野生種花生鈣依賴蛋白激酶基因家族的生物信息學(xué)分析

李東霞 石鵬 賀梁瓊 楊偉波 符海泉 徐中亮

摘 要 Ca2+是植物中重要的第二信使，幾乎介導(dǎo)了植物生長(zhǎng)發(fā)育的全部反應(yīng)。鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是植物中重要的鈣傳感蛋白，在植物生命活動(dòng)中扮演著重要角色。目前2個(gè)二倍體野生種花生全基因組序列已經(jīng)公布，而由2個(gè)野生種雜交后形成的異源四倍體栽培種花生的全基因組序列還沒有公布，野生種花生CDPKs的生物信息學(xué)分析結(jié)果可以為栽培種花生CDPKs的研究提供參考。本研究采用生物信息學(xué)方法和工具對(duì)2個(gè)野生種花生CDPKs基因家族的全基因組分布、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和理化性質(zhì)等進(jìn)行分析。結(jié)果表明：2個(gè)野生種花生全基因組均比對(duì)到35個(gè)CDPKs基因序列，野生種花生與擬南芥CDPKs基因結(jié)構(gòu)類似，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有典型的蛋白質(zhì)激酶和EF手型結(jié)構(gòu)域，2個(gè)野生種花生與其它物種在進(jìn)化過程中CDPKs變異較小，可能作為鈣傳感蛋白在細(xì)胞內(nèi)各個(gè)部位和細(xì)胞器中行使功能。本研究結(jié)果可為栽培種花生的CDPKs結(jié)構(gòu)和功能研究提供參考。

關(guān)鍵詞 野生種花生；鈣依賴蛋白激酶；生物信息學(xué)；EF手型結(jié)構(gòu)域

中圖分類號(hào) S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Bioinformatics Analysis of Calcium Dependent Protein Kinases

Gene Family in Wild Peanut

LI Dongxia1，2， SHI Peng1，2， HE Liangqiong3， YANG Weibo1，2， FU Haiquan1，2， XU Zhongliang1，2

1 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China

2 Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops， Wenchang， Hainan 571339， China

3 Cash Crops Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract The calcium ion（Ca2+）is known as a key second messenger in plants ， almost participate plant growth and development. Calcium dependent protein kinases（CDPKs）is the important calcium sensor proteins， it play an important role in the life of plant. Now， two wild diploid peanut genome sequences have been published， but the sequence of allotetraploid peanut that derived from a hybridization between two wild species has not been published. The results of bioinformatics can offer a reference for the CDPKs analysis of cultivated peanut. In this study， we analyzed two wild peanut CDPKs' genome distribution， genes structure， evolution， physical and chemical properties using bioinformatics methods and tools. The results indicated that 35 CDPKs gene sequences were found in two wild peanut genome respectively， CDPKs genes structure is similar between wild peanuts and Arabidopsis thaliana， protein kinases and EF hand domain were found in the protein structure， CDPKs variation is small between two wild peanuts and other species in the evolutionary process， CDPKs may function as calcium sensor protein within all the parts of cell and organelles. The results can provide reference for the study of CDPKs' structure and function of cultivated peanut.

Key words wild peanut； calcium dependent protein kinases； bioinformatics； EF-hand domain

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.017

花生（Arachis hypogaea L.）是中國(guó)主要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，也是海南省的重要油料作物[1-2]。鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與植物從種子萌發(fā)、生長(zhǎng)分化、形態(tài)建成到開花結(jié)果的全過程[3]。而花生是喜鈣作物，對(duì)缺鈣非常敏感[4]，因土壤缺鈣造成花生大幅減產(chǎn)降質(zhì)的問題尤為突出。海南島是一個(gè)典型的熱帶土壤分布區(qū)，成土過程中鈣淋失嚴(yán)重，且鹽基高度不飽和，肥料施入后易遭損失而且海南島也是中國(guó)植物中含鈣最低的地區(qū)之一[5-6]。因此，在生產(chǎn)成本降低和環(huán)境保護(hù)雙重壓力下篩選耐低鈣花生品種對(duì)提高海南花生產(chǎn)量至關(guān)重要。

CDPKs（calcium-dependent protein kinases）是在植物中首先發(fā)現(xiàn)的一種鈣依賴型蛋白激酶，是植物和一些原生生物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，在胞內(nèi)鈣信號(hào)的放大并向下級(jí)聯(lián)傳遞過程中起著十分重要的作用[7]。CDPK擁有4個(gè)特別的結(jié)構(gòu)域，N-末端結(jié)構(gòu)域，ATP結(jié)合激酶結(jié)構(gòu)域，自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域和包含4個(gè)鈣離子結(jié)合EF-hand的C-末端的類鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域。鈣離子能直接結(jié)合到CDPK的類鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域上，因此CDPK能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化，由此帶來的構(gòu)象變化會(huì)造成激酶結(jié)構(gòu)域的激活和自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域的變化[8-9]。鈣信號(hào)的進(jìn)一步傳遞則需經(jīng)Ca2+結(jié)合蛋白和鈣依賴蛋白激酶等才能完成，最后引起脅迫相關(guān)基因表達(dá)量的變化，從而引發(fā)植物細(xì)胞和植株生理生化過程的變化，提高植物對(duì)不良環(huán)境刺激的耐受性[10-11]。

植物CDPKs的研究起步較晚，但發(fā)展很快，目前在擬南芥中找到了34個(gè)CDPK基因，而且梨、棉花、大豆、水稻、番茄和玉米等許多其它物種中也存在CDPK家族[12-17]。CDPK主要參與植物干旱和高鹽脅迫、抗病反應(yīng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光周期調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)代謝等生理活動(dòng)，在玉米、擬南芥、水稻、黃瓜等作物中都有相關(guān)研究報(bào)道[18]。Jain等[19]研究發(fā)現(xiàn)花生在土壤缺鈣情況下，種子發(fā)育過程中CDPK基因上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，在莢果發(fā)育過程中也維持著較高的表達(dá)水平。

目前生產(chǎn)上種植的花生是栽培種花生（Arachis hypogaea L.），是四倍體一年生草本作物。其祖先為野生種花生，這2個(gè)野生種（Arachis duranensis，Arachis ipaensis）均為二倍體，已經(jīng)測(cè)序完成并公布序列[20]。對(duì)花生鈣依賴蛋白激酶開展研究非常必要，值得注意的是目前野生種花生公布了序列，而栽培種花生的全基因組序列還沒有公布，要研究栽培種花生CDPK，可以借鑒已公布序列的野生種花生。生物信息學(xué)作為一門新學(xué)科，近年來隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，得到了越來越多的應(yīng)用[21]。目前栽培種花生CDPKs研究較少，本文從生物信息學(xué)的角度收集和分析野生種花生CDPK基因序列，為栽培種花生CDPK提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥AtCDPK1-AtCDPK34這34個(gè)基因蛋白質(zhì)序列從TAIR網(wǎng)站下載（http：//www.arabidopsis.org/）。野生花生種Arachis duranensis由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。從NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站上下載到用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的其它物種CDPK氨基酸序列有：擬南芥（Arabidopsis thaliana，AtCDPK1，NP_196107.1）、野生大豆（Glycine soja，GsCDPK，KHN05362.1）、野生大豆（Glycine soja，GsCDPK1，KHN08596.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，MtCDPK1，XP_003589907.1）、可可（Theobroma cacao，TcCDPK1，XP_007010504.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum，GhCDPK，ACH88439.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum，GhCDPK1，ACX37459.1）、山葡萄（Vitis amurensis，VaCDPK2，AGS14999.1）、楊樹（Populus trichocarpa，PtCDPK2，XP_002315411.1）。

1.2 試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司（K1622）；Taq DNA聚合酶購(gòu)自中科瑞泰；引物合成和TA克隆測(cè)序通過華大基因公司完成；其它生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

野生花生CDPKs序列比對(duì)在Peanutbase網(wǎng)站（http：//peanutbase.org/）上進(jìn)行，以擬南芥的CDPK基因蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，選取E-value小于10-5的序列（值越低，結(jié)果可靠性越高）；基因結(jié)構(gòu)分析使用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線工具進(jìn)行；野生花生種Arachis duranensis葉片RNA提取采用陳高等[22]方法進(jìn)行；cDNA第一條鏈合成按照Thermo Fisher公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行；以預(yù)測(cè)的AdCDPK1基因的CDS序列為模板設(shè)計(jì)克隆引物（表1），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系如下：模板10 μL、10×Taq Buffer 5 μL、Taq DNA Polymerase（5 U/μL）1 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、上下游引物各2.5 μL、ddH2O 28 μL。2對(duì)引物的PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59.5/54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，送PCR產(chǎn)物到公司克隆測(cè)序；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析使用ExPASY中的Prosite工具進(jìn)行；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模采用Swiss-Model在線工具（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建利用MEGA 6軟件進(jìn)行，采用鄰接關(guān)系法（Neighbor-Joining），進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)計(jì)算；親水/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用ProtScale、TMHMM和SignalP在線工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生種花生CDPKs基因分布與特點(diǎn)

利用擬南芥34個(gè)CDPK基因在2個(gè)野生種花生中均分別比對(duì)到35個(gè)基因，且在10個(gè)染色體上都有分布（表2，表3）。野生種花生Arachis duranensis的3和8號(hào)染色體上分布最少只有2個(gè)，2和10號(hào)染色體上分布最多有5個(gè)。野生種花生Arachis ipaensis的8和9號(hào)染色體上分布最少只有1個(gè)，2和5號(hào)染色體上分布最多有5個(gè)。2個(gè)野生種在基因分布上有相似性，比如都在2號(hào)染色體上分布著5個(gè)CDPK基因，說明2個(gè)野生種基因組之間存在一定同源性，在進(jìn)化中相距的時(shí)間不會(huì)太長(zhǎng)。野生種花生Arachis duranensis的CDPK基因CDS長(zhǎng)度平均為1 644 bp，蛋白質(zhì)長(zhǎng)度平均為547 aa，外顯子數(shù)平均為8個(gè)。野生種花生Arachis ipaensis的CDPK基因CDS長(zhǎng)度平均為1 619 bp，蛋白質(zhì)長(zhǎng)度平均為538 aa，外顯子數(shù)平均為8個(gè)。

通過對(duì)2個(gè)野生種花生CDPKs基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)野生種同一染色體上的CDPK基因結(jié)構(gòu)相似，例如2號(hào)染色體上的AdCDPK1，AdCDPK2，AdCDPK3與AiCDPK1，AiCDPK2，AiCDPK3基因結(jié)構(gòu)類似，不過外顯子數(shù)目、外顯子和內(nèi)含子長(zhǎng)度存在部分差異（圖1）。

2.2 AdCDPK1基因序列驗(yàn)證

為驗(yàn)證基因序列預(yù)測(cè)的真實(shí)性，以AdCDPK1基因?yàn)槔M(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。取野生種花生Arachis duranensis幼嫩葉片提取總RNA（圖2），使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA（圖3）。利用預(yù)測(cè)的AdCDPK1基因CDS序列設(shè)計(jì)2對(duì)擴(kuò)增引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2條900 bp左右的條帶（圖4）。送華大基因進(jìn)行TA克隆測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到一條1 755 bp的序列。該序列與預(yù)測(cè)的基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性高達(dá)99.6%，只有7個(gè)堿基的差異（圖5）。該結(jié)果說明，野生種花生Arachis duranensis中的確存在預(yù)測(cè)的AdCDPK1基因，證實(shí)了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基因真實(shí)性。

2.3 野生種花生CDPKs蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析

蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，野生種花生的CDPK蛋白質(zhì)基本具有鈣依賴蛋白質(zhì)激酶的特征結(jié)構(gòu)域。以AdCDPK1為例，發(fā)現(xiàn)AdCDPK1的121～379位為蛋白質(zhì)激酶保守域，該區(qū)域是受Ca2+介導(dǎo)的蛋白質(zhì)激活結(jié)構(gòu)，422～563分布著4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)，作為Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，是鈣依賴蛋白激酶的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)（圖6）。野生種花生CDPK蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與擬南芥等物種相似，特別是蛋白質(zhì)激酶域和EF-hand結(jié)構(gòu)，這些區(qū)域的保守性非常高。其中，每個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域由13個(gè)氨基酸殘基組成（DTDNSGQITFEEL，DIDNSGTIDYGEF，DKDGSGYITQDEL，DQDNDGR

IDYNEF），這些氨基酸殘基形成2個(gè)α-螺旋，進(jìn)而形成環(huán)，鈣離子正是通過這些環(huán)結(jié)合上去。

AdCDPK1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)與模板4mx9.1.A相似性最高，建模結(jié)果也表明是鈣依賴蛋白激酶（圖7）。圖中箭頭所示即為特征結(jié)構(gòu)域4個(gè)EF-hand形成的鈣離子結(jié)合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與Prosite工具分析的結(jié)果一致。

將70個(gè)野生種花生CDPKs氨基酸序列與擬南芥、野生大豆、蒺藜苜蓿、可可、陸地棉、山葡萄和楊樹進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，這些物種和野生花生CDPKs蛋白質(zhì)的氨基酸序列變異較多，造成不同物種聚在一起的可能性很低（圖8）。但是值得注意的是，野生種花生Arachis duranensis和Arachis ipaensis的CDPKs相互混雜在一起，可能是因?yàn)?個(gè)野生種花生基因組具有一定同源性。利用CDPK氨基酸序列分析野生花生和其它物種進(jìn)化關(guān)系時(shí)，能較好地體現(xiàn)物種間的真實(shí)親緣關(guān)系。

2.4 野生花生AdCDPK1的野生種花生CDPKs蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

通過對(duì)野生花生CDPKs蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其可能作為感受蛋白在細(xì)胞內(nèi)各個(gè)部位和細(xì)胞器中行使功能。分析結(jié)果以AdCDPK1為例進(jìn)行展示，分析發(fā)現(xiàn)其為親水性蛋白質(zhì)；沒有發(fā)現(xiàn)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，說明其不是跨膜蛋白質(zhì)；AdCDPK1預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)沒有達(dá)到閾值，不是信號(hào)肽，說明不是作為信號(hào)肽行使功能（圖9～11）。

野生種花生CDPK蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)野生種的CDPK定位基本一致，主要分布在葉綠體基質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)膜和葉綠體內(nèi)囊體膜中。其中Arachis duranensis部分CDPK蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果見表4。

3 討論

Ca2+作為重要的第二信使，它在細(xì)胞質(zhì)中濃度的變化是植物響應(yīng)環(huán)境刺激信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分。最近的研究結(jié)果揭示了CDPKs作為Ca2+介導(dǎo)的免疫及脅迫響應(yīng)的重要調(diào)控者，對(duì)植物的生存至關(guān)重要[10，23]?；ㄉ侵袊?guó)長(zhǎng)江以南各省主要食用油料作物之一，然而華南、長(zhǎng)江流域2大花生產(chǎn)區(qū)高溫、多雨，土壤酸度高，缺鈣普遍嚴(yán)重，花生的生長(zhǎng)受低鈣脅迫嚴(yán)重，因土壤缺鈣造成花生大幅減產(chǎn)降質(zhì)的問題突出。栽培種花生基因組沒有公布序列，本文借鑒野生種花生基因組序列來分析CDPK，借此了解栽培花生CDPK基因家族的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究栽培種花生CDPK基因家族對(duì)于鈣吸收傳遞、抗逆性和碳氮代謝等生命活動(dòng)提供依據(jù)。對(duì)AdCDPK1的克隆測(cè)序也驗(yàn)證了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)基因的真實(shí)性，也可為分析栽培種花生CDPK基因提供參考。

水稻OsCPK21的ORF為1 698 bp，編碼565個(gè)氨基酸，OsCDPK14的ORF為1 542 bp，編碼513個(gè)氨基酸，與野生種花生CDPK的CDS和氨基酸長(zhǎng)度基本一致[24-25]。擬南芥34個(gè)CDPK基因分布在5個(gè)染色體上，4號(hào)染色體上最多有11個(gè)，3號(hào)染色體最少只有4個(gè)。野生種花生Arachis duranensis的每條染色體上CDPK基因數(shù)量為2～5個(gè)，野生花生Arachis ipaensis的每條染色體上CDPK基因數(shù)量為為1～5個(gè)，與擬南芥相比偏少。2個(gè)野生種花生有4個(gè)染色體上CDPK基因數(shù)量相同，其它6個(gè)染色體則存在一些差異。擬南芥中34個(gè)CDPK蛋白質(zhì)的激酶結(jié)構(gòu)域、自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域和類鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守，而N末端結(jié)構(gòu)域則變異較大。其中類鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域包含94～147個(gè)氨基酸，由4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)構(gòu)成，具有結(jié)合鈣離子的功能，單個(gè)鈣離子分子可以結(jié)合到EF手型結(jié)構(gòu)形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上[26]，野生種花生CDPK也是如此有類似的結(jié)構(gòu)，說明也可能具有同樣的功能。楊樹和擬南芥CDPK蛋白質(zhì)進(jìn)化分析表明，它們大致可以分為3類，總體來看相互之間進(jìn)化關(guān)系較近，大部分CDPK蛋白質(zhì)具有相似的功能[27]。野生種花生CDPK同源性同樣很高，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明它們混雜在一起，而與十字花科擬南芥、豆科的野生大豆、梧桐科的可可、錦葵科的陸地棉和楊柳科的楊樹等其它物種聚在一起的可能性很低，可能是由于CDPK蛋白質(zhì)N末端的序列變異較大造成，與Shu-Hua等[26]的研究結(jié)果一致。由于CDPK蛋白質(zhì)除了EF手型和激酶結(jié)構(gòu)域較為保守外，N末端等區(qū)域變異較多，因此用CDPK蛋白質(zhì)的氨基酸序列來研究物種的進(jìn)化關(guān)系能很好地展現(xiàn)其真實(shí)親緣關(guān)系。擬南芥中9個(gè)CDPK基因亞細(xì)胞定位分析表明，AtCPK3、AtCPK4在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中存在，而AtCPK1、7、8、9、16、21、28則定位在膜上，水稻OsCPK21定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，OsCPK18定位于細(xì)胞膜，煙草NtCPK4在整個(gè)細(xì)胞中都存在，NtCPK5定位于細(xì)胞膜，馬鈴薯的StCDPK5定位于細(xì)胞膜（Dammann，Campos-Soriano，wang，Kobayashi）[28-31]。2個(gè)野生種花生CDPK蛋白質(zhì)與以上物種定位結(jié)果基本一致，基本分布在細(xì)胞中各個(gè)部位和細(xì)胞器中。

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