蝦源哈維氏弧菌的致病性與生物學特性比較分析

劉 迪，房文紅，周紅霞，王 元，陳甜甜，李 健，周俊芳

(1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306； 3.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025)

蝦源哈維氏弧菌的致病性與生物學特性比較分析

劉 迪1，2，房文紅1，周紅霞3，王 元1，陳甜甜1，2，李 健1，2，周俊芳1

(1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306； 3.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025)

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是導致養(yǎng)殖對蝦暴發(fā)弧菌病的重要病原之一。從我國南方養(yǎng)殖凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)分離、鑒定了10株哈維氏弧菌(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487)，分別肌注感染健康凡納濱對蝦后發(fā)現(xiàn)，菌株Vh21229致病性很弱，Vh00949其次，其它菌株毒力較強；對8種哈維氏弧菌常見毒力基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、toxS、hcp、zot和pap6)的檢測顯示，南方蝦源哈維氏弧菌無論強弱毒株都很少攜帶zot、pap6、toxs和4種Vh基因(≤10%)，表明這10個菌株的致病性與這7種常見毒力因子的相關(guān)度很低；hcp基因在所有菌株中均有檢出，其中強毒株中檢出率較高(50%)，在較弱毒株(Vh00949)中也存在，表明hcp基因與這些菌株的致病性密切相關(guān)，但不是決定性因子。因此，這10株南方蝦源哈維氏弧菌菌株的致病性差異應由這8種常見毒力因子以外的未知或未檢測到的因子所決定。生化特征分析顯示，所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖，而且只有其賴氨酸脫羧酶反應至陽性，而其它菌株均為陰性，推測導致哈維氏弧菌菌株生化特性改變的某種因子可能對菌株的致病性也產(chǎn)生了影響。藥敏實驗表明，10株哈維氏弧菌均對環(huán)丙沙星、氯霉素、恩諾沙星、美羅培南、頭孢曲松、多西環(huán)素、頭孢吡肟、諾氟沙星敏感，而對氨芐西林耐受性強，表明在蝦類養(yǎng)殖過程中應當嚴格規(guī)范和控制抗菌藥物尤其是青霉素類藥物的使用。

哈維氏弧菌； 致病性； 毒力基因； 藥敏實驗； 生化特征

弧菌病是海水動物養(yǎng)殖中危害最為嚴重的病害之一[1]。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，該病呈現(xiàn)傳播速度快、病程短的趨勢。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是導致養(yǎng)殖動物暴發(fā)弧菌病的重要病原之一[2]。作為養(yǎng)殖環(huán)境中的常見菌，哈維氏弧菌廣泛分布于養(yǎng)殖海水及水產(chǎn)動物體內(nèi)外[3]，并在水溫高于20 ℃時大量繁殖。哈維氏弧菌宿主范圍廣泛，能夠感染多種海洋脊椎動物和無脊椎動物[4]，如大黃魚(Larimichthyscroceus)、海鯛(Sparusaurata)、尖吻鱸(Latescalcarifer)等海水魚類、甲殼類動物以及貝類動物[5-9]。

暴發(fā)哈維氏弧菌病的動物，其主要癥狀因宿主種類和其自身的健康狀況而略有差異，如哈維氏弧菌可導致網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚“爛尾病”[9]、高體鰤(Serioladumerili)“體表潰瘍病”[10]和遮目魚(Chanoschanos)等多種魚的“眼病”[11]等。對于甲殼類動物，哈維氏弧菌常感染中國明對蝦(Penaeuschinensis)、凡納濱白對蝦(P.vannamei)和日本囊對蝦(P.japonicus)的苗期個體和幼體，成體也可感染而暴發(fā)弧菌病，且發(fā)病蝦死亡率很高[12-13]，但是，本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)[2]，同為凡納濱對蝦源的哈維氏弧菌分離株，毒性差異可能很大。為了進一步探索哈維氏弧菌的毒力形成機制，本研究從凡納濱對蝦中分離了10株哈維氏弧菌，對這些菌株的常見毒力基因和致病性以及一般生物學特性開展了對比研究，以期為進一步探索哈維氏弧菌的致病機制和哈維氏弧菌病的防治方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離和培養(yǎng)

10株哈維氏弧菌菌株于2009～2015年分離自海南、福建、浙江和上海等省市養(yǎng)殖凡納濱對蝦。無菌挑取對蝦肌肉、肝胰腺組織涂抹到TCBS培養(yǎng)基29 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落在2216E海水培養(yǎng)基(海博)上純化，最后接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB + 2% NaCl)中，29 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，用于分子鑒定。

1.2 16S rRNA基因序列測定和分析

1.2.1 細菌DNA提取

取1 mL TSB細菌培養(yǎng)液，按“細菌基因組提取試劑盒”的說明(天根)操作，制備的細菌基因組總DNA用作PCR模板。

1.2.2 16S rRNA基因序列的PCR擴增與測序

擴增16S rRNA基因的引物為：正向27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′和反向1492R：5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′[14]。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接交由上海生物工程技術(shù)公司進行序列測定，測得的序列經(jīng)BLAST程序比對，確認菌株種類。

1.3 人工感染實驗

健康凡納濱對蝦購自海南瓊海對蝦養(yǎng)殖企業(yè)，體質(zhì)量為(10±0.7) g。將上述分離、鑒定的哈維氏弧菌菌株分別接種于TSB肉湯(TSB + 2% NaCl)培養(yǎng)，29 ℃培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液用PBS(0.1 M，pH 7.4)作10倍比梯度稀釋(101～109)。根據(jù)弧菌生長狀況，每株菌取3個稀釋度的菌液涂布2216E平板培養(yǎng)，采用平板計數(shù)法計數(shù)，同時另取3個稀釋度的菌液從腹側(cè)肌肉注射健康凡納濱對蝦，每個梯度攻毒24 ind對蝦，注射量為50 μL·ind-1，對照組注射等量PBS(0.1 M，pH 7.4)，分別暫養(yǎng)于4個條件相同、水溫控制在(29±1) ℃的120 L玻纖桶中，觀察1周，記錄各組對蝦的發(fā)病和死亡情況。

1.4 藥敏實驗

采用文獻[15-17]描述的微量肉湯稀釋法測定分離哈維氏弧菌對16種常用抗菌藥物(表1)的敏感性。以大腸桿菌ATCC25922 作為質(zhì)控菌株，并設(shè)置陽性(無抗生素菌液)和陰性(MH肉湯)對照，將無菌生長的最低藥物濃度視為最小抑菌濃度(MIC)。

1.5 生化特性鑒定

上述哈維氏弧菌首先經(jīng)革蘭氏染色鑒定，確定全部為革蘭氏陰性(G-)，然后采用生物梅里埃ATB自動細菌鑒定儀和G-細菌鑒定卡進行鑒定。10株哈維氏弧菌經(jīng)28 ℃培養(yǎng)18 h后，將調(diào)好密度的菌液按說明書上的方法分別加入到試劑條內(nèi)，28 ℃孵育過夜后，在細菌鑒定儀上讀取鑒定結(jié)果。

1.6 毒力相關(guān)基因檢測

[18-20]，采用分子生物學方法檢測了上述哈維氏弧菌的常見毒力相關(guān)基因，包括哈維氏弧菌溶血素基因(Vh1、Vh2、Vh3和Vh4)、弧菌毒力調(diào)控基因(toxS)以及其它弧菌毒力相關(guān)基因(hcp、zot和pap6)。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈維氏弧菌分離和鑒定

細菌培養(yǎng)后，在TCBS上形成黃色和綠色兩種菌落，在2216E上全部為圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊的乳白色菌落。所有純化菌落，經(jīng)16S rRNA基因測定并測序分析后，分別鑒定為哈維氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌等。根據(jù)測序結(jié)果，對獲得的10株哈維氏弧菌菌株(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487)分別進行致病性分析。

2.2 哈維氏弧菌分離株的致病性

哈維氏弧菌感染健康凡納濱對蝦后，觀察期內(nèi)，感染組對蝦出現(xiàn)不同程度的紅體和死亡現(xiàn)象，而對照組對蝦攝食良好，沒有出現(xiàn)發(fā)病特征。以觀察期內(nèi)感染組對蝦出現(xiàn)半數(shù)死亡所需感染菌的最小數(shù)量為判定標準，把10株哈維氏弧菌分為強弱致病菌株，如表2所示。從表2中可以看出，哈維氏弧菌菌株Vh00947、Vh11011、Vh21217、Vh21220、Vh21231和Vh31487的致病性很強，攻毒弧菌數(shù)小于1 000 cfu·ind-1即可導致觀察期內(nèi)被感染對蝦死亡50% 以上(LD50≤1×103cfu·ind-1)；菌株Vh11014和Vh21218致病性較強，攻毒弧菌數(shù)小于10 000 cfu·ind-1可導致觀察期內(nèi)被感染對蝦死亡50%以上(1×1031×105cfu·ind-1)最弱。

表1 抗菌藥物及其MIC判定折點Tab.1 Antimicrobials and their breakpoints for MIC (μg·mL-1 )

注: *: 環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、美羅培南、慶大霉素和氨芐西林的MIC闡釋標準參考CLSI(2010)中關(guān)于弧菌屬藥物敏感性的判定標準[16]，多西環(huán)素、氯霉素、土霉素和磺胺甲噁唑參考霍亂弧菌的藥敏判定標準[16]；氟苯尼考和恩諾沙星參考獸醫(yī)版本腸桿菌科的藥敏判定標準CLSI(2008)[15]；紅霉素和利福平參考CLSI(2008)中腸球菌的判定標準[15]；諾氟沙星、頭孢曲松和硫酸新霉素是CLSI(2014)中氣單胞菌的判定標準[17]；-：無對應的參考標準

Note: *:MICbreakpoints for ciprofloxacin, cefepime, meropenem, gentamicin, amplicillin, doxycycline, chloramphenicol, oxytetracycline and sulfamethoxazole are described by CLSI (2010)[16], and the breakpoints for the latter four agents are usually used forV．choleraonly, breakpoints for florfenicol and Enrofloxacin refers to the CLSI (2008)[15]used for Enterobacteriaceae, breakpoints for erythromycin and rifampicin are recommended by CLSI (2008) used forEnterococcussp.[15], breakpoints for Norfloxacin, Ceftriaxone and Neomycin Sulphate refers to the CLSI (2014) used forAeromonassp.[17], -: No criteria available

表2 10株哈維氏弧菌分離株的致病性Tab.2 Pathogenicity degree of the 10 V. harveyi isolates

注：+++：感染菌數(shù)小于1×103cfu·ind-1；++：感染菌數(shù)小于1×104cfu·ind-1；+：感染菌數(shù)小于1×105cfu·ind-1；±：感染菌數(shù)大于1×105cfu·ind-1

Note:+++: infectious bacteria number ≤1×103cfu·ind-1， ++: infectious bacteria number≤1×104cfu·ind-1， +: infectious bacteria number≤1×105cfu·ind-1， ±infectious bacteria number: >1×105cfu·ind-1

2.3 藥物敏感性

10株哈維氏弧菌的藥物敏感性如表3所示，10株菌對不同藥物的敏感程度存在較大差異。所有分離菌株都對環(huán)丙沙星、氯霉素、恩諾沙星、美羅培南、頭孢曲松、多西環(huán)素、頭孢吡肟、諾氟沙星敏感，而對氨芐西林嚴重耐受，對其它藥物如硫酸新霉素、利福平、氟苯尼考、土霉素、慶大霉素和磺胺甲惡唑的敏感情況差異較大。

2.4 生化特性

10株哈維氏弧菌菌株的生化特性見表4。從表4可以看出，在48項G-菌鑒定項目中，所有的菌都反應為陽性的項目為丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、D-葡萄糖和L-脯氨酸芳胺酶3種，而反應為陰性的項目有側(cè)金盞花醇、L-阿拉伯醇、D-纖維二糖、H2S產(chǎn)生、谷氨酰芳胺酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、D-甘露醇、β-木糖苷酶、β-丙胺酸芳胺酶、脂酶、古老糖、尿素酶、D-塔格糖、檸檬酸鹽(鈉)、丙二酸鹽、5-酮-葡萄糖苷、乳酸鹽產(chǎn)減、α-葡萄糖、琥珀酸鹽產(chǎn)減、N-乙酰-β-半乳糖氨酶、α-半乳糖苷酶、氨基乙酸芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶、脫羧酶陰性控制、組氨酸同化、β-葡萄糖苷酸酶等26項，而且所有菌都表現(xiàn)為O/129敏感，符合弧菌的特征；其它鑒定項目如吡咯烷基芳胺酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、葡萄糖發(fā)酵、β-葡萄糖苷酶、D-麥芽糖、D-甘露糖、酪氨酸芳胺酶、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、磷酸酶、賴氨酸脫羧酶、COURMARATE、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶、L-蘋果酸鹽同化、ELLMAN和L-乳酸鹽同化等項目的反應則有所不同，表現(xiàn)了各自特有的生化特征。

表3 16種抗菌藥物對不同哈維氏弧菌菌株的MIC值Tab.3 MIC values of 16 antimicrobial agents to the 10 V. harveyi isolates

表4 10株哈維氏弧菌的生化特征Tab.4 Biochemical characteristics of the 10 V. harveyi isolates

注：+：陽性；-：陰性；(+)：可疑陽性；(-)：可疑陰性

Note: +: Positive; -: Negative; (+): Doubtfully positive; (-): Doubtfully negative

2.5 毒力基因檢測

為了探究菌株毒力與常見毒力因子的相關(guān)性，本研究對該10株哈維氏弧菌菌株常見毒力基因的攜帶情況進行了PCR檢測，結(jié)果如表5所示：hcp基因總檢出率和強毒株中檢出率最高，均為50%，但是，該基因也出現(xiàn)在較弱毒株Vh00949中；Vh1、zot和pap6基因的總檢出率較低，均為10%；toxS、Vh2、Vh3和Vh4基因在所有菌株中均未檢測到。

表5 8種毒力因子的檢出率Tab.5 Detection rates of 8 virulence genes carried by the 10 V. harveyi isolates

3 討論

哈維氏弧菌呈世界范圍分布，廣泛分布于近海岸水環(huán)境，也是部分水生脊椎動物和無脊椎動物腸道中正常存在的菌群，主要存在于海洋動物體表、鰓和腸道等組織器官[21]。盡管哈維氏弧菌是一種條件致病菌，但是，近幾年的研究表明，哈維氏弧菌是許多水產(chǎn)動物的原發(fā)病原[2]，可導致魚、蝦、貝類等在育苗和養(yǎng)殖過程中暴發(fā)疾病甚至大量死亡，經(jīng)濟損失嚴重[5, 21]。

本研究從養(yǎng)殖凡納濱對蝦分離了10株哈維氏弧菌，從致病性研究可知，同為凡納濱對蝦來源的不同哈維氏弧菌菌株的致病性存在很大差異：Vh21229致病性很弱，Vh00949其次，其它菌株的毒力均很強。SAEED[22]研究認為，這種致病性的強弱差異主要是由弧菌的某種或某些可遺傳的毒力因子決定的。LIU等[23]的研究也表明，哈維氏弧菌分泌的毒力因子胞外蛋白酶、磷脂酶或溶血素可能對斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的致病性起重要作用。由于對哈維氏弧菌病認識較晚，對其毒力因子和致病機制的研究尚不夠充分，已有研究顯示[21]，哈維氏弧菌的毒力因子主要有毒力因子表達調(diào)控類、溶血素類、共調(diào)蛋白類、粘附毒素類以及蛋白酶類等。為了初步探索毒力因子與菌株致病性強弱的關(guān)聯(lián)性，本研究檢測了哈維氏弧菌常見的8種毒力因子基因，即毒力表達調(diào)控基因(toxS)、溶血素基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4)、溶血素共調(diào)蛋白基因(hcp)、小帶粘附毒素基因(zot)和金屬蛋白酶基因(pap6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國南方地區(qū)的哈維氏弧菌無論強弱毒株都很少攜帶zot、pap6、toxS和4種Vh基因，表明這些蝦源哈維氏弧菌菌株的致病性與這7種常見毒力因子的相關(guān)度很低；hcp基因的總檢出率和在強毒株中的檢出率都維持在50%，表明hcp基因與南方蝦源哈維氏弧菌的致病性密切相關(guān)。研究認為[24]，hcp基因主要在粘附因子基因的表達、體外細胞系有效的粘附定植、抗吞噬作用及生物被膜形成中扮演重要的角色。但是，由于hcp在強毒株中的檢出率不到100%，而且在較弱毒株(Vh00949)中也存在，表明這些蝦源哈維氏弧菌菌株的致病性差異應由這8種常見毒力因子以外的未知或未檢測的因子所決定。隨后的生化特征分析顯示，所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖，而且只有其賴氨酸脫羧酶反應陽性，而其它菌株均為陰性，推測導致哈維氏弧菌菌株生化特性改變的某種因子可能對菌株的致病性也產(chǎn)生了影響。此外，在生產(chǎn)實踐中，感染動物的發(fā)病程度除了與菌株毒力相關(guān)外，還與菌株的耐藥種類和耐藥程度密切相關(guān)[25]，后者決定了防治措施的有效性。本研究中10株哈維氏弧菌分離株藥敏譜差異較大，但是，都對環(huán)丙沙星等喹諾酮類、頭孢曲松等頭孢類和氯霉素等酰胺醇類敏感，而對氨芐青霉素嚴重耐受。由于菌株耐藥現(xiàn)象與藥物使用方法和耐藥基因的產(chǎn)生關(guān)系密切[26]，因此，在蝦類養(yǎng)殖過程中應當嚴格規(guī)范和控制抗菌藥物尤其是青霉素類藥物的使用，遏制耐藥基因的產(chǎn)生與擴散，從而確保疾病有效防治。

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A comparative study on pathogenicity and biochemical characteristics ofVibrioharveyistrains isolated fromPenaeusvannamei

LIU Di1,2, FANG Wen-hong1, ZHOU Hong-xia3, WANG Yuan2, CHEN Tian-tian1,2, LI Jian1,2, ZHOU Jun-fang1

(1.KeyLaboratoryofEastChinaSeaandOceanicFisheryResourcesExploitationandUtilization,MinistryofAgriculture,EastChinaseaFisheriesResearchInstitute,ChinaAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China; 3.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

Vibrioharveyiis one of the major pathogens responsible for the shrimp vibriosis. In this study, 10 V.harveyi strains (Vh00947, Vh00949, Vh11011, Vh11014, Vh21217, Vh21218, Vh21220, Vh21229, Vh21231 and Vh31487) were isolated fromPenaeusvannameiin southern China and identified. The animal infection experiment showed that all the strains were virulent toP.vannameiexcept Vh21229 and Vh00949. The detection of 8 common virulence genes ofV.harveyi(Vh1,Vh2,Vh3,Vh4,toxS,hcp,zotandpap6) showed that these southern China shrimp-derivedV.harveyistrains, whether virulent or lentogenic, rarely carried zot, pap6 and 4Vhvirulence genes (≤ 10%), indicating that the pathogenicity of these 10 strains was in low relation to the 7 common virulence genes. The hcp gene was found in both virulent and lentogenic strains, suggesting that hcp gene is closely related to the pathogenicity of the 10 strains, but not the decisive factor and the pathogenicity of 10 strains was decided by some unknown or undetected factors other than the 8 common virulence factors. The biochemical characteristics analysis showed that in the 10 strains, Vh21229 strain was the only one that was negative for D-mannose, sucrose and D-trehalose while positive for lysine decarboxylase. So it is speculated that the factors altering the biochemical charcteristics ofV.harveyialso alter its pathogericity. The drug susceptibility test showed that all the 10 strains were susceptible to ciprofloxacin, chloramphenicol, enrofloxacin, meropenem, ceftriaxone, doxycycline, cefepime and norfloxacin but highly resistant to ampicillin, suggesting that the antimicrobial agents, especially penicillins, should be strictly controlled during the shrimp farming.

Vibrioharveyi; pathogenicity; virulence genes; antimicrobial susceptibilitytest; biochemical characteristics

1004-2490(2017)02-0197-09

2016-03-29

上海市自然科學基金(12ZR1436700)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項基金(No.201303047);上海市蝦類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目[滬農(nóng)科產(chǎn)字(2014)第5號]

劉 迪(1990-)，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物病害學研究。

周俊芳，副研究員。 Tel: 021-65699301，E-mail: zhoujf@ecsf.ac.cn

Q 93-331

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