檳榔莖基腐病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性測定

程樂樂 李增平 蒙漢華

摘 要 對檳榔莖基腐病的病原菌進行種類鑒定和致病性測定，并對其進行生物學(xué)特性測定。形態(tài)觀察和ITS序列分析結(jié)果表明，病原菌為狹長孢靈芝[Ganoderma boninense Pat.]。生物學(xué)特性測定結(jié)果表明，28 ℃、pH5～7、連續(xù)黑暗、蔗糖、大豆蛋白胨或酵母浸膏是菌絲生長最適條件。

關(guān)鍵詞 檳榔；莖基腐?。华M長孢靈芝；生物學(xué)特性

中圖分類號 S432 文獻標(biāo)識碼 A

Identification and Biological Characteristics of Areca catechu L.

Basal Stem Rot Pathogen

CHENG Lele， LI Zengping*， MENG Hanhua

College of Environment and Plants Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Identification and biological characteristics of the pathogen from the basal stem rot disease in arecanut was reported in this study. The fungus was isolated from an infected arecanut tree in Linshui， Hainan Province. According to the observtion of the basidiocarp of the pathogen morphology and microstructure， the pathogen was identified as Ganoderma boninense Pat.. Biological characteristics tests shown that 28 ℃， pH 5～7， continuous darkness， sucrose， soya peptone and yeast extract were the optimum growth conditions for mycelia.

Key words Areca catechu L.； basal stem rot disease； Ganoderma boninense Pat.； biological characters

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.021

檳榔（Areca catechu L.）在中國已有1 500多年的栽培歷史，檳榔果為中國四大南藥之一，于1953年被列入了《中華人民共和國藥典》中，以海南、臺灣2省栽培最多[1-2]。檳榔是海南省重要的熱帶經(jīng)濟作物和景觀植物，是海南人民重要的經(jīng)濟來源，據(jù)《海南統(tǒng)計年鑒-2016》記錄，2015年海南省檳榔種植面積已達到9.8萬hm2，總產(chǎn)量達22.9萬t[3]。近年來檳榔黃化型病害在海南各市縣的檳榔種植區(qū)發(fā)生十分嚴(yán)重，對檳榔生產(chǎn)影響極大，而檳榔莖腐病和莖基腐病是引起海南檳榔黃化型病害的2種病因。臺風(fēng)是海南常見的自然災(zāi)害，臺風(fēng)過后易導(dǎo)致植株受傷，加上海南省高溫高濕的氣候特點，使病原菌容易侵入，造成莖干和根系受害，受害植株葉片失綠，逐漸黃化，樹勢衰弱，最后導(dǎo)致植株枯萎死亡。筆者在陵水縣光坡鎮(zhèn)的檳榔園調(diào)查時發(fā)現(xiàn)部分檳榔植株感染莖基腐病，在近地面的莖桿基部長有紅褐色的靈芝屬擔(dān)子果，此擔(dān)子果與曾經(jīng)報道過的引起檳榔莖基腐病的靈芝菌（Ganoderma lucidum）在形態(tài)上有較大差異，根據(jù)癥狀特征初步將其診斷為一種新的檳榔莖基腐病。本研究對其進行了病原菌種類鑒定、致病性測定，并測定了其生物學(xué)特性，為有效防治海南檳榔黃化型病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣本病樣 供試病樣采自海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)檳榔園內(nèi)，從發(fā)病檳榔植株的莖基部采集新鮮的擔(dān)子果，將其放入自封袋內(nèi)帶回室內(nèi)備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、木屑培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基與Czapek培養(yǎng)基配方參考《植病研究方法》[4]，木屑培養(yǎng)基配方參考李增平等[5]的方法。

1.1.3 ITS分析主要試劑 引物ITS1、ITS4（由華大基因提供），OMEGA Fungal DNA Kit，OMEGA Extraction Kit，DNA Marker DL 2 000，Taq-Mixture等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及致病性測定 （1）病原菌分離：采用常規(guī)的組織分離法[4]對病原菌進行分離。

（2）制作接種體：從純化培養(yǎng)的病原菌菌落上切取1 cm×1 cm大小的菌絲塊2塊，接種到滅菌好的木屑培養(yǎng)基中制作接種體，置于室溫下培養(yǎng)30～40 d。

（3）接種：參考李增平等的接種方法[5]，略有改動，待接種體內(nèi)的菌絲長滿菌袋后，將待接的無病的樹齡15 a長果檳榔植株用小刀在近地面莖桿處削一個約3 cm長的平面切口，然后在接種體菌棒上剪開一個大小相近的缺口，將接種體緊貼在檳郎植株切口上，兩端附上濕棉花，用保鮮袋包裹固定。采用相同的方法，于不接菌的滅菌木屑培養(yǎng)基上進行接種，作為對照。

（4）觀察：接種后定期觀察檳榔植株長勢，60 d后每30 d觀察一次發(fā)病情況，并進行拍照和記錄。

1.2.2 病原菌鑒定 （1）形態(tài)觀察。參考《中國真菌志》第十八卷靈芝科、《中國靈芝圖鑒》及《海南大型木生真菌的多樣性》等參考資料中所使用的方法[6-8]，對樣本子實體的宏觀特征及顯微結(jié)構(gòu)進行染色、拍照和測量，拍照和測量使用的軟件為Imagine Pro Plus 5.0。本研究用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氫氧化鉀作為浮載劑制片，于100倍油鏡下進行顯微測量。

（2）ITS序列分析。參考彭軍等[9]的方法進行rDNA-ITS測序分析（略微修改）：從PDA平板上刮取培養(yǎng)的病原菌菌絲，加液氮進行充分研磨后，使用OMEGA Fungal DNA Kit提取DNA；以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對所提取DNA的rDNA-ITS片段進行PCR擴增；將擴增產(chǎn)物進行電泳，在500～750 bp范圍內(nèi)獲得明亮的條帶，使用OMEGA Extraction Kit對產(chǎn)物進行切膠回收，經(jīng)電泳驗證，膠回收產(chǎn)物的條帶亦在500～750 bp范圍內(nèi)；最后將膠回收的產(chǎn)物送華大基因進行測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站用Blastn進行比對，分析其相似性。

1.2.3 生物學(xué)特性測定 選菌齡一致的培養(yǎng)菌，用滅菌的打孔器在其菌落邊緣打取直徑約5 mm的圓形菌餅，對其進行生物學(xué)特性測定，將菌餅接至平板中央，每個處理重復(fù)3～4次，觀察其菌落生長情況，待最優(yōu)條件下菌絲生長至培養(yǎng)皿邊緣時取出，用十字交叉法測量菌落直徑。除溫度測定外，其余均在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；除光照測定外，其余均在黑暗條件下培養(yǎng)；碳源和氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為不加碳源或氮源的Czapek培養(yǎng)基，其余條件下所用培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。相關(guān)試驗條件設(shè)置分別為：

①溫度：設(shè)置10、15、20、25、26、28、30、32、34、35 ℃共10個溫度梯度，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)。

②光照：照明燈為15 W，設(shè)置連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和光暗交替3種光照條件。

③pH值：將滅菌后的PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至2、3、4、5、6、7、8、9、10共9個梯度。

④碳、氮源：分別稱取相同含碳百分比的葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、蔗糖、麥芽糖-α-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、肌醇、甘露醇、甘油作碳源；分別稱取相同含氮百分比的硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨、L-天門冬酰胺、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏作氮源；設(shè)置不加碳源、氮源的培養(yǎng)基作對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計軟件SAS 9.1.3、Duncan′s multiple range test對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔莖基腐病病害調(diào)查

筆者于2015年11月21日在陵水縣光坡鎮(zhèn)一個檳榔園進行病害調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)有4%的檳榔植株感染莖基腐病。田間發(fā)病的檳榔病株從下層葉片開始由外向內(nèi)部逐漸失綠，葉片從葉柄基部下折倒掛，繼而變黃干枯，樹勢逐漸衰弱，樹冠最后干枯死亡；潮濕季節(jié)在將死或已病死的檳榔莖桿基部及暴露的根須上長出紅褐色擔(dān)子果，莖基組織和病根呈海綿狀濕腐，有時病根表面長有白色菌絲（圖1）。

2.2 致病性測定

60 d后檢查接種分離菌的檳榔植株莖桿基部，發(fā)現(xiàn)接種部位均已長滿白色菌絲，病原菌已在莖桿上成功定殖并擴展；120 d后接種部位內(nèi)部組織變褐，組織開始變軟濕腐，頂部嫩葉發(fā)黃，中下層葉片失綠發(fā)黃并從葉柄基部下折倒掛于莖干上，與田間發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致。未接菌的對照植株僅接種部位表面稍變色，內(nèi)部組織完好，樹冠無異常變化（圖2）。取發(fā)病變色的組織進行分離，重新分離獲得了培養(yǎng)形狀與最初分離物一致的菌株，表明該菌株為致病菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 （1）菌落特征。致病菌在PDA培養(yǎng)基中菌落呈圓形，白色，老化后變?yōu)槿榘咨磷攸S色，邊緣整齊。在木屑培養(yǎng)基表面長有潔白且致密的菌絲層，接菌約150 d后形成與田間生長類似的擔(dān)子果（圖3）。

（2）子實體。擔(dān)子果一年生，有粗短的柄，木栓質(zhì)。菌蓋貝殼形，大小為（56.2～100.5）mm×（78.6～95.9）mm，邊緣厚約1.9～5.5 mm，基部厚度為30.5～34.3 mm，菌蓋邊緣橘黃色，中部至基部變?yōu)榧t褐色或黑褐色，有細(xì)密清晰的同心環(huán)紋和放射狀突起的縱脊，具似漆樣光澤；邊緣鈍，干后奶油色。菌肉上層呈褐色，接近菌管處呈深褐色，有明顯的環(huán)紋，菌肉中有黑色殼質(zhì)層。菌管木栓質(zhì)，褐色，孔面新鮮時白色，觸摸后變?yōu)闇\褐色，干后為草黃色；管口略圓形，管壁較厚、全緣，每毫米3～5個。菌柄背生，暗紅色，長11.3～49.9 mm，粗20.6～30.7 mm（圖4-A）。

（3）顯微結(jié)構(gòu)。菌絲系統(tǒng)三體型如圖4-B所示。生殖菌絲在棉藍試劑中被染成藍色（CB+），透明，薄壁，部分有隔膜，直徑4.01～7.34 μm；骨架菌絲在棉藍試劑中不變藍（CB-），褐色，厚壁到實心（內(nèi)腔窄），樹狀分枝，骨架干直徑3.03～8.19 μm，分枝末端形成褐色鞭毛狀骨架-纏繞菌絲；纏繞菌絲（CB+），無色，厚壁，有分枝，直徑0.92～2.56 μm。皮殼（圖4-C）呈擬子實層型，淡褐色到褐色，組成菌絲棍棒狀，頂端膨大呈紡錘狀。擔(dān)孢子（圖4-D）呈狹長卵圓形（CB-），頂端平截或凸起，內(nèi)部有一明顯的油滴，雙層壁，孢壁有疣狀紋飾，外壁無色透明，內(nèi)壁加厚并有小刺，淡黃褐色，大小為（9.771～12.11）μm×（4.670～6.249） μm，平均長為11.05 μm，平均寬為5.36 μm，長寬比（Q）=1.69～2.31，其形態(tài)特征與趙繼鼎等[6]報道的狹長孢靈芝（Ganoderma boninense Pat.）相似。

2.3.2 rDNA-ITS序列比對 經(jīng)測序可知，所得rDNA-ITS序列為539 bp，將其在NCBI上進行Blastn比對，所得ITS序列（NCBI登錄號為KX499467）與NCBI登錄號為KM220584.1、KM271997.1、KM015454.1、KF164430.1等的狹長孢靈芝（Ganoderma boninense Pat.）序列的相似度最高，達99%。

結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析，將此病原菌鑒定為狹長孢靈芝。

2.4 生物學(xué)特性測定

2.4.1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 病菌菌絲在15～32 ℃均能生長，適宜生長溫度為26～30 ℃，最適生長溫度為28 ℃，到34 ℃時停止生長，但是并未死亡，轉(zhuǎn)移至適宜溫度時可繼續(xù)生長（圖5）。

2.4.2 不同光照對病原菌菌絲生長的影響 在不同光照條件處理下，病原菌菌絲生長速度差異較大。在連續(xù)黑暗條件下菌絲生長速度最快，菌落邊緣整齊，菌絲呈透明毛絮狀，生長均勻；在連續(xù)光照條件下生長最慢，菌絲中部呈乳白色，邊緣透明稀?。辉诠獍到惶鏃l件下菌絲厚薄不均，有明顯的層次感（圖6）。

2.4.3 不同pH對病原菌菌絲生長的影響 病原菌菌絲在pH3～8均可生長，最適生長的pH為5～6，表明病原菌喜歡偏酸的生長環(huán)境，過酸和過堿的環(huán)境均不利于菌絲的生長（圖7）。

2.4.4 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響

在測試的碳源中，以蔗糖為供試碳源的培養(yǎng)基中菌落直徑最大，菌絲層較厚，說明以蔗糖為碳源的菌落長勢最佳，其次是D-木糖和葡萄糖，在α-乳糖中生長速度最慢，長勢最差。從菌落生長厚度來看，在糖類的培養(yǎng)基中菌絲層普遍較厚，菌絲生長較好，表明該病原菌對糖類的利用率比醇類高（表1）。

在測試的氮源中，在以牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母浸膏為供試氮源的培養(yǎng)基中，菌落均為乳白色，菌絲層濃厚，三者之中以大豆蛋白胨中的菌落直徑最大，但酵母浸膏的菌落直徑與其無顯著差異，表明大豆蛋白胨和酵母浸膏均為最優(yōu)氮源；在硝酸鹽中的菌落直徑普遍大于銨鹽，但菌絲層的厚度不如銨鹽；在L-天冬酰胺中的菌落較大，且長勢良好（表2）。

3 討論

目前在中國海南并未有由狹長孢靈芝引起檳榔莖基腐病的相關(guān)報道，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析，確定引起陵水縣光坡鎮(zhèn)檳榔園中檳榔莖基腐病的病原菌為狹長孢靈芝（G.boninense Pat.），該病原菌的菌絲在黑暗條件下生長速度快；適宜生長的溫度為26～30 ℃；最適生長的pH為5～6；在供試的12種碳源中，最優(yōu)的碳源為蔗糖；在供試的11種氮源中，最優(yōu)的氮源為大豆蛋白胨和酵母浸膏。據(jù)洪祥千等[10]、李增平等[11]、李專[12]、余鳳玉等[13]、陳錦平等[14-15]報道，引起檳榔莖干和根部病害的病原菌有：有害木層孔菌（Phellinus noxius）引起檳榔褐根病，炭色焦菌（Ustulina deusta）引起檳榔黑紋根病，以及引起檳榔莖基腐病（或紅根?。┑撵`芝菌（Ganoderma lucidum）。國外有關(guān)報道稱，檳榔莖基腐病的病原菌也為靈芝（G. lucidium）[16]。由狹長孢靈芝引起的病害癥狀與大部分病原靈芝菌引起的癥狀大致相同，均是出現(xiàn)葉片失綠、黃化、枯萎、莖桿或根部組織腐爛，后在莖桿處長出擔(dān)子果。Pilotti[17]指出狹長孢靈芝主要寄生于棕櫚科植物，可引起油棕和椰子發(fā)生莖基腐病。關(guān)于由狹長孢靈芝引起的油棕莖基腐病研究較多，該病是油棕生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的病害，其對東南亞國家的油棕產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，特別是馬來西亞和印度尼西亞[18-20]；Peries等于1974年報道稱，在斯里蘭卡發(fā)生的椰子莖腐病是由狹長孢靈芝引起的[21]。在國內(nèi)，戴玉成等[7-8]分別在《中國靈芝圖鑒》和《海南大型木生真菌的多樣性》中記錄并描述了生長在闊葉樹上的狹長孢靈芝，但國內(nèi)外均未曾見有由狹長孢靈芝引起的檳榔莖基腐病的相關(guān)報道。Nawawi等[22]研究了馬來西亞半島上引起油棕莖基腐病的狹長孢靈芝菌絲最適生長溫度為27～30 ℃，最適pH為3.7～5.0。海南陵水檳榔上的狹長孢靈芝生長的最適溫度與Nawawi等[22]的研究基本一致，但是最適pH有所差異，原因可能是環(huán)境條件或病原菌菌株不同所致。由狹長孢靈芝（G. boninense Pat.）引起的檳榔莖基腐病可造成檳榔植株整株死亡，且發(fā)病速度較快，建議在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)此病后可將病株連根挖出，曬干燒毀，病穴撒石灰粉消毒，以防止該病的擴散蔓延。

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