黨參毛狀根誘導(dǎo)條件研究

薛雯心 劉立業(yè) 袁金月 劉琪 魏鐵鎖 鄭彥杰 李秀霞

摘要[目的]研究黨參毛狀根的誘導(dǎo)條件。[方法]利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和A1476進行毛狀根誘導(dǎo)，探討發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體類型、菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)天數(shù)等因素對黨參毛狀根誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]3種發(fā)根農(nóng)桿菌中A4誘導(dǎo)率最高；莖段的誘導(dǎo)率最高；發(fā)根農(nóng)桿菌濃度在OD600為0.4時誘導(dǎo)效果較好；較佳侵染時間為5 min；共培養(yǎng)時間為2 d時誘導(dǎo)率較高；頭孢噻肟鈉濃度為300 mg/L時除菌效果較好。[結(jié)論]該試驗為大量生產(chǎn)毛狀根以及毛狀根的后續(xù)研究提供試驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞黨參；毛狀根；誘導(dǎo)條件；發(fā)根農(nóng)桿菌

中圖分類號S567.5+3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）10-0121-03

Study on the Induction Condition of Hairy Roots of Codonopsis pilosula

XUE Wenxin，LIU Liye，YUAN Jinyue，LI Xiuxia* et al

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi，Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] The research aimed to study the induction condition of hairy roots of Codonopsis pilosula.[Method] The hairy roots were induced by Agrobacterium rhizogenes strains of A4， C58C1 and A1476，the effects of Agrobacterium rhizogenes species， explants types， concentration of bacterium，infection time， cocultivation period on hairy roots inductivity of Codonopsis pilosula were discussed.[Result] Among the three Agrobacterium rhizogenes，the induction rate of A4 was the highest.The induction rate of stem was the highest.The inductivity at OD600 0.4 was better performing.Better infection time was five minutes.The inductivity was higher when the time of cocultivation was two days. When the concentration of cefotaxime sodium was 300 mg/L， the sterilization effect was better.[Conclusion] This test provides experimental basis for the mass production of hairy roots and followup study of the hairy roots.

Key wordsCodonopsis pilosula；Hairy roots；Inducement condition；Agrobacterium rhizogenes

黨參[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]屬桔?？浦参颷1]，多年生草質(zhì)藤本，以干燥根入藥[2]，為我國常用大宗藥材之一[3]。我國是黨參屬藥材的主要產(chǎn)區(qū)和資源分布中心，全世界有黨參屬植物40 多種，我國就有39 種之多[4]，主產(chǎn)于山西、陜西、甘肅等地[5]。幾十年來，在原有研究基礎(chǔ)上，國內(nèi)外對黨參化學(xué)成分進行了深入研究[6]。黨參屬藥用植物所含化學(xué)成分相似，主要有聚炔類、萜及三萜皂苷類、苯丙素類、茲醇、生物堿、倍半萜內(nèi)酯、香豆素等多種類型的化學(xué)成分。從黨參中還分離得到多糖類、甾類、揮發(fā)油成分、多種氨基酸和微量元素[7]。

現(xiàn)代藥理研究表明，黨參具有調(diào)節(jié)血糖、促進造血、降壓、抗缺氧、耐疲勞、增強機體免疫力、調(diào)節(jié)胃腸收縮及抗?jié)兊榷嘀刈饔肹8]，并常作為人參的替代品[9]。

發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是一種根瘤菌科的革蘭氏陰性菌[10]，其侵染植物后，會使植物產(chǎn)生大量的不定根，這些不定根不斷分支，表現(xiàn)出毛狀，稱之為毛狀根（Hairy Roots）[11]。毛狀根具有遺傳性能穩(wěn)定、生長速度快、能夠合成該植物特征的次生代謝產(chǎn)物等特點。到1982年才報道發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物產(chǎn)生發(fā)狀根的機理，現(xiàn)已獲得了300多種植物的毛狀根體系[12]，如王不留行[13]、南藥巴戟天[14]、太子參[15]、新疆紫草[16]等均有研究報道。毛狀根生產(chǎn)藥用植物有效成分已經(jīng)顯示出較好的應(yīng)用潛力，必將帶來可觀的社會效益和經(jīng)濟效益。因此，研究黨參毛狀根誘導(dǎo)及后續(xù)的大量培養(yǎng)等問題具有重要意義和廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。筆者利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和A1476進行毛狀根誘導(dǎo)，探討發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體類型、菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)天數(shù)等因素對黨參毛狀根誘導(dǎo)的影響。

1材料與方法

1.1材料

外植體取自佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室培育的黨參無菌苗，發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和 A1476由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院經(jīng)濟植物研究所提供。 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS，pH 5.8；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：1/2MS+乙酰丁香酮（AS，100 mg/L）；除菌培養(yǎng)基：MS+300 mg/L頭孢噻肟鈉，pH 5.8；菌種活化培養(yǎng)基：YEB培養(yǎng)基，pH 7.0；毛狀根繼代培養(yǎng)基：1/2MS，pH 5.8。

1.2設(shè)備

752N凌光紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）；

DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；

恒溫振蕩器（中外合資深圳天南海北有限公司）；

150G振蕩培養(yǎng)箱（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；

SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；

JA1003電子天平（上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司）；

SZ-97自動三重水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3試驗方法

1.3.1無菌苗的培養(yǎng)。

將種子去掉邊緣種翅，在自來水下沖洗30 min，75%乙醇消毒20 s，2%次氯酸鈉溶液滅菌20 min，無菌水清洗5～6次，用無菌濾紙吸去多余水分，然后在無菌工作臺上接種到MS培養(yǎng)基中，最后放在培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度2 000～2 500 lx，光照時間12 h/d。

1.3.2菌種的活化。

挑取保存在-80 ℃滅菌甘油中的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4、C58C1和A1476，于YEB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min振蕩暗培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的菌液用于接種感染黨參外植體。

1.3.3外植體的轉(zhuǎn)化方法。

1.3.3.1外植體的預(yù)培養(yǎng)。

選取生長健壯的無菌苗，在超凈工作臺上，將黨參葉片切成0.5 cm2的小塊，葉柄和莖段切成長為0.5 cm的小段，接種于MS培養(yǎng)基中，（25±1）℃暗處培養(yǎng)2 d。

1.3.3.2侵染與共培養(yǎng)。

將外植體浸入已活化好的菌液中5 min，侵染結(jié)束后取出外植體，先用無菌濾紙吸干菌液，然后接種到含乙酰丁香酮（100 μmol/L）的固體1/2MS培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)2 d。

1.3.3.3

毛狀根誘導(dǎo)及除菌培養(yǎng)。

共培養(yǎng)后，將外植體用無菌水清洗5次，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，然后轉(zhuǎn)接至含有300 mg/L頭孢噻肟鈉的除菌培養(yǎng)基上進行除菌培養(yǎng)，每隔7 d繼代1次，經(jīng)反復(fù)除菌至培養(yǎng)基看不到菌斑。將長到2 cm左右的毛狀根剪下，轉(zhuǎn)入到含有IAA（1.0 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。

1.3.4各試驗條件梯度的設(shè)置。

試驗所用發(fā)根農(nóng)桿菌種類為A4、C58C1和A1476；外植體的種類為莖段、葉片、葉柄；菌液濃度OD600的值設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8；侵染時間設(shè)置為5、10、20、30 min；共培養(yǎng)時間設(shè)置為1、2、3、4、5 d；頭孢噻肟鈉濃度設(shè)置為200、300、400、500 mg/L。

2結(jié)果與分析

2.1不同菌種的發(fā)根農(nóng)桿菌對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

試驗結(jié)果表明（表1），A4和C58C1這2種菌株均能誘導(dǎo)出毛狀根，發(fā)根農(nóng)桿菌A1476沒有成功誘導(dǎo)出毛狀根。A4和C58C1菌株對黨參葉片的誘導(dǎo)率分別為56%和16%，可見A4和C58C1這2種菌株對黨參毛狀根的誘導(dǎo)能力有顯著的差別（圖1），A4的誘導(dǎo)能力明顯大于C58C1。

表2.2不同外植體對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

以A4菌株作為試驗菌株，結(jié)果表明（表2），外植體的類型對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率存在一定影響，在除菌培養(yǎng)基中褐化最嚴重的是葉柄，葉片其次，莖段相對較好。莖段的毛狀根誘導(dǎo)率為48%，誘導(dǎo)率高，生根早；葉片誘導(dǎo)率次之，為30%；葉柄誘導(dǎo)率最低，為4%。通過A4菌液的侵染，莖段、葉片和葉柄都可以長出毛狀根，但不同類型的受體每一外植體生根的長度和數(shù)量也是不同的。因此，莖段為誘導(dǎo)毛狀根的最佳外植體。

2.3菌液濃度對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

以A4菌株作為試驗菌株，結(jié)果表明（表3），菌液濃度不同毛狀根的誘導(dǎo)率也不同。菌液濃度過高或過低均不利于提升轉(zhuǎn)化頻率，菌液濃度OD600為0.1～0.8，毛狀根的誘導(dǎo)率隨著菌液濃度的增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢。在菌液濃度OD600為0.4時，毛狀根的誘導(dǎo)率最高，為52%。當(dāng)菌液濃度OD600為0.8時，由于菌液濃度過高，導(dǎo)致外植體褐化嚴重，部分外植體已喪失生根能力。因此，誘導(dǎo)毛狀根的最佳菌液濃度OD600是0.4。

2.4侵染時間對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

由表4可知，侵染時間的長短對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有一定的影響，隨著侵染時間的延長，誘導(dǎo)率反而降低。其中侵染時間為5 min時，誘導(dǎo)率最高，為54%；當(dāng)侵染時間為10 min時，誘導(dǎo)率為18%，與侵染5 min的誘導(dǎo)率差別較大，誘導(dǎo)率的降低是因為侵染時間過長使后期菌株生長迅速，造成除菌困難；當(dāng)侵染時間為20 min時，多數(shù)外植體失去生命力而喪失誘發(fā)毛狀根的能力；當(dāng)侵染時間為30 min時，外植體褐化非常嚴重，24 h后已完全喪失生命力，生根率為0。表明當(dāng)侵染時間為5 min時侵染的效果最佳。

2.5侵染后共培養(yǎng)時間對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

以A4菌株作為試驗菌株，結(jié)果表明（表5），共培養(yǎng)時間對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有顯著的影響。共培養(yǎng)時間為2 d時，誘導(dǎo)率最高，為50%；共培養(yǎng)時間為1和3 d時誘導(dǎo)率相差不大，分別為36%和38%；共培養(yǎng)時間為4 d時，誘導(dǎo)率下降，為22%；當(dāng)共培養(yǎng)時間為5 d時，由于共培養(yǎng)時間過長，外植體周圍長滿了農(nóng)桿菌，造成除菌困難，誘導(dǎo)率僅為2%。因此，誘導(dǎo)毛狀根的最佳共培養(yǎng)時間為2 d。

3小結(jié)與討論

不同的植物對不同發(fā)根農(nóng)桿菌的敏感程度是不同的。該試驗選取了A4、C58C1和A1476 3種發(fā)根農(nóng)桿菌作為侵染菌種，試驗結(jié)果表明，3種發(fā)根農(nóng)桿菌僅A4和C58C1能使黨參誘導(dǎo)出毛狀根，其中A4誘導(dǎo)率較高。說明不同菌株具有不同的致根能力，可能是A4和C58C1對黨參比較敏感。

選擇合適的外植體是建立誘導(dǎo)體系的重要任務(wù)，以往研究表明，子葉、莖、葉及果實是使用較多的外植體，不同的植物最適外植體也存在較明顯的差異[17]。此試驗選取了黨參幼苗的莖段、葉片和葉柄作為轉(zhuǎn)化材料。試驗中觀察到，用莖段作為感染材料誘導(dǎo)率最高，葉片的誘導(dǎo)率其次，葉柄的誘導(dǎo)率最低。因此，莖段為誘導(dǎo)毛狀根的最佳外植體。

菌液濃度對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有一定的影響。菌液濃度OD600為0.1～0.3時，誘導(dǎo)率隨濃度呈正相關(guān)，菌液濃度OD600為0.8時，傷口處的細胞褐化非常嚴重，很快就失去了生命力。試驗結(jié)果表明，菌液濃度以O(shè)D600為0.4誘導(dǎo)率最高。除了菌液濃度之外，侵染時間也影響毛狀根的誘導(dǎo)率。在5 min時誘導(dǎo)率最高，10～20 min誘導(dǎo)率逐漸降低，30 min時生根率為0，因為侵染時間過長使后期菌株生長迅速，造成除菌困難，多數(shù)外植體失去生命力而喪失誘發(fā)毛狀根的能力。表明誘導(dǎo)毛狀根最佳的侵染時間為5 min。

共培養(yǎng)時間是一個重要的因素。共培養(yǎng)時間過長時，外植體周圍長滿了農(nóng)桿菌，造成除菌困難，最終導(dǎo)致外植體褐化嚴重而喪失生根能力。如果共培養(yǎng)時間不足，則不能完成T-DNA轉(zhuǎn)移與整合，毛狀根的轉(zhuǎn)化不能實現(xiàn)。因此，較適宜的共培養(yǎng)時間為2 d，這樣既有效地提高了轉(zhuǎn)化率又不會讓農(nóng)桿菌大量繁殖，而且毛狀根多分枝，生長十分旺盛。

試驗結(jié)果表明，在除菌培養(yǎng)基中添加不同濃度的頭孢噻肟鈉對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有顯著的影響。合適的頭孢噻肟鈉濃度不僅能起到很好的抑菌效果，而且對毛狀根的生長影響也較小。當(dāng)頭孢噻肟鈉濃度為200 mg/L時，培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)；當(dāng)頭孢噻肟鈉濃度為500 mg/L時，毛狀根完全不能生長；當(dāng)頭孢噻肟鈉濃度為300 mg/L時，毛狀根的生長情況最好。因此，選擇300 mg/L頭孢噻肟鈉作為除菌培養(yǎng)基更合適。

45卷10期薛雯心等黨參毛狀根誘導(dǎo)條件研究

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