抗菌消炎婦科中藥的篩選及臨床前實驗研究

左春連+韓成云+劉智凱+晏渠如

[摘要]目的 探討婦科生殖系統(tǒng)感染的治療藥物，篩選抗菌消炎效果特別顯著的中藥。 方法 選擇抗菌消炎的4種中藥：樹參、藤石松、松蘿和石仙桃，分別用水提法和醇提法提取其組分，將其提取物配為相同濃度的溶液，分組為中藥處理組（n=25）和水CK1、乙醇CK2對照組（n=25）。培養(yǎng)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣大腸埃希菌，采用管碟法測定中藥提取液的抑菌圈，評價抑菌效果。結果 4種中藥水提液中，抑菌效果最好的是藤石松，對3種細菌的抑制效果都很明顯，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），樹參對金黃色葡萄球菌的抑制效果較強，抑菌效果與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其次是松蘿，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。4種中藥醇提液中，抑菌效果最好的是樹參，對3種菌的抑制效果都很明顯，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），樹參和松蘿的醇提液抑菌效果幾乎相當，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 樹參和松蘿醇提液、藤石松水提液的抑菌效果顯著，適合在婦產(chǎn)科臨床上外用，樹參的水煎煮汁液口服，臨床上均有抗菌消炎效果。

[關鍵詞]婦科炎癥；樹參提取物；藤石松提取物；抗菌消炎；篩選

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（c）-0121-04

Screening of Chinese herbal medicine for antibacterial anti-inflammatory in department of gynaecology and preclinical experimental study

ZUO Chun-lian1 HAN Cheng-yun2 LIU Zhi-kai2 YAN Qu-ru2

1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Yuanzhou District Maternal and Child Health Hospital in Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Yichun University in Jiangxi Province，Yichun 336000，China

[Abstract]Objective To study the drug of treating gynecological reproductive system infection，and screen the Chinese herbal medicine with very good antibacterial anti-inflammatory effect.Methods Four kinds of Chinese herbal medicines were selected as the antibacterial and antiphlogistic drugs：Dendropanax dentiger Merr.，Lycopodium japonicum Thunb，Usnea diffracta Vain，Pholido-ta cantonensis Rolfe.They were extracted by water extraction and ethanol extraction，and then they were mixed into the same concentration solution.The group was the treatment group of Chinese herbal medicine （n=25），and water CK1 and ethanol CK2 control group （n=25） respectively.Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Staphylococcus aureus were Cultured，and the bacteriostatic ring was determined of Chinese herbal medicine extract by tube plate method to evaluate the bacteriostatic effect.Results Among 4 kinds of water extract of Chinese herbal medicine，Lycopodium japonicum Thunb had the best bacteriostatic effect，and it had a very obvious bacteriostatic effect for 3 kinds of bacteria，and there was a statistical difference compared with control group （P<0.01），and bacteriostatic effect of Dendropanax dentiger Merr.was stronger for Staphylococcus aureus，and there was a statistical difference of bacteriostatic effect compared with control group （P<0.05），Usnea diffracta Vain was following，and there was a statistical difference compared with control group （P<0.05）.Among 4 kinds of alcohol extract of Chinese herbal medicine，Dendropanax dentiger Merr.had the best bacteriostatic effect，and it had a very obvious bacteriostatic effect for 3 kinds of bacteria，and there was a statistical difference compared with control group （P<0.05），and bacteriostatic effect of alcohol extract for Dendropanax dentiger Merr. and Usnea diffracta Vain was almost quite，and there was a tatistical difference compared with comtrol group （P<0.05）.Conclusion Bacteriostatic effect of alcohol extract of Dendropanax dentiger Merr.and Usnea diffracta Vain and the water extract of Lycopodium japonicum Thunb is obvious which is suitable for external use in clinical obstetrics and gynecology.Oral water decoction juice of Dendropanax dentiger Merr. for oral admina has an antibacterial anti-inflammatory in clinic.

[Key words]Gynecological inflammation；Dendropanax dentiger extract；Lycopodiastrum casuarinoides extract；Antibacterial anti-inflammatory；Screening

孕產(chǎn)婦生殖道感染為常見的婦科疾病。婦科炎癥如果沒有及時控制，可能導致流產(chǎn)。在孕產(chǎn)婦分娩時及產(chǎn)褥期病原體對生殖道侵襲后，造成局部或全身感染，并由此引發(fā)全身炎癥反應綜合征，造成產(chǎn)褥感染。目前主要治療藥物仍然為抗生素。然而，近年來隨著抗生素特別是各種廣譜抗生素的大量使用，細菌的不斷變異，菌群分布及耐藥性也出現(xiàn)了較大的變化。

對婦科慢性宮頸炎、盆腔炎等細菌性炎癥的臨床藥物治療，西醫(yī)治療婦科慢性盆腔炎往往難以奏效，而中醫(yī)中藥的治療有其獨特的優(yōu)勢。近幾年來，報道了不少中藥治療慢性盆腔炎的有效方劑及方法。

本研究對樹參、藤石松等4種中藥進行抗菌篩選實驗，為婦科感染病原細菌治療提供可靠有效的天然藥物。采用中藥進行孕產(chǎn)婦生殖道感染預防和抗菌消炎，中藥相對于抗菌素和激素類藥物，對胎兒發(fā)育的影響和風險降低，具有安全、療效好和經(jīng)濟實用的優(yōu)點。

1儀器與材料

1.1 供試菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Sa），產(chǎn)氣大腸埃希菌（E. coli-aerogenes group）

1.2 供試藥用植物

樹參（Dendropanax dentiger Merr.）莖組織，藤石松（Lycopodium japonicum Thunb）莖和針葉，松蘿（Usnea diffracta Vain）、石仙桃（Pholido-ta cantonensis Rolfe）全株。

1.3 實驗儀器

數(shù)顯恒溫水浴器（HH-4）國華電器；氣浴恒溫搖床（THZ-820）國旺儀器；冰箱（容聲BCD-185DKA）；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）蘇凈安泰；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）上海博訊實業(yè)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LS-50HJ）江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；超純水器（UPWS-I-10T）杭州永潔達凈化有限公司；電磁爐（GCA16）珠海格力小家電有限公司， 牛津杯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍、量筒、燒杯、開口瓶、接種環(huán)、千分尺等。

1.4 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g， 加純凈水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值達7.0。

LB固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂15～20 g，加純凈水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值達7.0，高溫高壓滅菌，制作培養(yǎng)基。

2方法與結果

2.1制備中藥提取物

2.1.1藥用植物水提液的制備 稱取每種供試植物干品20 g，絞碎后置電磁爐（GCA16）中，加超純水 500 ml，浸泡4 h后，用小火煮 30 min，過濾，離得上清液，殘渣再加 500 ml 水煮 30 min，合并濾液，加熱濃縮至 50 ml。水提液置立式壓力蒸汽滅菌器（LS-50HJ）中高溫高壓（120℃，30 min）滅菌后放入超凈工作臺備用。

2.1.2藥用植物醇提液的制備 稱取每種供試植物干品5 g，絞碎后分別置帶塞廣口瓶中，加入75%乙醇100 ml浸泡48 h，經(jīng)過濾離心，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 ml（濃度為1 g/ml），醇提液經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）除菌后放入超凈工作臺備用。

2.2細菌培養(yǎng)基的制備

將培養(yǎng)皿和試管用報紙包好，按照配方配制好固液培養(yǎng)基，然后一同放入高壓滅菌鍋中滅菌，固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制作平板，液體配基倒入試管中。

2.3菌懸液的制備

用平板畫線法將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣大腸埃希菌分別接種于LB固體培養(yǎng)基上，用封口膜封好，37℃置生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h活化細菌，活化后，用接種環(huán)挑取同一菌落的細菌，接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，然后置于氣浴恒溫搖床中37℃培養(yǎng)48 h用作實驗菌種。

2.4抑菌試驗

2.4.1提取物抑菌效果的測定 實驗菌種培養(yǎng)好以后，在超凈工作臺上開始抑菌實驗。將實驗菌種搖勻，用移液槍移取50 μl菌懸液于制好的平板上，平鋪涂勻，3種實驗菌，每種涂30個平板，然后將已滅菌的牛津杯等間距置于瓊脂表面上，每皿4個，全部排好之后，在超凈臺上靜放10 min。用1 ml滅菌移液槍吸取目標植物水提取液200 μl，注入擺好的牛津杯中，每皿中3個牛津杯注入同種藥物，另一牛津杯注入滅好菌超純水200 μl作對照，然后用封口膜小心的封好。每種藥物對應每種細菌分別做平板，共25個平板做水提藥（n=25）抗菌，用純凈無菌水為對照組CK1，同樣25個平板做醇提藥液（n=25）（以75%乙醇100 ml濃縮至5 ml為對照液CK2）。之后置于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的細菌生長情況，并用千分尺對應測量各個處理組和對照組抑菌圈的直徑。各處理組與對照組CK1 和CK2分別進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計比較數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.4.2 不同濃度提取液對抑菌作用影響的測定 以提取液作為100%原液，無菌水2倍法稀釋，得1∶2、1∶4、和1∶8濃度的提取液系列。由于兩種方法的提取液對細菌的抑制效果各有不同，因此分別選取兩種抑制效果比較明顯的提取液做稀釋實驗。每一系列都分別接菌并作對照，擺好牛津杯并注入等體積藥物，置37℃恒培養(yǎng)24 h，再測定抑菌圈的大小并記錄，有效果記為“+”，沒有效果記為“-” ，與對照組CK1 和CK2比較抑菌效果。

2.5實驗結果

2.5.1管碟法測定的植物提取液抑菌圈大小 將一個培養(yǎng)皿中3個藥物的抑菌圈效果取平均值，并且數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點后一位，水提液對照組和醇提液對照組分別去掉最高值和最低值求均值，所得數(shù)據(jù)繪制表格，由圖1結果可知，4種中藥水提液中，抑菌效果最好的是藤石松，對3種細菌的抑制效果都很明顯，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其次松蘿的抑菌效果與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），楓荷梨（樹參）對金黃色葡萄球菌的抑制效果較強，藤石松對產(chǎn)氣大腸埃希菌的抑制效果較強，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其他對大腸埃希菌和產(chǎn)氣大腸埃希菌的抑制效果不明顯；4種中藥醇提液中，抑菌效果最好的是楓荷梨（樹參），對3種菌的抑制效果都很明顯，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），藤石松對金黃色葡萄球菌、樹參和松蘿的醇提液（抑制效果幾乎相當）對產(chǎn)氣大腸埃希菌有抑制效果，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明有抑制效果；其他結果數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明無抑制效果。

2.5.2管碟法測定的植物提取液稀釋后抑菌圈大小 根據(jù)表1、表2的結果，這幾種中藥提取物對細菌的抑制效果，在降低植物提取液濃度達到最低閾值時（1∶8稀釋濃度），4種中藥提取物均沒有抑菌效果，樹參、藤石松在稀釋為1∶2、1∶4時，仍然對全部實驗菌株有抑菌效果，松蘿（醇提液）稀釋為1∶2時對全部菌株有抑菌效果。

3討論

孕產(chǎn)婦下生殖道感染是女性常見的婦科病，孕期體內(nèi)的激素水平升高，同時孕期機體的免疫功能低下，均增加了孕期下生殖道感染的風險，對產(chǎn)婦產(chǎn)褥感染的病原體分布情況及其耐藥性進行分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)褥感染大腸埃希菌比例最高[1]。孕期下生殖道感染沒有給予積極有效的治療，往往容易上行感染，導致胎膜早破的發(fā)生，生殖道感染引起胎膜早破時增加宮腔感染、產(chǎn)褥感染以及新生兒感染率，生殖道支原體、衣原體、真菌、細菌性感染是胎膜早破的誘發(fā)因素[2]，因此對下生殖道感染及時的診斷治療對預防胎兒早產(chǎn)、胎膜早破的發(fā)生、降低母兒不良妊娠結局、降低圍生兒死亡率均具有重要意義。

對主要病原體的藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，主要病原體對常見抗生素如青霉素、慶大霉素、紅霉素、哌拉西林-舒巴坦等，出現(xiàn)較大程度的耐藥性，以混合感染現(xiàn)象增多以及菌群耐藥性增高為特征，出現(xiàn)了對大部分抗生素甚至全部抗生素耐藥的菌群[1，3]，給感染性疾病的臨床治療帶來新的用藥危機。

中藥治療婦科疾病有著悠久歷史與確切的療效[3]，《神農(nóng)本草經(jīng)》明確指出治療婦產(chǎn)科藥物達五十余種[4]。中國藥典收載了較多抗菌解熱作用的中藥，常用中藥連翹有廣譜抗菌作用，為木犀科連翹屬植物連翹（Forsythia suspense Thunb. Vahl）的干燥果實，連翹的抗菌主要成分為連翹酚及揮發(fā)油，對金黃色葡萄球菌等有很強的抑制作用和抗菌解熱作用[5-7]。又如女貞子（Ligustri Lucidi Fructus）系木犀科女貞屬植物女貞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果實。中醫(yī)將女貞子列為上品，應用了幾千年，研究表明其藥理作用主要有抗炎抑菌、升高白細胞和增強非特異性免疫、免疫調(diào)節(jié)等功效，具有抗炎、抗微生物等藥理作用[8]，臨床用作抗皮膚炎癥的中藥。

樹參為五加科Araliaceae樹參屬Dendropanax植物，又名楓荷梨，含有多種結構類型的化學成分，主要為多炔類、萜類、皂苷、揮發(fā)油等，用于癱瘓、偏頭痛、臂叢神經(jīng)炎、風濕性及類風濕性關節(jié)炎的治療[9-10]，其對常見大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌抗菌作用研究很少報道。有研究分析樹參抗菌主要成分為生物堿等，對金黃色葡萄球菌等有很強的抑制作用[11]。對藤石松、垂穗石松（Palhinhaea cernua）等4種藥用植物分離得到60個生物堿類化學成分，進行了體外的抗炎活性測試，結果表明有2個化合物顯示了很好的抗炎活性，其中1個化合物的抗炎活性為陽性藥半抑制濃度（IC50=42.6 μmol/L）的2倍， 其IC50分別為25.5 μmol/L和41.5 μmol/L，另一個的抗炎活性與陽性藥幾乎相同[12-13]。

松蘿中的松蘿酸是松蘿抗菌作用的主要活性物質(zhì)，有很強的抗菌作用，對結核桿菌及革蘭陽性菌的抑制作用最強，對金黃色葡萄球菌及革蘭陰性菌中的百日咳、枯草、肺炎、大腸埃希菌和變形桿菌亦有效[14-15]。松蘿酸對耐藥金黃色葡萄球菌及腸球菌有效；松蘿中除含有松蘿酸外，還含有其他多種藥理活性成分，金黃色葡萄球菌對花松蘿的乙酸乙酯的提取物均較敏感，最低抑菌濃度為12.5 g /L；大腸埃希菌對花松蘿的乙醇提取物很敏感，最低抑菌濃度25 g/L；研究報道，對金黃色葡萄球菌耐藥質(zhì)粒有消除作用[16]，作用24 h的消除率5.2 %，延長作用時間至48 h，消除率可達14.6 %。

石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）為蘭科植物的假鱗莖或全草，屬中是蘭科植物，別名石橄欖、石上仙桃和石蓮，石仙桃不同溶劑的提取物對不同細菌具有抑制作用，石仙桃氯仿提取物對表皮葡萄球菌抑制，乙酸乙酯提取物對消化鏈球菌，正丁醇提取物對金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、淋病奈瑟球菌、表皮葡萄球菌、消化鏈球菌等都有抑制作用[17]，水提取物對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，其最低抑菌濃度為80 mg/ml類成分[18]。

要想發(fā)揮中藥的抑菌效果，需要控制一定濃度，當濃度低于極限閾值時無抑菌作用，而可能會導致誤認為中藥沒有抑菌效果。同時發(fā)現(xiàn)，同一種中藥提取液可能對幾種細菌有廣譜的抑制作用，可見是提取液中含有的某種成分或多種物質(zhì)對細菌的生長、繁殖發(fā)揮的抑菌效果，這一點有待于更深入的研究。

本實驗用管碟法對4種中藥的醇提液和水提液進行了抑菌活性的研究，是篩選開發(fā)臨床用中藥的前提和基礎，而篩選鑒定其中的殺菌成分是抗菌消炎中藥研究的重要方向，旨在為分離鑒定植物源抗菌先導化合物提供依據(jù)。本研究結果表明，對比4種中藥的抗菌作用研究， 其大致相同的抗菌譜，需要應用現(xiàn)代藥學和藥理學大量研究證實抗菌中藥及其有效成分。

本實驗探討治療婦科慢性盆腔炎和產(chǎn)褥感染的有效方劑及方法，通過抗菌中藥的實驗研究表明，采用抗菌中藥制劑藤石松和松蘿外用，樹參口服進行預防和治療，克服病原菌耐藥性問題。藥用植物種類繁多，資源豐富，環(huán)保無副作用等特點，因此研究價值高，發(fā)展?jié)摿Υ蟆?/p>

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