相同,故選取產物對其中一種菌的抑菌性作為優(yōu)化反應條件的依據(jù)設計正交實驗,選取木糖與花蟹肉酶解多肽的質量比、反應溫度和反應時間三個因素為自變量,以PXMRPs對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為應變量,設計L9(34)正交實驗表1,采用正交實驗篩選PXMRPs抑菌性最佳的工藝條件組合。實驗結果和方差分析分別見表2,表3。

表2為正交實驗結果和直觀分析,由表中的極差分析的R值可以看出,在影響PXMRPs抑菌性的三個因素中,影響主次關系是反應時間(C)>反應溫度(A)>木糖與花蟹肉酶解多肽質量比(B),正交優(yōu)化條件最佳組合為C2A2B3,即反應時間為120 min,反應溫度為120 ℃,木糖與花蟹肉酶解多肽質量比為2∶1。另外,由方差分析(表3)可知,3個因素對實驗結果都具有顯著影響。由驗證實驗可知,當反應時間為120 min,反應溫度為120 ℃,木糖與花蟹肉酶解多肽質量比為2∶1時得到的PXMRPs的抑菌圈大小為(26.4±0.5) mm,比其他實驗組得到的金黃色葡萄球菌的抑菌圈都要大,說明優(yōu)化的反應條件是可行的。

表2 PXMRPs抑菌性的實驗設計與結果

表3 PXMRPs抑菌性的正交實驗方差分析

2.4 PXMRPs的MIC測定

由表4可見,在優(yōu)化的反應條件下制備的PXMRPs對幾種供試菌種均具有良好的抑制作用,而且隨著質量濃度的增加,產物的抑菌效果增強,產物對蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較強,MIC值均為15 mg/mL(1.5%),對枯草芽孢桿菌的MIC值為20 mg/mL(2%),而對大腸桿菌的MIC值最高(抑菌效果最弱),其值為30 mg/mL(3%)。董周永等[11]研究發(fā)現(xiàn)石榴果皮提取物對金黃色葡萄球菌和李斯特菌的MIC為12.5 mg/mL,對巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的MIC均為25 mg/mL,而對大腸桿菌的MIC為50 mg/mL。另外,李春美等[12]研究發(fā)現(xiàn)用乙醇提取的柚皮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為2.5%,而對沙門氏菌的MIC大于2.5%。由此可見,這些提取物的抑菌活性與PXMRPs的抑菌活性相差不大,有些提取物活性甚至低于PXMRPs的抑菌性。

表4 PXMRPs的MIC測定結果

注：-.代表無菌生長;+.代表有菌生長;++.代表長菌較多。

美拉德反應產生大量碳基化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物及少量含硫有機物,是焙烤食品香氣的重要組成部分。Rufin-Henares J. A等[13]和Vu Thu Trang等[14]的研究表明,MRPs中類黑精以及呋喃、咧哚以及咪唑等衍生物是具有抑菌活性的物質。水產品花蟹中蛋白質富含精氨酸和賴氨酸等鮮味氨基酸,而精氨酸和木糖美拉德反應的混合物能更好抑制食品中常見的病原體和腐敗性微生物如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌等[10]。已有研究得出美拉德反應中蛋白質可以參與反應促使MRPs的產生,MRPs可以螯合金屬,形成羥甲基糠醛(HMF)之類的物質,研究者認為此類物質能有效抑制細菌的生長[10]。

3 結論

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌是常見的食品致病菌,本實驗通過PXMRPs對以上4中常見食品致病菌的抑菌性的研究,并通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化反應條件,比較分析PXMRPs抗菌性最佳的工藝參數(shù)為:木糖與花蟹肉酶解多肽質量比2∶1,反應溫度為120 ℃,反應時間為120 min。實驗結果的方差分析可知,在本實驗范圍內,各因素對制備高效抗菌劑的影響順序是:反應時間>反應溫度>反應物比例。

通過對PXMRPs的抗菌性分析,表明花蟹除了作為蟹糊銷售外也具有開發(fā)成新型抗菌性食品添加劑的潛能,但花蟹肉酶解多肽的美拉德反應產物中具體的化合物種類以及如何抑制細菌的機理有待進一步深究,這為開發(fā)高品質天然蟹味食品添加劑提供了理論基礎。

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Antimicrobial activity of maillard reaction products derived from enzymolysis polypeptide ofPortunuspelagicusmeat

CHEN Jin-bin1,XI Xiu-xiu2,3

(1.Wenling Food and Drug Inspection Center,Wenling 317500,China;2.Department of Food Science and Nutrition,Ningbo University,Ningbo 315211,China;3.Department of Food Engineering,Shanghai University,Shanghai 200444,China)

This study investigated the antimicrobial activity of the maillard reaction products which were obtained from enzymolysis polypeptide of pelagicus meat(PXMRPs)on four selected spoilage bacteria frequently found in food includingStaphylococcusaureus,Waxybacillus,BacillussubtilisandE.coli,and the preparation of PXMRPs process was optimized. The results revealed that the PXMRPs had obvious germ inhibiting effect on the four bacterias. Xylose as the reducing sugar,substrate ratios of xylose and enzymolysis polypeptide of pelagicus meat,temperatures and the reaction time were independent variable in the maillard reaction,the diameter of inhibition zone were measured during single factor test and the orthogonal experiment which was to find the optimal parameter of processing in order to strengthen the antibacterial efficiency of PXMRPs. The optimal processing conditions were that the ratio of enzymolysis polypeptide ofPortunuspelagicusand xylose was 2∶1,the temperature was 120 ℃,the reaction time was 120 min. And the MIC(minimum inhibitory concentration)values ofWaxybacillusandStaphylococcusaureuswere both 15 mg/mL,the MIC values ofBacillussubtilisandE.coliwas 20 mg/mL and 30 mg/mL,respectively. Therefore,enzymolysis polypeptide ofPortunuspelagicusmeat showed strong antimicrobial activity because of the modification of maillard reaction,PXMRPs can be used as an antimicrobial in food industry.

enzymolysis polypeptide ofPortunuspelagicusmeat;maillard reaction products;antibacterial activity

2016-09-13

陳金斌(1984-)，男，本科，工程師，研究方向：食品檢驗，E-mail:13738655550@163.com。

*通訊作者:奚秀秀(1993-)，女，本科，研究方向：食品科學與工程,E-mail:yizhiyinxuan@163.com。

國家自然科學基金項目(31201284 )。

TS201.1

A

1002-0306(2017)05-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.008