131I標(biāo)記的甲狀腺未分化癌人源單鏈抗體在荷瘤裸鼠模型的放射免疫顯像

劉 倩

劉 瓊LIU Qiong

李文波LI Wenbo

許 璐XU Lu

周 靜ZHOU Jing

劉 影LIU Ying

龐 華PANG Hua

131I標(biāo)記的甲狀腺未分化癌人源單鏈抗體在荷瘤裸鼠模型的放射免疫顯像

劉 倩LIU Qian

劉 瓊LIU Qiong

李文波LI Wenbo

許 璐XU Lu

周 靜ZHOU Jing

劉 影LIU Ying

龐 華PANG Hua

目的測定131I標(biāo)記的甲狀腺未分化癌（ATC）人源單鏈抗體（scFv）的放射性純度與比活度，并探討其在荷瘤裸鼠模型的體內(nèi)分布情況和放射免疫顯像特點(diǎn)，以期為ATC的診斷及治療提供一種新的方法。材料與方法接種ATC細(xì)胞構(gòu)建荷人ATC裸鼠模型。采用氯胺T法實(shí)現(xiàn)scFv的131I標(biāo)記，Sephadex G25M柱純化標(biāo)記抗體，采用三氯醋酸法測定其標(biāo)記率，采用紙層析法測定131I標(biāo)記scFv的放化純度、室溫穩(wěn)定性及血清穩(wěn)定性。荷瘤裸鼠尾靜脈注射131I-scFv后12、24、48、72 h取各組織器官分析131I-scFv在體內(nèi)組織器官中的生物分布情況，另取荷瘤裸鼠尾靜脈注射131I-scFv后12、24、48、72 h進(jìn)行SPECT靜態(tài)顯像，觀察瘤內(nèi)放射性濃聚，待腫瘤清晰顯影，進(jìn)行SPECT/CT圖像融合。結(jié)果純化后的131I-scFv標(biāo)記率為91.64%，放化純度為（93.3±0.3）%；131I-scFv放于室溫及血清孵育1、6、12、24 h后所測得放射性化學(xué)純度均高于90%。131I-scFv在腫瘤組織、肝、腎、腸、血液中具有較高的放射性分布。SPECT顯示131I-scFv能夠在腫瘤組織中選擇性濃聚，腫瘤組織靶/非靶比值在48 h時達(dá)最高為4.38，且顯影最清晰。結(jié)論成功制備131I-scFv，131I-scFv在荷瘤裸鼠模型中有較好的顯像效果，為進(jìn)一步開展ATC的診斷及治療研究奠定基礎(chǔ)。

甲狀腺腫瘤；癌；碘放射性同位素；單鏈抗體；放射免疫顯像；體層攝影術(shù)，發(fā)射型計(jì)算機(jī)，單光子；體層攝影術(shù)，X線計(jì)算機(jī)；疾病模型，動物；小鼠，裸

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）是惡性程度最高的甲狀腺腫瘤，在所有甲狀腺惡性腫瘤中預(yù)后最差，約占所有甲狀腺癌的7%～8%[1]。ATC的治療效果較乳頭狀癌、濾泡狀癌和髓樣癌差。目前，ATC的治療方法主要有基因治療、抗腫瘤血管形成的基因治療、鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因介導(dǎo)的放射性碘治療、誘導(dǎo)分化治療以及放射免疫治療。目前對ATC的治療尚缺乏有效的手段，分子靶向藥物和腫瘤疫苗等新的治療方法的出現(xiàn)為ATC的治療提供了可能[2]。隨著噬菌體抗體庫技術(shù)的成熟，通過該方法獲得的人源單鏈抗體克服了鼠源性單克隆抗體的不足?？贵w作為實(shí)現(xiàn)生物靶向運(yùn)輸?shù)妮d體是提高顯像和治療效果的關(guān)鍵，在臨床腫瘤放射免疫治療中顯示出巨大的潛力。放射免疫治療是將放射性核素與具有導(dǎo)向性的特異抗體耦聯(lián)制成放射免疫藥物進(jìn)行體內(nèi)治療的方法，為ATC的診斷和治療提供了新的思路[2-3]。

前期研究已運(yùn)用噬菌體抗體庫技術(shù)建立了ATC噬菌體抗體庫，通過4輪篩選，得到了ATC噬菌體單鏈抗體，并對所得到的抗體進(jìn)行生物學(xué)鑒定。本研究用131I標(biāo)記得到的人源ATC單鏈抗體scFv，檢測其在荷瘤裸鼠模型的放射免疫顯像。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 人源ATC單鏈抗體scFv由本實(shí)驗(yàn)組前期制備[4]；ARO細(xì)胞株（人ATC細(xì)胞）購于吉尼歐生物科技有限公司；131I購于成都中核高通同位素股份有限公司；氯胺T、偏重亞硫酸鈉購于成都西亞試劑有限公司；碘化鉀、三氯醋酸、正丁醇、乙酸均購于上海試劑三廠；裸鼠購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；血清購于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血庫；Siemens Symbia T2 SPECT/CT儀。

1.2 方法

1.2.1131I-scFv制備及純化 氯胺T法標(biāo)記制備131I-scFv：250 μl scFv混于100 μl131I（放射性強(qiáng)度為50 mCi/ml）中，3 min后加氯胺T 250 μl（1 mg/ml），1 min后加入500 μl偏重亞硫酸鈉溶液（2 mg/ml），使其充分混勻1 min，加入100 μl KI終止反應(yīng)。將混合液上Sephadex G25M柱純化，0.45 μm過濾器過濾。采用三氯醋酸法檢測131I-scFv標(biāo)記率。采用紙沉析法檢測131I-scFv放化純度，并計(jì)算其放射性比活度。純化的131I-scFv置于室溫下1、6、12、24 h，分別檢測各時間點(diǎn)的放化純度，分析其室溫穩(wěn)定性。將131I-scFv純化液加入新鮮人血清，37℃培養(yǎng)1、6、12、24 h后檢測放化純度，分析其血清穩(wěn)定性。

1.2.2 荷人ATC裸鼠模型構(gòu)建 ARO細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種至約為4周齡的雌性裸鼠的右前肢皮下，待腫塊體積＞1 cm3時，觀察131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況，并進(jìn)行放射免疫顯像。

1.2.3131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布 選取裸鼠8只，分為4組，每組2只。尾靜脈注射50 μl131I-scFv（18.5 MBq），在注射后12、24、48、72 h處死4組裸鼠，取腫瘤、肝、腎、脾、心臟、肺、胃、腸、腦、肌肉、血液組織進(jìn)行稱重，用γ計(jì)數(shù)器進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。根據(jù)公式（1）計(jì)算各組織每克組織的百分注射劑量率（%ID/g）。

1.2.4131I-scFv在荷瘤裸鼠的SPECT放射免疫顯像 取提前用KI封閉好甲狀腺的裸鼠4只，經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉后，尾靜脈注射0.1 ml131I-scFv，俯臥位固定于木板上，注射后12、24、48、72 h進(jìn)行SPECT靜態(tài)顯像測得腫瘤組織靶/非靶（T/NT）值，T/NT值是腫瘤部位與對側(cè)相應(yīng)部位放射性比值。腫瘤清晰顯像時，SPECT/CT圖像融合，觀察裸鼠體內(nèi)放射性濃聚。

2 結(jié)果

2.1131I-scFv的制備與純化 運(yùn)用氯胺T法成功用131I標(biāo)記scFv，且收集標(biāo)記液上Sephadex G25M柱純化后獲得100管淋洗液，檢測每管放射性計(jì)數(shù)呈現(xiàn)2個放射峰，第一放射峰位于33～49管，第二放射峰位于57～64管，第一放射峰對應(yīng)的收集管淋洗液即為純化的131I-scFv標(biāo)記液，見圖1。采用三氯醋酸法測得標(biāo)記率為91.64%，紙層析法測得放化純度為（93.3±0.3）%，放射化學(xué)比活度為（3.38±0.64）MBq/μg。131I-scFv置于室溫下1、6、12、24 h的放化純度分別為95.9%、93.8%、92.5%、91.3%，見圖2。131I-scFv與新鮮人血清孵育1、6、12、24 h的放化純度分別為95.2%、94.5%、93.0%、91.9%，見圖3。

2.2 荷人ATC裸鼠模型構(gòu)建 成功構(gòu)建荷人ATC裸鼠模型，且于4周時腫塊長至1 cm。

2.3131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布情況131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)主要分布于腫瘤、肝、腎、脾、心臟、肺、胃、腸、腦、肌肉、血液組織，其中腫瘤組織、肝、腎、腸、血液在早期均有較高的放射性，見表1。

2.4131I-scFv荷瘤裸鼠SPECT/CT放射免疫顯像 SPECT/CT顯像結(jié)果顯示在荷瘤裸鼠尾靜脈注射131I-scFv 后48 h，荷瘤裸鼠腫瘤組織仍顯像清晰，見圖4。SPECT靜態(tài)顯像測得腫瘤組織T/NT值48 h最高為4.38，身體其他部位放射性濃聚明顯降低，見圖5。

圖1131I-scFv純化

圖2131I-scFv室溫穩(wěn)定性檢測

圖3131I-scFv血清穩(wěn)定性檢測

表1131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布情況（±s，%ID/g）

表1131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布情況（±s，%ID/g）

部位12 h24 h48 h72 h肝9.92±0.314.57±0.232.97±0.691.32±0.33腎8.72±0.117.59±0.476.08±0.724.23±0.91腸6.57±0.724.32±0.643.32±0.530.96±0.32血液5.67±0.894.43±0.251.09±0.120.55±0.07脾5.32±0.573.29±0.581.72±0.370.56±0.20腫瘤4.47±0.564.31±0.724.01±0.663.23±0.09心臟4.05±0.071.98±0.200.87±0.220.40±0.02胃3.73±0.981.43±0.241.05±0.630.77±0.36肌肉3.08±0.281.59±0.390.65±0.320.54±0.65肺2.73±0.111.57±0.520.69±0.760.38±0.55腦1.56±0.110.89±0.120.73±0.260.37±0.08

圖4131I-scFv荷瘤裸鼠SPECT/CT融合顯像（48 h），分別為矢狀位（A）、冠狀位（B）、橫斷面（C）及3D融合圖像（D）

圖5 注射131I-scFv后不同時間荷瘤裸鼠腫瘤組織SPECT靜態(tài)顯像

3 討論

放射免疫顯像是利用放射性核素耦聯(lián)具有導(dǎo)向性的特異抗體制成放射免疫藥物進(jìn)行體外顯像的方法，其優(yōu)勢是利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，并與影像檢查方法相結(jié)合，對腫瘤的早期定位、定性診斷具有十分重要的價值[5]。目前，放射免疫顯像在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于不同系統(tǒng)腫瘤疾病的顯像，包括骨骼系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等[6-7]，其良好的顯像效果有助于疾病的診斷，Luo等[8]制備了肺腺癌的人源單鏈抗體，并在荷瘤裸鼠進(jìn)行放射免疫顯像。

本研究前期運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)，成功建立人源ATC噬菌體抗體庫并篩選出特異性、可溶性的ATC抗體，對其生物學(xué)特性進(jìn)行檢測。本研究將131I標(biāo)記的scFv注入荷ATC裸鼠體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)放射免疫顯像。本研究將131I標(biāo)記在抗體分子上，使ATC細(xì)胞間接吸碘，從而達(dá)到顯像的目的。本研究結(jié)果顯示，荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射131I-scFv后48 h腫瘤顯像清晰，同時T/NT值也在48 h最高，達(dá)4.38，提示該抗體對ATC細(xì)胞具有特異性。放射免疫顯像的最終目的是探索放射免疫治療方法，即利用放射性藥物標(biāo)記抗體后能特異性地與腫瘤抗原結(jié)合，針對性地破壞甚至殺死腫瘤細(xì)胞[9]。131I是目前臨床上用于甲狀腺疾病診斷及治療的良好顯像劑[10]，將其與純化的scFv結(jié)合，用于荷瘤裸鼠的顯像，以期為ATC的診斷和治療提供一種新的思路。本課題組將進(jìn)一步研究131I-scFv與腫瘤藥物耦聯(lián)后注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)的抑瘤效果，探討治療ATC的新方法。

本研究的局限性：在進(jìn)行131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)中，每組選取裸鼠2只，數(shù)量較少，可能會影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會增加裸鼠數(shù)量進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)分布的研究。顯像早期，血液、肝臟、腎臟組織均具有較高的放射性濃聚，但是隨著時間延長，上述部位的放射性濃聚顯著降低。腎臟放射性濃聚高可能與標(biāo)記抗體的排泄有關(guān)，肝臟高濃聚則可能是因?yàn)楸痪W(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞非特異性攝取，或存在一些Fc受體[11-12]。因此，如何能夠在設(shè)計(jì)scFv時對其進(jìn)行一些化學(xué)修飾，減少肝臟等非腫瘤組織的放射性攝取，使其能夠長時間停留于腫瘤組織，是以后需要重點(diǎn)完善的內(nèi)容。

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（本文編輯 饒亞嵐）

Radioimmunoimaging of131I Labeled Human scFv Against Anaplastic Thyroid Carcinoma in Tumor Bearing Nude Mice

PurposeTo study the radioactive purity and activity of131I labeled human single chain variable fragments antibodies (scFv) against anaplastic thyroid carcinoma (ATC), and to explore its distribution and radioimmunoimaging characteristics in tumor bearing nude mice modelin vivoso as to provide a new method for anaplastic thyroid carcinoma diagnosis and treatment.Materials and MethodsThe nude mice model bearing human anaplastic thyroid carcinoma was constructed. The chloramine T method was used to label scFv with131I and the Sephadex G25M was used for puri fi cation of labeled scFv. Labeling rate was determined by trichloroacetic acid method; radiochemical purity, room temperature stability and serum stability were examined using paper chromatography.131I-scFv was injected via tail vein in mice, and the distribution of131I-scFv in body tissues and organs was analyzed at 12, 24, 48, 72 h after injection. Static SPECT imaging was performed at 12, 24, 48, 72 h after injection to observe the intratumoral accumulation of radioactivity. The SPECT/CT image fusion was performed when the tumor tissues were clearly visible.Results131I-scFv was purified, and the labeling rate was 91.64%; the radiochemical purity was (93.3±0.3)%. The radiochemical purity of131I-scFv placed at room temperature and the serum for 1, 6, 12, 24 h were all ＞90%. The radioactive distribution of131I-scFv in tumor, liver, kidney, intestine and blood was high. SPECT imaging showed131I-scFv was selectively concentrated in tumor tissue; the target/non-target ratio was the highest at 48 h, and the imaging was most satisfactory.Conclusion131I-scFv can be successfully prepared. SPECT imaging of131I-scFv in nude mice model is satisfactory, which lays the foundation for further research in ATC diagnosis and treatment.

Thyroid neoplasms; Carcinoma; Iodine radioisotopes; Single-chain antibodies; Radioimmunodetection; Tomography, emission-computed, single-photon; Tomography, X-ray computed; Disease models, animal; Mice, nude

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 重慶400016

龐 華

Department of Nuclear Medicine, the First Af fi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Address Correspondence to:PANG Hua

E-mail: ph1973@163.com

國家自然科學(xué)基金（81071171）；重慶市科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（CSCT2013JCYJA10072）；國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（國衛(wèi)辦醫(yī)函[2013]544號）。

R445.5；R736.1

2016-12-13

修回日期：2017-03-30

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2017年 第25卷 第5期：321-324

Chinese Journal of Medical Imaging

2017 Volume 25 (5): 321-324

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.05.001