金花葵多糖提取的工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

巫玲麗　穆禎強　張利

摘要：【目的】優(yōu)化金花葵多糖的提取工藝，考察金花葵多糖的抗氧化活性，為金花葵多糖的研究和利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳越鸹嗵翘崛÷蕿樵u價指標，在單因素試驗基礎上，采用L9（33）正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取工藝，通過對DPPH自由基和羥基自由基（·OH）清除能力的考察評價金花葵多糖的體外抗氧化活性?！窘Y果】影響超聲輔助提取金花葵多糖效果的因素排序為：超聲時間>料液比>超聲溫度，其最佳提取工藝條件為：料液比1∶50、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃，在此條件下金花葵多糖的提取率為22.32%。自由基清除試驗結果表明，金花葵多糖對DPPH自由基和·OH的清除率呈現(xiàn)劑量依賴性?！窘Y論】優(yōu)化得到的金花葵多糖提取工藝操作簡單可行，提取的金花葵多糖具有較強抗氧化活性，該工藝可在金花葵多糖的提取研究和開發(fā)利用中應用。

關鍵詞： 金花葵；多糖；超聲提?。豢寡趸钚?/p>

中圖分類號： TQ461 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0109-05

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharides from Hibiseu smanihot L. was optimized，and its antioxidant activity was investigated，in order to provide basis for research and utilization of polysaccharides from H. smanihot L. 【Method】Taking extraction rate of H. smanihot L. polysaccharides as index， and on the basis of single factor experiment，the extraction technology assisted by ultrasonic was optimized by L9（33） orthogonal test. The antioxidant activities of H. smanihot L. polysaccharides were evaluated through scavenging experiment on DPPH free radical and the hydroxyl free radical（·OH）. 【Result】The three factors affecting ultrasonic-assisted extraction of H. Smanihot L. polysaccharides were in order as follows：ultrasonic time>material-liquid ratio>ultrasonic temperature. The optimum extraction process parameters of polysaccharides were as follows material-liquid ratio 1∶50，ultrasonic time of 30 min， ultrasonic temperature 50 ℃. Under such condition， the extraction rate reached 22.32%. Free radical scavenging experiment showed that scavenging effects of H. Smanihot L. polysaccharides towards DPPH free radical and ·OH varied according to the dosage. 【Conclusion】The optimized extraction process of H. Smanihot L. polysaccharides is simple，convenient and feasible. And H. Smanihot L. polysaccharides has strong antioxidant activity. This processing technique can be applied in extraction and development of H. Smanihot L. polysaccharides.

Key words： Hibiseu smanihot L.； polysaccharides； ultrasonic extraction； antioxidant activity

0 引言

【研究意義】金花葵（Hibiseu smanihot L.）又名菜芙蓉、野芙蓉，是一年生草本植物，既可藥用又可食用，根、稈、花、葉和果均可利用，還可作觀賞植物，被稱為“植物界大熊貓”，近年來已在多地推廣種植。植物多糖具有降血糖和血脂（羅祖友等，2007）、免疫調節(jié)（尚慶輝等，2015）、抑制惡性黑素瘤（馬文宇和吳鄧婷，2016）等生物學功能。黃秋葵多糖有抗氧化活性，但對與其同屬金花葵中多糖活性的研究未見報道。因此，優(yōu)化金花葵多糖的提取工藝并考察其抗氧化活性，對金花葵多糖的研究和利用具有重要意義。【前人研究進展】梅洪睿等（2009）鑒別結果表明，金花葵種子中含有生物堿。王剛和姚佳（2010）采用水蒸氣蒸餾法從金花葵子中提取揮發(fā)油，用氣相色譜—質譜法對其化學成分進行分離鑒定，結果表明，金花葵子揮發(fā)油的主要成分為亞油酸（10.74%）、軟脂酸（42.01%）和順-9-烯-十八烷酸（8.14%）。劉琦（2012）應用高速逆流色譜法分離金花葵花中兩種黃酮類化合物，結果表明，從100.3 mg金花葵花總黃酮純化物中分離得到金絲桃苷10.07 mg，純度達94.194%；葛根素13.5 mg，純度達94.579%。趙煥煥（2012）采用水提醇沉法提取黃秋葵多糖，并用蒽酮—硫酸法測定RPS含量，應用1，1-二苯基苦味?；诫?、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法檢測多糖活性，結果表明，黃秋葵中多糖含量較高且對3種自由基的清除率呈現(xiàn)劑量依賴性?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于金花葵多糖提取及其體外抗氧化活性的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】優(yōu)化金花葵多糖提取工藝，并考察提取的金花葵多糖抗氧化活性，為金花葵多糖的研究、開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

金花葵干花苞購自河南新鄉(xiāng)。試驗使用的儀器及藥劑：數(shù)控超聲波裝置（KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外—可見分光光度計（752，上海光學儀器有限公司）；水浴鍋（OSB-2100，上海愛朗儀器有限公司）；雙循環(huán)水式多用真空泵（CA-1115，上海愛朗儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（N-1100，上海愛朗儀器有限公司）；DPPH（美國Sigma公司）；葡萄糖標準品無水乙醇、鄰苯三酚、三（羥甲基）氨基甲烷、苯酚、硫酸、水楊酸、雙氧水和硫酸亞鐵均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1. 2 標準曲線繪制

參考羅澤萍等（2015）的方法，稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品250.0 mg置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度。分別吸取質量濃度1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL于6個100 mL容量瓶中定容，備用。再分別吸取這6種濃度溶液2.0 mL于25 mL比色管中，以蒸餾水作參比，依次加入新配制質量分數(shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，再緩慢加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置5 min，在沸水浴中加熱15 min后冷卻至室溫。在200～800 nm范圍內掃描波長，得出在490 nm處的吸收最強，故在490 nm處測定吸光值，以葡萄糖質量濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光值A為縱坐標繪制標準曲線。

1. 3 金花葵多糖提取工藝優(yōu)化

1. 3. 1 金花葵多糖提取 金花葵在70 ℃下干燥24 h，粉碎，過80目篩備用。取1.000 g金花葵花粉，以蒸餾水為溶劑，在一定料液比、超聲時間及超聲溫度條件下超聲提取金花葵多糖。提取液經離心，取上清液減壓濃縮，加入無水乙醇至終濃度80%，醇沉過夜，離心，取下層沉淀，無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥即得金花葵粗多糖。

1. 3. 2 單因素試驗 稱取1.000 g金花葵粉，分別以料液比、超聲時間和超聲溫度為單一變量，對金花葵多糖提取率進行單因素試驗。

1. 3. 3 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，料液比、超聲時間和超聲溫度分別取3個水平進行正交試驗，優(yōu)化金花葵多糖的超聲提取工藝。正交試驗水平和因素見表1。

1. 4 金花葵多糖抗氧化活性測定

1. 4. 1 DPPH自由基清除 分別取不同量多糖，用超純水溶解，并按1.2方法測得其濃度分別為3.290、1.645、0.823、0.412和0.206 mg/mL，稱取陽性對照品維生素C（Vc）配制為相同濃度溶液。稱取DPPH 0.0040 g，用乙醇溶液溶解定容至100 mL棕色瓶中，得0.1 mmol/L DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。參考趙煥煥等（2012）的方法，分別取1.0 mL不同濃度金花葵多糖溶液于比色管中，再加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻后置于暗處30 min，于517 nm處測定吸光值Ai；同時設空白組A0（1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液）和樣底組Aj（2.0 mL乙醇溶液代替DPPH溶液），3次重復，求其平均值，計算清除率。清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0 ×100。以同等條件測得Vc對DPPH自由基的清除率。

1. 4. 2 羥基自由基（·OH）清除 參考楊申明等（2015）的方法，分別取不同量多糖，用超純水溶解，并按1.2方法測得其濃度分別為4.110、3.425、2.740、2.060和1.370 mg/mL，稱取陽性對照品Vc配制為相同濃度溶液。在11支比色管中依次加入1.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1.0 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液和1.0 mL不同濃度的樣品溶液，最后再加入1.0 mL 5 mmol/L H2O2溶液搖勻，37 ℃水浴中靜置30 min，在510 nm處測吸光值A1。以1.0 mL水代替樣品測得吸光值A0，以1.0 mL水代替H2O2測得吸光值A2。用同樣方法測得對照品Vc的清除率。

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100

2 結果與分析

2. 1 葡萄糖標準曲線

以不同質量濃度葡萄糖對照品測得的吸光值建立回歸方程：y=14.203x-0.0079（R2=0.9993），葡萄糖在質量濃度0.01～0.06 mg/mL范圍內與吸光值有良好的線性關系（圖1）。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 不同料液比對金花葵多糖提取率的影響 取1.000 g金花葵粉末，以料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60，固定超聲溫度60 ℃，超聲30 min過濾取上清液，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇濃度達到80%，靜置過夜析出多糖，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法測定多糖含量，并計算提取率。由圖2可看出，料液比對金花葵多糖提取的影響分兩個階段，以1∶40為界，1∶40前隨著料液比的降低提取率升高，1∶40后隨著料液比的降低提取率降低，但總體上低料液比的提取率比高料液比高，因此選擇1∶40、1∶50和1∶60作為正交優(yōu)化試驗參數(shù)。

2. 2. 2 不同超聲時間對金花葵多糖提取率的影響 取1.000 g金花葵粉末，以1∶40料液比，固定超聲溫度60 ℃，分別超聲10、20、30、40和50 min后過濾取上清液，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇濃度達到80%，靜置過夜析出粗多糖，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法測定多糖含量，并計算提取率。由圖3可看出，超聲10～20 min的多糖提取率呈升高趨勢，超聲時間達20 min后隨著超聲時間的延長多糖提取率降低，超聲30 min與超聲10 min時提取率相差不明顯，超聲30 min后提取率急劇減小，所以選擇超聲10、20和30 min作為正交優(yōu)化試驗參數(shù)。

2. 2. 3 不同超聲溫度對金花葵多糖提取率的影響 取1.000 g金花葵粉末，以1∶40料液比，分別設超聲溫度30、40、50、60和70 ℃，超聲20 min后過濾取上清液，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇濃度達到80%，靜置過夜析出粗多糖，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法測定多糖含量，并計算提取率。從圖4可看出，多糖提取率隨著超聲溫度的升高而增加，但當超聲溫度達到一定值后多糖提取率隨著溫度的升高而降低，可能是因為超聲溫度過高對多糖的結構產生一定的破壞。因此選擇超聲溫度40、50和60 ℃作為正交優(yōu)化試驗參數(shù)。

2. 3 正交試驗結果

由表2可知，不同因素對金花葵多糖提取率的影響程度不同，通過比較不同因素和水平的平均值和極差，確定各因素對多糖提取率影響大小順序為B>A>C，即超聲時間影響最大，是多糖提取的關鍵因素；最優(yōu)試驗條件組合為A2B3C2，優(yōu)化后的最佳提取工藝試驗條件為：料液比1∶50，超聲時間30 min，超聲溫度50 ℃。在此優(yōu)化條件下進行重復性試驗（n=3），測得金花葵多糖平均提取率為22.32%，RSD=1.35%。

2. 4 金花葵多糖抗氧化活性的測定結果

2. 4. 1 金花葵多糖對DPPH自由基的清除能力 由圖5可看出，金花葵多糖和Vc對DPPH自由基均具有較好的清除效果。在金花葵多糖0.103～3.290 mg/mL范圍內，DPPH自由基清除率逐漸升高，在金花葵多糖最大濃度3.290 mg/mL時，DPPH的清除率達75.75%。

2. 4. 2 金花葵多糖對·OH的清除能力 由圖6可看出，在金花葵多糖0.685～4.110 mg/mL范圍內，隨著多糖濃度的增加，其對·OH的清除率也逐步增加，當濃度達到4.110 mg/mL時，清除率達最大值，為73.36%，說明金花葵多糖具有較強的清除·OH能力。

3 討論

水提醇沉、超聲輔助提取方法提取多糖，因具有操作簡單、提取率高、能耗低和時間短等優(yōu)點，已廣泛應用于蔗梢多糖提取（何雪梅等，2014）、脆江蘺多糖提?。ň犀幀幍龋?016）和香菇多糖提?。◤埫翳さ?，2016）。本研究結果表明，超聲時間是影響金花葵多糖提取效果的最主要因素，超聲時間過長會破壞其他大分子物質活性（董汝晶，2014），其次是料液比，最后是超聲溫度。通過正交試驗得到金花葵多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1∶50、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃，在該工藝條件下重復試驗金花葵多糖的平均提取率為22.32%，其RSD為1.35%，說明該方法重復性較好。超聲輔助提取不僅操作簡單，還省時、環(huán)保，適合金花葵多糖的提取。

生命體在新陳代謝中會產生一定的自由基，這些自由基具有很高的活性，會攻擊人體細胞和器官等，嚴重時造成組織損傷引起機體衰老，同時會誘發(fā)腫瘤等惡性疾?。ㄇ窦芽。?015）。利用清除DPPH自由基和·OH法來評價抗氧化效果的方法運用較普遍，其中高嘉嶼等（2016）采用DPPH法測定白花蛇多糖的抗氧化能力取得了良好的效果。本研究通過體外抗氧化試驗發(fā)現(xiàn)金花葵多糖對DPPH自由基和·OH有較強的清除能力，與同屬的黃秋葵多糖的抗氧化能力（趙煥煥等，2012）相比，金花葵多糖清除DPPH自由基和·OH的能力更強，可作為今后深入研究和開發(fā)利用金花葵多糖的參考依據(jù)。

4 結論

結合單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到的金花葵多糖提取工藝簡單、高效可行，提取的金花葵多糖具有較強抗氧化活性，該工藝可在金花葵多糖的提取研究、開發(fā)和利用中應用。

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（責任編輯 思利華）