荔枝果實(shí)對(duì)霜疫霉侵染抗性評(píng)價(jià)體系建立及初步應(yīng)用

曹璐璐 孫進(jìn)華 王家保

摘 要 為建立穩(wěn)定的荔枝果實(shí)對(duì)霜疫霉侵染抗性評(píng)價(jià)體系，研究不同濃度孢子囊懸浮液浸染、不同癥狀調(diào)查時(shí)間對(duì)不同荔枝品種病情指數(shù)的影響，并用建立的方法研究部分荔枝品種對(duì)霜疫霉侵染抗性的初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：以4×104個(gè)/mL孢子囊濃度懸浮液為接種濃度，‘妃子笑和‘大丁香離體果實(shí)病征發(fā)生速度適中，侵染第72小時(shí)的病情指數(shù)比較穩(wěn)定，能夠更好地區(qū)分品種間的抗病性差異。2012～2016年，用該指標(biāo)體系先后評(píng)價(jià)了15個(gè)荔枝品種對(duì)霜疫霉侵染的抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同年份這些品種的抗性分級(jí)基本相同，‘黑葉和‘桂味是表現(xiàn)最為穩(wěn)定的抗病和感病品種，證實(shí)了建立的抗性評(píng)價(jià)體系的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞 荔枝；荔枝霜疫霉菌；抗性；評(píng)價(jià)體系

中圖分類號(hào) S436.671 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Establishment and Preliminary Application of the Resistance

Evaluation System of Litchi Fruit to Downy Blight

CAO Lulu1，2， SUN Jinhua2， WANG Jiabao2 *

1 College of Environmental and Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract In order to establish a stable resistance evaluation system of litchi fruit to downy blight， the influence on disease index（DI）of concentration of inoculation sporangia and time of record for symptom were studied among different litchi germplasms. The results showed that the disease symptom of‘Feizixiaoand‘Dadingxianginoculated with 4×104/mL sporangia occurred at moderate speed， and the disease index of 72 h was relatively stable， which was a proper time of symptom survey for resistance to downy blight of litchi. During 2012-2016， the system was applied to evaluate the resistance to downy blight among 15 litchi cultivars. The resistance grades of these cultivars were almost the same in different years， and‘Heiyeand‘Guiweiwas the most stable resistant and susceptible cultivars， respectively. These confirmed that the resistance evaluation system of litchi fruit to downy blight was stable.

Key words litchi； Phytophthora litchii； resistance； evaluation system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.022

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原產(chǎn)于中國(guó)南部和越南北部，是中國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的特色水果[1]。荔枝霜疫霉?。↙itchi downy blight）是荔枝的主要病害之一，由荔枝霜疫霉菌（Phytophthora litchii）引起，主要危害果實(shí)，從而造成果實(shí)腐爛，也危害葉片和花，引起落葉和落花，導(dǎo)致減產(chǎn)30%～80%，且影響果實(shí)質(zhì)量[2-9]。培育抗病品種是解決霜疫霉危害的根本途徑。建立準(zhǔn)確的抗病性鑒定方法可為獲得抗性材料和后續(xù)抗性育種提供基礎(chǔ)。已有學(xué)者建立了柑橘、芒果、蘋果、梨、辣椒、大豆等作物的抗病鑒定方法[10-17]，也對(duì)荔枝霜疫霉病抗性鑒定方法進(jìn)行了一些探索[18-20]，但還未形成統(tǒng)一的評(píng)價(jià)體系。鑒于此，本研究以多個(gè)荔枝品種離體成熟果實(shí)為試材，研究接種霜疫霉孢子囊濃度、病征記錄時(shí)間對(duì)其抗病分級(jí)指標(biāo)的影響，以期建立穩(wěn)定的抗病性鑒定體系，為荔枝抗性評(píng)價(jià)及抗病育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 荔枝材料 2012～2016年，先后采摘17個(gè)荔枝品種（表1）約八成熟果實(shí)，采后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選成熟度相對(duì)一致、大小基本均一、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)，用自來水沖洗干凈，再用無菌去離子水沖洗2遍，自然晾干（約10 min左右）后立即用于接種處理。

1.1.2 霜疫霉菌株 霜疫霉菌株由本實(shí)驗(yàn)室從海南永發(fā)三月紅荔枝果實(shí)上分離并保存。于侵染前3周接種至V8固體培養(yǎng)基，28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前用無菌水浸泡培養(yǎng)皿中的菌絲體，并用小毛刷輕輕刷動(dòng)以收集霜疫霉菌孢子囊，再用無菌紗布過濾殘存的菌絲體。濾液用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)計(jì)算孢子囊濃度，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐渲?×105、4×106、4×107個(gè)/mL孢子囊懸浮液，接種時(shí)分別稀釋100倍。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)接種方法 將自然晾干的果實(shí)置于稀釋好的孢子囊懸浮液中，浸泡5 min后取出，放在底部鋪有雙層吸水紙的保鮮盒中，噴無菌水至吸水紙潤(rùn)濕，以保持空氣濕度。果實(shí)單層擺放，相互之間無擠靠。用塑料蓋蓋緊，于28 ℃放置。每次處理60個(gè)果，以每20個(gè)果作為1次重復(fù)。

1.2.2 發(fā)病過程調(diào)查 剛接種時(shí)以第0小時(shí)為準(zhǔn)，以后每24 h觀察記錄1次果實(shí)的病情級(jí)別（以果實(shí)病斑面積占果實(shí)總面積的比例表示，表2），直至大部分果實(shí)發(fā)病為止。

1.2.3 病情指數(shù)和抗病性分級(jí) 按下式計(jì)算病情指數(shù)

式中：DI為病情指數(shù)，s為各病情級(jí)別，n為相應(yīng)病情級(jí)別果數(shù)，N為調(diào)查總果數(shù)，S為最高病情級(jí)別代表值室內(nèi)病情分級(jí)及其對(duì)應(yīng)的癥狀描述。

依據(jù)荔枝霜疫霉病的病情指數(shù)將荔枝材料的抗病性分為6 級(jí)，抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[21]詳見表3。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)過程 2012年，先用‘妃子笑與‘大丁香果實(shí)，按照上述方法進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，優(yōu)化確定了處理方法、調(diào)查時(shí)間、分級(jí)閾值等。2012～2016年，分批次評(píng)價(jià)了其余15個(gè)品種的抗性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用計(jì)算機(jī)軟件Excel和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[22]進(jìn)行Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種孢子囊濃度的確定

由表4可知，3種孢子囊濃度霜疫霉懸浮液接種‘大丁香和‘妃子笑后，培養(yǎng)24 h時(shí)2個(gè)品種果實(shí)無明顯癥狀，48 h之后出現(xiàn)癥狀。4×103個(gè)/mL孢子囊懸浮液接種‘大丁香在96 h時(shí)病情指數(shù)才和對(duì)照有顯著差異（p<0.05），接種‘妃子笑72 h后才表現(xiàn)出顯著差異（p<0.05），2個(gè)材料的時(shí)間不一致，此孢子囊濃度不適合作為抗病性的評(píng)價(jià)。48 h后一直和對(duì)照組表現(xiàn)顯著差異（p<0.05）的是4×104個(gè)/mL和4×105個(gè)/mL兩個(gè)濃度接種的組合；由于用4×105個(gè)/mL孢子囊懸浮液接種，病情發(fā)展過于迅速，不利于大量荔枝材料抗病性的評(píng)價(jià)；而以4×104個(gè)/mL孢子囊懸浮液接種，病情發(fā)展比較穩(wěn)定，且和對(duì)照組的病情指數(shù)呈顯著差異（p<0.05），因此，選用4×104個(gè)/mL作為接種的孢子囊懸浮液濃度。

2.2 調(diào)查時(shí)間的確定

以4×104個(gè)/mL孢子囊懸浮液接種的2個(gè)荔枝材料在24 h未出現(xiàn)明顯癥狀，不適合進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)；在48 h出現(xiàn)了明顯的癥狀，但病斑直徑比較小，病征表現(xiàn)變異系數(shù)很大，‘大丁香和‘妃子笑的分別是30.47和32.12，不適合進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)；在72 h出現(xiàn)明顯癥狀，2個(gè)品種各自的癥狀表現(xiàn)比較穩(wěn)定，變異系數(shù)較小，‘大丁香和‘妃子笑的分別是18.02 和3.62，且2個(gè)材料表現(xiàn)出很大的差異，適合進(jìn)行抗病性的評(píng)價(jià)；在96 h 病斑直徑較大，病情指數(shù)均達(dá)到90以上，不適合進(jìn)行抗病性的評(píng)價(jià)（表4）。綜上所述，選4×104個(gè)/mL為接種的孢子囊濃度，72 h為接種調(diào)查病情指數(shù)的時(shí)間，以此為荔枝果實(shí)對(duì)霜疫霉侵染抗性評(píng)價(jià)體系的最適接種濃度和最佳調(diào)查時(shí)間。

2.3 部分荔枝品種果實(shí)對(duì)霜疫霉病抗性的比較

2012～2016年，應(yīng)用建立的上述評(píng)價(jià)方法，先后評(píng)價(jià)了15個(gè)荔枝品種對(duì)霜疫霉病的抗性，其中，2012～2014年分別評(píng)價(jià)了15個(gè)、7個(gè)和13個(gè)，2015～2016年對(duì)‘黑葉和‘桂味進(jìn)行了評(píng)價(jià)（表5和圖1）。各品種中，病情指數(shù)最低的為21.30（‘四季荔，2012年），最高的為96.30（‘廣西勾背，2014年），呈現(xiàn)連續(xù)分布趨勢(shì)。多數(shù)品種不同年份之間病情指數(shù)較為穩(wěn)定，如‘四季荔、‘黑葉、‘尚書懷、‘桂味、‘紅荔、‘水晶球、‘廣西勾背和‘雪懷子。有些品種在不同年份病情級(jí)別波動(dòng)較大，但對(duì)抗病/感病的分類總體保持不變，如‘尖葉荔2012年病情指數(shù)為73.33，分類為感病，但2014年病情指數(shù)升高為93.33，分類為高感，盡管指數(shù)變化較大，但同屬感病類型?？傮w上，15個(gè)品種表現(xiàn)為抗病的有‘四季荔、‘黑葉和‘尚書懷，感病的有‘掛綠、‘綠荷包、‘桂味、‘懷枝、‘紅荔、‘白粉、‘水晶球、‘尖葉荔、‘紅繡球、‘廣西勾背、‘麻雀春和‘雪懷子。

2012年的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，中抗與高感、感病荔枝品種的病情指數(shù)差異顯著，其他抗性等級(jí)之間病情指數(shù)差異不顯著，或者只有部分差異顯著。2013年數(shù)據(jù)結(jié)果表明，中抗與高感、感和中感品種的病情指數(shù)差異顯著，中感與高感品種的病情指數(shù)差異顯著，其他抗性等級(jí)之間部分差異顯著。2014年，感與高感品種病情指數(shù)部分差異顯著，其他抗性等級(jí)之間均差異顯著。由于病情指數(shù)和抗性等級(jí)呈連續(xù)分布，所以不同的等級(jí)之間也有差異不顯著，但在不相鄰抗性等級(jí)之間荔枝資源的抗性基本都是差異顯著。因此，荔枝的抗性如果在相鄰抗性等級(jí)之間變化，則認(rèn)為該品種抗性穩(wěn)定；在不相連抗性等級(jí)之間變化的，則認(rèn)為該品種抗性不穩(wěn)定。

由圖1可知，2012～2016年間評(píng)價(jià)了不同地區(qū)分布的主栽荔枝品種‘黑葉和‘桂味對(duì)霜疫霉侵染的抗性，‘黑葉和‘桂味的抗性表現(xiàn)都很穩(wěn)定：‘黑葉為抗病品種，具體表現(xiàn)為中抗；‘桂味為感病品種，具體表現(xiàn)為中感。

3 討論

對(duì)于建立抗病性鑒定體系，確定孢子囊濃度和接種后調(diào)查時(shí)間至關(guān)重要，但關(guān)于荔枝抗病性鑒定體系還未見系統(tǒng)的研究。本研究從‘大丁香和‘妃子笑接種荔枝霜疫霉的結(jié)果來分析，荔枝對(duì)霜疫霉病抗性評(píng)價(jià)體系的最適宜接種濃度4×104個(gè)/mL，最佳觀察時(shí)間為72 h。朱若鑫[19]和余中蓮[23]觀察荔枝的抗病性接種用的孢子囊濃度是1×104個(gè)/mL，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差異不明顯。陶挺燕[20]利用4×105個(gè)/mL的孢子囊懸浮液，噴霧接種至刺傷荔枝葉片上，這與本實(shí)驗(yàn)所用孢子囊的濃度差異很大，可能是針對(duì)不同的接種方法和接種材料的原因。

本研究利用該體系對(duì)2012～2016年的荔枝材料進(jìn)行了抗性評(píng)價(jià)，通過對(duì)2012～2014年各年的荔枝資源抗性評(píng)價(jià)之間的差異性分析，中抗與高感、感之間均屬差異顯著，由于病情指數(shù)和抗性等級(jí)呈連續(xù)分布，所以會(huì)出現(xiàn)相鄰等級(jí)之間的品種差異不顯著的情況。但不相連等級(jí)間的差異大部分是顯著的。因此，荔枝品種在相鄰等級(jí)之間抗性變化可認(rèn)為抗性穩(wěn)定。3 a間，荔枝資源的抗性基本穩(wěn)定，也證實(shí)了該體系的可靠性。

通過對(duì)2012～2014年相同品種的抗病性進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)品種的抗病性表現(xiàn)比較穩(wěn)定，但病情指數(shù)都有浮動(dòng)，部分抗性等級(jí)有變化。由于病情指數(shù)和抗性程度呈連續(xù)分布，如果某一材料的病情指數(shù)接近抗性級(jí)別的上限或下限，有可能在年度間的重復(fù)鑒定中因病害發(fā)生程度的小波動(dòng)而使抗性評(píng)價(jià)結(jié)果出現(xiàn)不一致[24]，但這種變化的幅度可能基本局限在一定的范圍內(nèi)，如高感和感病級(jí)別的材料都在感病范圍內(nèi)變化，說明感病種質(zhì)的抗性具有相對(duì)的穩(wěn)定性[20]。 所以建立這一套體系是非?？茖W(xué)可靠的。其中‘綠荷包和‘掛綠的抗病性鑒定的不穩(wěn)定因素是2012年的果實(shí)成熟度不一致，單果間的發(fā)病情況不一致。由于荔枝對(duì)荔枝霜疫霉菌的抗性易受環(huán)境條件的影響：如打藥的頻率、施肥量的變化、降雨量的多少和采摘的時(shí)機(jī)等，這些因素的變化都會(huì)影響荔枝材料的抗性評(píng)價(jià)級(jí)別，因此，對(duì)初步鑒定為抗病的材料應(yīng)進(jìn)行重復(fù)鑒定，才能得出正確的結(jié)果[20]。

通過對(duì)荔枝主栽品種‘黑葉和‘桂味5 a間的抗病性鑒定結(jié)果來看，不同地區(qū)來源的2個(gè)品種利用該體系進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)結(jié)果表現(xiàn)一致：‘黑葉為抗病品種，‘桂味為感病品種。并且各個(gè)品種每年的病情指數(shù)均差異不顯著，證實(shí)了該體系的可靠性和穩(wěn)定性。這可為研究荔枝的抗病性機(jī)制提供基礎(chǔ)。

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