不同地區(qū)荷花腐敗病菌生物學特性及IGS序列分析

曾莉莎 呂順 鄭芝波 梁少麗 周建坤 莊華才 杜彩嫻 麥進培 莫秀文

摘 要 荷花腐敗病發(fā)生普遍，對荷花生產(chǎn)危害巨大，已成為制約中國荷花產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要障礙。為明確中國荷花腐敗病菌（Fusarium commune）的生物學特性及遺傳分化情況，本文采用藕塊接種法對采自廣東、湖南、湖北3個不同地區(qū)的病原菌進行致病性測定，研究了不同溫度、pH、碳氮源對病原菌菌絲生長的影響，同時利用rDNA IGS基因序列對采自不同地區(qū)的荷花腐敗病菌株進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，荷花腐敗病菌對溫度、pH等適應范圍廣，溫度在15～35 ℃，pH4～9均能生長，最適生長溫度為25 ℃，最佳pH值為7，且能利用多種碳氮源。不同的碳源中，蔗糖和葡萄糖較適合該菌的生長；在供試氮源中，菌絲在蛋白胨的基礎培養(yǎng)基上生長最快，在尿素的基礎培養(yǎng)基上生長最慢；當溫度為15、20、30或35 ℃時，湖北的菌株平均菌落直徑最大；當pH值為4.0～5.0時，廣東菌株的平均菌落直徑較大，當pH值為7.0～9.0時，來自湖北的菌株菌落直徑最大。不同地區(qū)的病原菌間致病力存在一定差異，基于rDNA IGS的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，不同地區(qū)的病原菌株間存在一定的遺傳分化，其中廣東菌株與湖南菌株親緣關(guān)系較近（同源性高達99.7%），遺傳距離為0.003；而廣東菌株與湖北菌株的親緣關(guān)系較遠（同源性為97.3%），遺傳距離為0.027。

關(guān)鍵詞 荷花腐敗??；病原菌；生物學特性；rDNA-IGS序列

中圖分類號 S682 文獻標識碼 A

Biological Characteristics and IGS Sequence Analysis of Pathogen

Strains Causing Lotus Rhizome Rot（Fusarium commune）

from Different Regions

ZENG Lisha1， Lü Shun1， ZHENG Zhibo2 *， LIANG Shaoli1， ZHOU Jiankun1，

ZHUANG Huacai1， DU Caixian1， MAI Jinpei2， MO Xiuwen3

1 Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan， Guangdong 523061， China

2 The Agriculture Research Center of Dongguan， Dongguan， Guangdong 523086， China

3 Dongguan Agricultural Technique Extension Management Office， Dongguan， Guangdong 523010， China

Abstract Rhizome rot disease of lotus， which had occurred widely， not only caused severe damage to lotus production， but also became one of the major obstacles to the sustaining development of lotus industry in China. To clarity the biological characteristics and genetic differentiation of Fusarium commune， the causal agent of lotus rhizome rot， pathogenicity test， biological factors（temperature， pH value， carbon and nitrogen sources）and phylogenetic analysis based on rDNA IGS gene were studied. The results showed that F. commune could grow from 15 to 35 ℃， and the optimal temperature was 25 ℃. It grew well from pH 4 to 9， and the optimal pH was 7. It could also utilize many substances as carbon and nitrogen sources. Among tested sucrose， saccharose and glucose were the best carbon sources for the growth of F. commune， peptone was the most suitable nitrogen source while ureal was the worst. When the cultivation temperature was 15，20，30 or 35 ℃， Hubei isolates had the largest colony diameter. Guangdong isolates had the largest colony diameter from pH 4 to 5， and Hubei isolates had the largest colony diameter from pH 7 to 9. Pathogenicity differentiation was existed between pathogen strains from different regions. Phylogenetic analysis showed that there was obvious genetic differentiation between these isolates from different provinces. Guangdong isolates has the similarity of 99.7% to Hunan isolates and the genetic distance between two provinces was 0.003. Whereas， Guangdong isolates presented 97.3% similarity to Hubei isolates and the genetic distance between two provinces was 0.027.

Key words lotus rhizome rot disease； pathogen； biological characteristics； rDNA IGS sequence

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.024

荷花（Nelumbo nucifera）又稱蓮藕、蓮花，是蓮科蓮屬多年生草本挺水植物，也是中國十大名花中唯一的水生花卉[1-2]。中國栽培荷花歷史悠久，已成為世界荷花的栽培中心[3]。近年來，珠三角荷花栽培集中區(qū)，如三水荷花世界、番禺蓮花山、東莞橋頭等濕地，大范圍發(fā)生腐敗病，影響了正常的生產(chǎn)與旅游觀光產(chǎn)業(yè)[4]。荷花腐敗病是荷花種植區(qū)發(fā)生最普遍、為害嚴重的病害之一，主要為害荷花（蓮藕）地下莖部，也能為害葉片和葉柄[5-6]。荷花腐敗病在荷花生長期和蓮藕貯藏期均可發(fā)病，分布廣闊，全國各荷花產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[6]。因此，荷花腐敗病能否得到有效控制，已經(jīng)成為中國荷花栽培及荷花產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展急需解決的重大問題。在過去，由于Fusarium commune這個種群尚未發(fā)現(xiàn)以及從尖孢鐮孢菌復合種（FOSC）中細分出來[7-8]，人們根據(jù)傳統(tǒng)的鐮孢菌分類系統(tǒng)將蓮藕（荷花）腐敗病鑒定為尖孢鐮孢菌蓮專化型（Fusarium oxysporum.f. sp. nelumbicola）[5，9]。鐮孢菌分類發(fā)展快，2016年，曾莉莎等[4]通過病原菌形態(tài)鑒定及致病力測定，分子特異檢測，以及基于TEF-1α、IGS、mtSSU等鐮孢菌分類鑒定中常用基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析，對中國廣東、廣西、福建、江西、湖南、湖北等地的荷花（蓮藕）腐敗病菌進行再鑒定表明，分離自這些地區(qū)的荷花腐敗病病原菌為Fusarium commune。但是目前關(guān)于鐮孢菌F. commune的生物學特性及遺傳發(fā)育情況仍少有報道。

明確荷花腐敗病菌的生物學特性對于生產(chǎn)上指導該病害的有效防控意義重大，2015年，周小軍等[10]對浙江地區(qū)的蓮腐敗病菌的生物學特性進行了研究，但周小軍等[10]的研究均只限于某一個省內(nèi)某地區(qū)的荷花腐敗病菌的生物學特性，對其他省荷花腐敗病菌仍缺乏一個系統(tǒng)的生物學研究。另外，現(xiàn)有關(guān)于蓮腐敗病菌的報道多數(shù)也是針對籽蓮或者蓮藕品種的病原菌，目前還沒針對珠三角或其它地區(qū)觀賞荷花品種（花蓮品種）的腐敗病菌進行生物學特性研究的報道。

rDNA基因間隔區(qū)IGS（Intergenic spacer）被認為是rDNA中變異最快的區(qū)域，被廣泛用于同屬真菌不同種間和種內(nèi)不同群體間的比較[11-12]，也常用于鐮孢菌屬種間及種內(nèi)菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[13-16]。O'Donnell等[17]采用IGS基因片段對來源于植物和人類的病原鐮孢菌進行了系統(tǒng)分析，認為IGS是適用于Fusarium群體遺傳多樣性分析的基因片段。

本研究對采自廣東省、湖南省和湖北省不同地理環(huán)境及不同荷花品種類型的8株荷花腐敗病菌（Fusarium commune）菌株進行生物學基本特性研究，分析不同地區(qū)及不同品種來源的病菌間生物學特性的差異，同時利用rDNA基因間隔區(qū)IGS序列分析進行不同地區(qū)菌株的系統(tǒng)發(fā)育研究，初步了解種內(nèi)菌株的親緣關(guān)系，為因地制宜地防治荷花腐敗病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌為采自廣東、湖南及湖北3省不同地區(qū)具有代表性的8個荷花腐敗?。‵usarium commune）菌株，其來源及編號如表1。其中廣東的病原菌株分離自江溪紅蓮和蝶戀花（花蓮品種）；湖南的病原菌株分離自湘蓮“寸三蓮”（籽蓮品種）；湖北的病原菌株分離自鄂蓮5號（藕蓮品種）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 從病株地下莖（藕）、須根、蓮鞭或葉柄的病健交界處切取5 mm×5 mm組織，采用常規(guī)組織分離法進行病菌分離[18]，于25 ℃在PDA上培養(yǎng)2～3 d，待長出菌落后，挑菌落邊緣菌絲培養(yǎng)，經(jīng)單孢分離后保存?zhèn)溆?。取?jīng)單孢分離獲得的典型菌株作為本研究供試菌株。

1.2.2 病原菌致病性測定 采用病原菌菌絲塊接種藕塊的方法[19]進行致病性測定：在無菌的條件下，將在PDA平板上培養(yǎng)7 d的各供試病原菌用打孔器自菌落邊緣切取直徑6 mm的菌餅，將菌餅接種于藕塊的中央，菌絲面朝下，每個藕塊接種1個菌餅，接種后將藕塊放置在墊有濕紙巾的碟子上，置于（25±1）℃的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。每個測試菌株接種藕塊12片，做3次重復。參考魏林等[19]的“接種藕塊病級分級標準”進行病情指數(shù)調(diào)查，統(tǒng)計不同地區(qū)菌株的發(fā)病率及病情指數(shù)差異。

1.2.3 PDA培養(yǎng)基形態(tài)比較 在PDA培養(yǎng)基上對分離出來的不同地區(qū)病菌進行形態(tài)比較及描述，每個測試菌株培養(yǎng)并觀察記錄6皿。

1.2.4 溫度對不同菌株生長的影響 將活化的荷花腐敗病菌在PDA平板上培養(yǎng)4 d后，用打孔器從菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，將菌餅移接到PDA培養(yǎng)基上，分別放置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8個溫度梯度中進行恒溫培養(yǎng)[20]，每個處理5次重復，培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 pH值、氮源、碳源對不同菌株生長的影響

參照唐琦等[20]及楊秀娟等[21]的方法，測定pH值、碳氮源對不同地區(qū)荷花腐敗病菌菌株生長的影響。

1.2.6 IGS區(qū)序列測定 （1）基因組DNA制備。供試菌株基因組DNA的提取方法參見SDS裂解法[22]，并略作改進。

（2）IGS序列擴增。擴增引物序列為CNS1（5′-GAGACAAGCATATGACTACTG-3′）及CNL12（5′-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3′）PCR反應體系參照Zhu等[16]的描述。擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

（3）序列測定和分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收后交由賽默飛生命科學有限公司（Thermo Fisher）進行測序，采用軟件Clustal X（http：//inn-prot.weizmann.ac.il/software/ClustalX.html）進行對位排列，手動校正錯讀漏讀堿基，用Sequin軟件將基因序列登錄到GenBank（NCBI）中。排列好的序列用Mega5.0軟件Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用靴帶（bootstrap）分析法進行檢驗，共重復1 000次[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株菌落形態(tài)

分離自各地區(qū)的菌株在PDA培養(yǎng)基上生長5 d后，菌落存在一定差異。來自湖南及湖北兩地的菌株菌落形狀較圓，邊緣整齊，菌絲較粗壯，菌落顏色偏白，菌絲較長；廣東的菌株菌落大小偏小，顏色明顯偏紅紫色，邊緣不齊，菌落較薄，菌絲較短（圖1）。

2.2 病原菌致病性測定結(jié)果

供試菌株接種藕塊后發(fā)病情況見表2，其中廣東菌株接種后發(fā)病率及病情指數(shù)較高，其次是湖北菌株，湖南菌株發(fā)病率及病情指數(shù)較低。廣東及湖北的菌株接種藕塊后，藕塊維管束變褐明顯（維管束呈深褐色），變色部分面積較大；湖南菌株接種藕塊后，菌絲塊在藕塊上生長速度較慢，藕塊變色面積較?。▓D2）。

2.3 溫度對不同菌株生長的影響

溫度對不同菌株生長的影響如表3所示。結(jié)果表明，在15～35 ℃范圍內(nèi)來源于各地區(qū)的荷花腐敗病菌均能生長，當溫度低于10 ℃或高于40 ℃時菌絲停止生長。當溫度為25 ℃時，各地區(qū)菌株的菌落直徑都達到最大值，表明25 ℃為最適合荷花腐敗病菌菌絲生長的溫度。當溫度為15、20、30、35 ℃時，分離自湖北的菌株菌落直徑最大，與分離自湖南的菌株差異顯著，這可能與該地區(qū)的菌株對溫度的適應范圍較廣有關(guān)。

2.4 pH值對不同菌株生長的影響

pH值對不同菌株生長的影響試驗表明（表4），pH值對荷花腐敗病菌生長的影響較大。病原菌在pH值4.0～9.0范圍內(nèi)均能生長，各地區(qū)菌株生長的較適宜pH值均為6.0～7.0；其中pH7.0最適合菌絲生長。當pH值為4.0或5.0時分離自廣東菌株的菌落直徑較大；當pH值為7.0～9.0時，湖北菌株的平均菌落直徑最大，與分離自其它地區(qū)的菌株菌落直徑差異顯著，說明了廣東菌株對酸性環(huán)境的適應性較好，而湖北菌株對堿性環(huán)境的適應性較好。

2.5 碳源對不同菌株生長的影響

碳源對不同荷花腐敗病菌株生長的影響試驗表明（表5），菌株對不同碳源的利用程度不同，以蔗糖為碳源時菌落直徑最大，其次為葡萄糖、果糖、麥芽糖和乳糖。其中，以果糖和乳糖為碳源時，分離自湖北的菌株菌落直徑較大，與分離自其它地區(qū)的菌株差異顯著。

2.6 氮源對不同菌株生長的影響

氮源對不同菌株生長的影響試驗表明（表6），不同的氮源對病原菌生長均有影響，其中蛋白胨的利用率最好，其次是硝酸銨和甘氨酸，尿素的利用率最差。其中以甘氨酸、硝酸銨、硫酸銨等為氮源時，不同地區(qū)菌株的菌落直徑差異較顯著。

2.7 IGS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.7.1 堿基序列大小 所得測序結(jié)果經(jīng)過拼接后，得到8個供試菌株的IGS序列，大小約為2 500 bp，將8個菌株的IGS基因序列登錄到GenBank（NCBI）中，每個菌株的GenBank登錄號如表1所示。其中廣東3個菌株G+C的含量相同為54.5%，湖南3個菌株中Hhgw-73-3的G+C含量為54.6%，其它2個菌株的G+C含量相同（為54.7%），湖北2個菌株G+C的含量也相同（為54.4%）。

2.7.2 分子系統(tǒng)樹的比較與分析 以發(fā)表于GeneBank上的棉花枯萎病菌FOV14（NCBI Accession Number： DQ831885）為外類群，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖4。來自廣東、湖南、湖北3個不同地區(qū)的8個菌株形成3個獨立的系統(tǒng)進化枝（Clade）。其中，來自湖南的菌株3個菌株聚為一組，可以分成2個小的亞分枝（Subclade）；分離自廣東省的3個菌株聚為一組，與來自湖南的菌株親緣關(guān)系較近（2省菌株的同源性高達99.7%），平均遺傳距離為0.003；分離自湖北省的2個菌株聚為一組，廣東菌株與來自湖北的2個菌株的親緣關(guān)系較遠，同源性為97.3%，遺傳距離為0.027。

3 討論

荷花腐敗病又稱“蓮瘟”，是由鐮孢菌Fusarium commune引起的重要土傳病害[4]。目前荷花腐敗病已成為阻礙荷花產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的一個重要因素[25]，明確荷花腐敗病菌的生物學特性對于生產(chǎn)上指導該病害的有效防控意義重大。

本文通過對廣東、湖南、湖北3省的荷花腐敗病菌生物學特性研究表明，荷花腐敗病菌對溫度、pH等適應范圍廣，溫度在15～35 ℃，pH4～9均能生長，最適生長溫度為25 ℃，最佳pH值為7.0，且能利用多種碳氮源。以上研究與周小軍等[10]的報道基本一致，但是周小軍等[10]對浙江荷花腐敗病菌生物學特性的研究表明，蓮腐敗病病原菌菌絲35 ℃停止生長，而本研究表明病原菌在35 ℃時仍然能生長，只是菌落生長速度較慢，這可能與不同地區(qū)的病菌對溫度的適應范圍不同有關(guān)系。不同的碳源中，蔗糖、葡萄糖和果糖較適合該菌的生長；在供試氮源中，菌絲在蛋白胨的基礎培養(yǎng)基上生長最快，在尿素的基礎培養(yǎng)基上生長最慢。以上結(jié)果為從農(nóng)藝措施上防治荷花腐敗病提供了參考依據(jù)，當氣候溫度接近25 ℃時，要加強對該病害的防控，防治該病害時要注意對荷塘水土酸堿度的調(diào)節(jié)，通過創(chuàng)造不利于病菌生長繁殖的環(huán)境條件來控制病害[26]。

試驗發(fā)現(xiàn)，當溫度為15、20、30、35 ℃時，湖北的菌株菌落直徑最大，這可能與該地區(qū)的菌株對溫度的適應范圍較廣有關(guān)；當pH值為4.0或5.0時廣東的菌株菌落直徑較大，當pH值為7.0～9.0時，來自湖北菌株的平均菌落直徑最大，說明了廣東菌株對酸性環(huán)境的適應性較好，湖北菌株對堿性環(huán)境的適應性較好。以上結(jié)果表明了不同地區(qū)的病菌在生物學特性上也是有一定差異的，生產(chǎn)上應該因地制宜地指導不同荷花栽培區(qū)進行腐敗病的科學防控。

從荷花腐敗病菌接種藕塊后的發(fā)病率及病情指數(shù)來看，不同地區(qū)的病原菌間致病力存在一定差異，其中廣東及湖北的菌株接種藕塊后，藕塊維管束變褐明顯，變色部分面積較大；湖南的菌株接種后，菌絲塊在藕塊上生長速度較慢，藕塊變色面積較小。這說明了地理環(huán)境可能會影響菌株的分化，廣東與湖南、湖北3省在緯度、經(jīng)度等地理環(huán)境方面存在較大差異，且3個地區(qū)的菌株分離自不同的荷花品種類型，因此不同菌株間存在一定的致病力分化，但是由于本文收集的菌株量有限，而且采用的是藕塊接種法[19]，關(guān)于不同荷花主栽區(qū)及來源于不同荷花品種的腐敗病致病菌致病力分化情況，還需要大量收集不同地區(qū)的病菌，通過盆栽接種法及田間小區(qū)試驗作進一步深入研究。

本文通過基于rDNA IGS的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，各菌株間存在一定的遺傳多態(tài)性，來自廣東、湖南、湖北3個不同地區(qū)的8個菌株形成3個獨立的分支，其中分離自廣東省的3個菌株與來自湖南的菌株同源性高達99.7%，廣東菌株與來自湖北的菌株的親緣關(guān)系較遠，遺傳距離為0.027，以上結(jié)果表明了中國的荷花腐敗病菌存在豐富的遺傳多樣性，不同地區(qū)的致病菌株間存在一定的遺傳分化。其中廣東的病原菌株分離自江溪紅蓮和蝶戀花（花蓮品種）；湖南的菌株分離自湘蓮“寸三蓮” （籽蓮品種）；湖北的菌株分離自鄂蓮5號（藕蓮品種）。因此，通過本文的研究也表明不同品種來源的病原菌株存在豐富的遺傳多樣性，但是目前關(guān)于不同品種來源的蓮腐敗病菌的遺傳差異的研究較少，中國的荷花（蓮）品種眾多，而且荷花是一種水生植物，在品種的收集、病原菌的接種及品種的抗病性鑒定等方面都存在較大的難度。因此，接下來還需要開展大量的工作，進一步研究荷花腐敗病菌是否存在生理小種的分化及進行強致病性生理小種的篩選鑒定[27]，以期為病害的有效防治及抗病品種選育提供參考。

致 謝 本研究在采集病害樣品時得到湖南省植物保護研究所魏林研究員、武漢市蔬菜科學研究所水生蔬菜研究室李峰主任及武漢市蔡甸區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所朱志坤的幫助，謹致謝意！

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