香蕉基因組密碼子使用偏好性分析

曲俊杰　黃羽　盧江　魏征　尹玲

摘要：【目的】分析香蕉基因組的密碼子組成及使用偏好性，探討影響密碼子偏好性形成的主要因素，為提高香蕉外源基因的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)基因抗病育種提供參考。【方法】以香蕉基因組的36242條高置信蛋白編碼基因CDS序列為研究對(duì)象，運(yùn)用CodonW 1.4.4統(tǒng)計(jì)分析香蕉基因組的密碼子組成及使用參數(shù)，確定最優(yōu)密碼子，并分析密碼子使用參數(shù)間相關(guān)性?！窘Y(jié)果】從香蕉基因組數(shù)據(jù)中篩選獲得36242個(gè)高置信蛋白編碼基因CDS序列，平均長(zhǎng)度為1035 bp，GC含量為3.0%～75.8%，其中低于20.0%的僅13個(gè)序列，全基因組中GC總含量為50.4%；同義密碼子第3位出現(xiàn)G或C的頻率為52.9%，比出現(xiàn)A或T的頻率高。香蕉基因組的有效密碼子數(shù)（ENC）介于20.0～61.0，平均為50.7；共有17個(gè)最優(yōu)密碼子，其中有15個(gè)密碼子的第3位是G或C；基因編碼區(qū)的長(zhǎng)度和ENC存在正相關(guān)，隨著基因編碼區(qū)長(zhǎng)度的增加，對(duì)以G或C結(jié)尾的密碼子使用偏好性逐漸降低，且編碼區(qū)長(zhǎng)度為400～600 bp的基因具有較高的基因表達(dá)水平?！窘Y(jié)論】香蕉基因組中多數(shù)基因的密碼子使用偏好性較弱，但少部分基因具有強(qiáng)偏好性，偏好使用以G或C結(jié)尾的密碼子，且偏好性受核苷酸組成、基因突變及自然選擇等因素的影響。

關(guān)鍵詞： 香蕉；基因組；密碼子偏好性；最優(yōu)密碼子

中圖分類(lèi)號(hào)： S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）01-0014-06

Abstract：【Objective】In order to provide reference basis for improving expression level of exogenous genes in banana and breeding disease-resistant banana， codon composition and usage bias of banana genome were analyzed， and the factors affecting codon usage bias were studied. 【Method】A total of 36242 high-confidence protein sequences in banana genome were used as data source. Codon composition and usage parameters were analyzed to determine optimal codons using CodonW 1.4.4， then correlation between usage parameters were analyzed. 【Result】CDS sequences of 36242 high confidence protein coding genes were selected from Banana Genome Database， their average length was 1035 bp. GC content of these genes ranged from 3.0% to 75.8%， with the average of 50.4% for whole genome. But there were only 13 sequences with GC content being less than 20.0%. Occurrence frequency of G or C in the third position of synonymous codon was 52.9%， which was higher than that of A or T. The effective number of codon（ENC） of banana genome ranged from 20.0 to 61.0， with the average of 50.7. A total of 17 optimal codons were found from banana genome， 15 of which the third position of synonymous codon was G or C. Furthermore， length of gene coding regions was positively correlated with ENC. In other words， the longer gene coding region was， the weaker usage bias of codons ending with G or C was. And genes with length of 400-600 bp showed higher expression level. 【Conclusion】The codon usage bias for most of genes is weak in banana genome， but a few of genes show stronger codon usage bias， and prefer codons ending with G or C. Meanwhile， the codon usage bias of banana genome is affected by some factors like composition of nucleotides， mutations， natural selection etc.

Key words： banana； genome； codon usage bias； optimal codon

0 引言

【研究意義】香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）植物，生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)將其作為水果，少數(shù)落后地區(qū)亦作為主食。我國(guó)香蕉總產(chǎn)量位居世界前三（劉海清和方佳，2010）。由于絕大多數(shù)香蕉品種具有不育性和多倍性，很難通過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種方式進(jìn)行品種改良，因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)是香蕉育種的有效手段。2012年，人類(lèi)完成了小果野蕉（Musa acuminata）的全基因組測(cè)序工作，繪制了523 Mb的基因組圖譜，并從中預(yù)測(cè)出36549個(gè)基因（DHont et al.，2012），為研究香蕉基因表達(dá)和密碼子使用特點(diǎn)打下了基礎(chǔ)。密碼子是遺傳信息從堿基序列到氨基酸序列傳遞的基本單位，是連接DNA和蛋白質(zhì)的橋梁。編碼同一種氨基酸的所有密碼子稱(chēng)為同義密碼子，因此密碼子具有簡(jiǎn)并性，但編碼不同生物蛋白質(zhì)時(shí)簡(jiǎn)并密碼子的使用也有一定規(guī)律性，稱(chēng)為密碼子的使用偏好性（CUB），其中被優(yōu)先使用的密碼子稱(chēng)為最優(yōu)密碼子（Marashi and Najafabadi，2004）。根據(jù)密碼子偏好性，對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使盡可能多的最優(yōu)密碼子參與外源基因的表達(dá)，也使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更易被操控，對(duì)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行香蕉品種改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，通過(guò)優(yōu)化密碼子以提高外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)水平的研究報(bào)道較多（Soohyun et al.，2012；Stephen et al.，2013；Zelasko et al.，2013；李麗莎等，2016），如通過(guò)密碼子優(yōu)化可提高蘇云金芽胞桿菌（Bt）cry1Ah基因在轉(zhuǎn)基因玉米（李圣彥等，2011；余桂容等，2015）和轉(zhuǎn)基因水稻（周宗梁等，2012）中的表達(dá)量，也可提高蝎毒鎮(zhèn)痛活性肽基因BmK AngM1在畢赤酵母（楊金玲等，2012）中的表達(dá)量。上述研究結(jié)果表明，從宿主細(xì)胞對(duì)密碼子使用偏好性入手，通過(guò)使用最優(yōu)密碼子的方法可明顯提高轉(zhuǎn)基因的成功率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，香蕉品種選育已成為世界性的難題，雖然香蕉的遺傳轉(zhuǎn)化體系已成功建立（May et al.，1995；Acereto-Escoffié et al.，2005；吳靜等，2007；Maziah et al.，2007；Tripathi et al.，2008），但轉(zhuǎn)化率低且受品種基因型限制等問(wèn)題仍未解決（Huang et al.，2007），鮮見(jiàn)有關(guān)香蕉密碼子使用偏好性的文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以香蕉基因組的36242個(gè)高置信蛋白基因編碼信息為研究對(duì)象，分析其密碼子的使用情況，明確香蕉對(duì)密碼子的使用偏好性，以期通過(guò)密碼子優(yōu)化提高外源基因尤其是抗病基因在香蕉中的表達(dá)水平，為香蕉轉(zhuǎn)基因抗病育種和品質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1. 1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//banana-genome.cirad.fr/

content/download-dh-pahang）下載獲得高置信蛋白基因CDS序列。為最大程度降低取樣誤差，編寫(xiě)Java程序并利用其篩選出堿基總數(shù)是3的整數(shù)倍且轉(zhuǎn)錄合成的mRNA含起始密碼子和終止密碼子的CDS序列。

1. 2 密碼子組成和偏好性分析

利用CondonW 1.4.4（http：//codonw.sourceforge.net/）統(tǒng)計(jì)分析香蕉基因組密碼子的使用情況；對(duì)密碼子進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，主要包括同義密碼子第3位上4種堿基的出現(xiàn)頻率（A3s、G3s、C3s、T3s）、全基因組的GC含量，芳香族氨基酸比例（Aro）等；采用同義密碼子的相對(duì)使用度（RSCU）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）和有效密碼子數(shù)（ENC）3個(gè)指標(biāo)對(duì)密碼子偏好性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中RSCU和CAI的計(jì)算參照Sharp和Li（1987）的方法，ENC的計(jì)算參照Wright（1990）的方法。

1. 3 最優(yōu)密碼子確定

采用高表達(dá)優(yōu)越密碼子分析法（Stenico et al.，1994）確定最優(yōu)密碼子，具體操作為：首先計(jì)算所有基因的ENC和RSCU，并對(duì)其進(jìn)行排序，取前1764個(gè)（5%）和后1764個(gè)（5%）基因數(shù)據(jù)，組成高表達(dá)組和低表達(dá)組。比較兩個(gè)組的RSCU，當(dāng)二者的RSCU差值>

0.3，且在高表達(dá)組中RSCU>1，在低表達(dá)組中RSCU<1，可確定該密碼子為最優(yōu)密碼子（Duret and Mouchiroud，1999），并計(jì)算最優(yōu)密碼子數(shù)目與總密碼子數(shù)目之比，即為最優(yōu)密碼子使用頻率（FOP）。最后，利用SPSS 18.0繪制ENC和GC3s之間的關(guān)系圖，并對(duì)密碼子組成與偏好性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 香蕉基因組的密碼子組成分析

從下載的原始數(shù)據(jù)中篩選獲得36242個(gè)高置信蛋白編碼基因CDS序列，平均長(zhǎng)度為1035 bp。分析結(jié)果（表1）顯示，CDS序列的GC含量為3.0%～75.8%，其中低于20.0%的僅13個(gè)序列，全基因組的GC含量為50.4%；同義密碼子第3位出現(xiàn)G或C的頻率為52.9%，比出現(xiàn)A或T的頻率高。同時(shí)，對(duì)密碼子第3位的堿基類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，C和G的出現(xiàn)頻率分別是33.6%和32.9%，而T和A的出現(xiàn)頻率分別為31.5%和26.2%。

2. 2 密碼子偏好性分析結(jié)果

對(duì)密碼子偏好性的評(píng)價(jià)有多個(gè)指標(biāo)，不同評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算方法及側(cè)重點(diǎn)各有不同。其中，ENC反映了基因編碼時(shí)對(duì)密碼子的選擇性強(qiáng)弱，其值介于20.0～ 61.0，ENC越小則基因表達(dá)對(duì)密碼子的使用偏好性越強(qiáng)（Wright，1990；Gupta et al.，2004）。當(dāng)ENC=20.0時(shí)表明一種氨基酸只使用某一個(gè)特定的密碼子；當(dāng)ENC= 61.0時(shí)則表明基因?qū)γ艽a子的選擇性不強(qiáng)，可將ENC= 35.0作為密碼子偏好性強(qiáng)弱的分界點(diǎn)（Wright，1990；Jiang et al.，2008）。本研究分析發(fā)現(xiàn)，香蕉基因組的ENC為20.0～61.0，在36242個(gè)高置信蛋白基因CDS中，有632個(gè)序列的ENC為20.0～35.0，約占總數(shù)的6.5%，有9070個(gè)序列的ENC為36.0～61.0，占總數(shù)的95.5%，僅有127個(gè)序列的ENC為61.0，占總數(shù)的1.3%。綜上所述，香蕉對(duì)密碼子的使用有偏好性，部分基因?qū)γ艽a子的使用具有很強(qiáng)的選擇性，也有部分基因?qū)γ艽a子無(wú)偏好性；基因組的平均ENC為50.7，方差為7.1，表明大多數(shù)蛋白編碼基因的密碼子使用偏好性較弱。

利用CodonW 1.4.4對(duì)36242個(gè)高置信蛋白基因進(jìn)行分析，并以.blk的文件形式保存便于后續(xù)RSCU的計(jì)算。RSCU是同義密碼子實(shí)際使用數(shù)目和使用期望均值間的比值（Sharp et al.，1986；Liu et al.，2004），直接反映密碼子使用偏性。當(dāng)RSCU=1時(shí)，表示密碼子使用是隨機(jī)的，無(wú)明顯的偏好性，當(dāng)RSCU>1或RSCU<1，則表示某個(gè)密碼子的使用頻率相對(duì)于其他同義密碼子更高或更低，存在使用偏好性（Sau et al.，2006）。香蕉基因組對(duì)所有氨基酸同義密碼子的偏好性、使用頻率等統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。RSCU值>1且第3位為A、T、C和G的密碼子數(shù)目分別占RSCU>1密碼子總數(shù)的18.7%、11.4%、39.1%和30.8%，其中第3位為C的密碼子數(shù)目最多，第3位為T(mén)的密碼子數(shù)目最少，表明香蕉基因編碼時(shí)偏好使用以C結(jié)尾的密碼子，較少使用以T結(jié)尾的密碼子。

CAI是指編碼區(qū)同義密碼子和密碼子最佳的使用匹配程度，其值介于0～1，且與基因表達(dá)水平相一致（Gupta et al.，2004）。不同長(zhǎng)度香蕉基因的ENC、GC3s和CAI 3個(gè)參數(shù)值如表3所示，基因的長(zhǎng)度或數(shù)目和ENC存在正相關(guān)，因此，基因編碼區(qū)越長(zhǎng)在編碼時(shí)隨機(jī)利用密碼子的概率越高。此外，CAI和GC3s也存在明顯的正相關(guān)，且當(dāng)基因編碼區(qū)長(zhǎng)度（L）為400～600 bp時(shí)，CAI和GC3s最大，表明在此長(zhǎng)度范圍的基因表達(dá)量最大，且偏好使用以G或C結(jié)尾的密碼子。

3 討論

隨著物種進(jìn)化和環(huán)境改變，為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境，各種生物不斷完善其自身的基因表達(dá)過(guò)程，致使同義密碼子的偏好性因物種而異，與自身的基因特征密切相關(guān)。因此，當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入到生物體內(nèi)，其表達(dá)過(guò)程受密碼子偏好性的影響，易發(fā)生甲基化，可能引起外源基因沉默或基因表達(dá)水平過(guò)低（Perlak et al.，1990）。而當(dāng)外源基因同生物體自身基因?qū)γ艽a子的使用偏好性相似時(shí)，外源基因更易表達(dá)。

本研究對(duì)香蕉密碼子的使用偏好性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，隨基因編碼區(qū)長(zhǎng)度的增加，密碼子的使用偏好性逐漸降低，與水稻（劉慶坡，2005）、大豆（張樂(lè)等，2011）和葡萄（續(xù)晨等，2012）等作物基因組密碼子的使用偏好性一致，但與大腸桿菌基因組密碼子的使用偏好性相反，即基因越長(zhǎng)密碼子的使用偏好性越大（侯卓成和楊寧，2002）。Moriyama和Poeell（1998）研究發(fā)現(xiàn)，在自然選擇的壓力下縮短表達(dá)量高的基因長(zhǎng)度對(duì)生物體有利，其原因是較長(zhǎng)的基因表達(dá)時(shí)需要消耗較多的能量。由此推測(cè)，基因編碼區(qū)長(zhǎng)度與密碼子使用偏好性的相關(guān)性與進(jìn)化地位有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)以G或C結(jié)尾的密碼子使用頻率最高，且在17個(gè)最優(yōu)密碼子中，以G或C結(jié)尾的最多（15個(gè)），表明香蕉基因組偏好使用G或C結(jié)尾的密碼子，與大豆（張樂(lè)等，2011）、葡萄（續(xù)晨等，2012）、草菇（蔣瑋等，2014）和赤芝（朱孝軒等，2014）等基因組密碼子的偏好性一致。由ENC和GC3s的散點(diǎn)圖可知，雖然大部分基因符合期望曲線(xiàn)，但也有部分基因偏離該曲線(xiàn)，間接表明除了核苷酸組成外，基因突變和自然選擇等因素也會(huì)影響基因表達(dá)對(duì)密碼子的偏好性選擇，而擬南芥的密碼子偏好主要受自然選擇的影響（Chiapello et al.，1998）。

4 結(jié)論

香蕉基因組中多數(shù)基因的密碼子使用偏好性較弱，但少部分基因具有強(qiáng)偏好性，偏好使用以G或C結(jié)尾的密碼子，且偏好性受到核苷酸組成、基因突變及自然選擇等因素的影響。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）