利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定海南南瓜病毒種類(lèi)

車(chē)海彥 曹學(xué)仁 劉勇 羅大全

摘 要 2016年在海南樂(lè)東、昌江、澄邁、?？?、文昌、儋州等地采集疑似被病毒病感染的南瓜葉片樣品6個(gè)，將樣品合并，采用小RNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)上述混合樣本的病毒種類(lèi)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)樣本中含有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papara ringspot virus，PRSV）、黃瓜綠斑駁病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和中國(guó)南瓜曲葉病毒（Squash leaf curl China virus，SLCCNV），通過(guò)PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證了深度測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。SLCCNV在4個(gè)樣品中存在，P-CJ分離物的DNA-A和DNA-B組分全長(zhǎng)分別為2 735 bp（登錄號(hào)為MF062251）和2 722 bp（登錄號(hào)為MF062252）。DNA-A和DNA-B組分均與SLCCNV分離物的同源性最高，同源性分別為89.2%～99.3%和79.1%～98.8%；P-CJ分離物與從中國(guó)植物樣品中分離到的SLCCNV聚在同一進(jìn)化分支上。上述研究結(jié)果表明，P-CJ是SLCCNV的一個(gè)分離物。

關(guān)鍵詞 小RNA深度測(cè)序；海南；南瓜病毒病

中圖分類(lèi)號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In 2016， 6 suspected virus-infected pumpkin leaf samples were collected from Ledong county， Changjiang county， Chengmai county， Haikou city， Wenchang county and Danzhou city， Hainan province. The above samples were pooled and analyze by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus（CMV）， Papaya ringspot virus（PRSV）， Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）and Squash leaf curl China virus（SLCCNV）were detected from the pooled sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus-specific PCR from above 6 samples. SLCCNV was detected from 4 samples， the virus isolate P-CJ was selected for further sequence analysis. The complete sequence of the DNA-A and DNA-B was determined to be 2 735 bp（MF062251）and 2 722 bp（MF062252）respectively. The DNA-A was most closely related to isolates of SLCCNV with 89.2%-99.3% nucleotide sequence identities. The DNA-B was most closely related to isolates of SLCCNV with 79.1%-98.8% nucleotide sequence identities. Phylogenetic analysis revealed that P-CJ isolate clustered with isolates of SLCCNV from China. These results confirmed this virus was an isolate of SLCCNV.

Key words Small RNA deep sequencing； Hainan； Pumpkin virus disease

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.018

中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata）又名倭瓜，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita Linn.），在中國(guó)南北方廣泛種植，是海南冬季重要的北運(yùn)蔬菜之一。病毒病在南瓜種植區(qū)幾乎都有發(fā)生，目前中國(guó)從南瓜上鑒定出的病毒主要有：黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）、煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）、黃瓜綠斑駁病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、中國(guó)南瓜曲葉病毒（Squash leaf curl China virus，SLCCNV）等[1-8]。海南地處熱帶，獨(dú)特的氣候條件及南瓜種植面積的增加，導(dǎo)致病毒病發(fā)生日益嚴(yán)重。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病毒病在海南南瓜種植區(qū)發(fā)生普遍，部分田塊在生長(zhǎng)中后期尤為嚴(yán)重。近年來(lái)小RNA深度測(cè)序技術(shù)已被應(yīng)用于病毒和類(lèi)病毒的鑒定和檢測(cè)中，該技術(shù)是一種廣譜的檢測(cè)病毒的手段，與傳統(tǒng)的ELISA和 PCR方法不同，不需要事先估計(jì)病毒的類(lèi)型，無(wú)論是DNA病毒、RNA病毒還是類(lèi)病毒，都能在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中被檢測(cè)到，科研人員利用該技術(shù)在植物和昆蟲(chóng)上鑒定了多種新的病毒[9-11]。目前還未見(jiàn)應(yīng)用該技術(shù)對(duì)海南南瓜病毒種類(lèi)進(jìn)行鑒定的報(bào)道。本研究結(jié)合小RNA深度測(cè)序技術(shù)和PCR方法研究海南南瓜主要病毒種類(lèi)，為南瓜病毒病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年1月在海南樂(lè)東、昌江、澄邁、?？凇⑽牟唾僦莶杉伤聘腥静《静〉哪瞎先~片樣本共6份，詳見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 南瓜葉片小RNA深度測(cè)序 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序：將表1中6個(gè)不同癥狀類(lèi)型的樣品合并，建成1個(gè)cDNA文庫(kù)池（表1）。葉片總RNA提取采用TRIzolR Reagent（Invitrogen），文庫(kù)構(gòu)建采用TruseqTM Small RNA sample prep Kit（Illumina），文庫(kù)回收采用6% Novex TBE PAGE gel，1.0 mm，10 well（Invitrogen），用TBS380 Picogreen微型熒光計(jì)進(jìn)行定量，在TruSeq SR Cluster Kit v3-cbot-HS上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后在Hiseq4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序，小RNA深度測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

生物信息學(xué)分析：利用Fastx-Toolkit軟件對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，獲得clean small RNA序列，從上述序列中挑選高質(zhì)量序列進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，將質(zhì)控后的序列進(jìn)行拼接，得到contigs，將上述contigs在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn和BLASTx比對(duì)，得到可能存在的病毒序列，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并注釋。

1.2.2 田間樣品的PCR檢測(cè)驗(yàn)證 葉片總DNA和總RNA提?。悍謩e采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒和植物總RNA提取試劑盒，提取方法詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。

cDNA合成：以提取的葉片總RNA為模板，使用TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

檢測(cè)引物：PRSV、CMV、CGMMV和粉虱傳雙生病毒（whitefly transmitted geminiviruses，WTGs）的檢測(cè)引物序列和反應(yīng)條件見(jiàn)表2。

PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序：將PCR擴(kuò)增的特異性片段產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T Simple 載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli Competent Cell DH5α中，利用PCR篩選陽(yáng)性克隆。序列測(cè)定委托上海立菲生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 中國(guó)南瓜曲葉病毒海南分離物的全基因組測(cè)序分析 根據(jù)小RNA深度測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)2對(duì)背向引物SLCCNV-A1/SLCCNV-A2和SLCCNV-B1/ SLCCNV-B2（表2），分別用于擴(kuò)增昌江十月田鎮(zhèn)P-CJ樣品中SLCCNV的DNA-A和DNA-B組分，PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序參照1.2.2。

采用NCBI中的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行相似性查找。采用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行序列比較。通過(guò)MEGA6.06軟件的Maximum likelihood法構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)，bootstrap replications值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜病毒病田間主要癥狀表現(xiàn)

海南南瓜病毒病田間主要表現(xiàn)為斑駁、曲葉、褪綠、皺縮、葉肉組織退化、節(jié)間縮短等癥狀，感病植株經(jīng)常同時(shí)表現(xiàn)幾種癥狀。6份樣品的田間癥狀見(jiàn)圖1。

2.2 感病南瓜葉片小RNA深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)的病毒

南瓜葉片樣本小RNA深度測(cè)序共產(chǎn)生24 450 144條reads，經(jīng)質(zhì)量控制之后得到21 442 277 clean reads。提取長(zhǎng)度為18～32 nt的序列進(jìn)行拼接組裝，得到7 036個(gè)contigs，268個(gè)contigs可以比對(duì)到4種病毒序列，其中135個(gè)contigs可以比對(duì)到PRSV序列，同源性在83.12%～100.00%；61個(gè)contigs可以比對(duì)到SLCCNV序列，同源性在90.77%～100.00%；42個(gè)contigs可以比對(duì)到CMV序列，同源性在80.00%～100.00%；30個(gè)contigs可以比對(duì)到CGMMV序列，同源性在79.00%～100.00%。

2.3 田間樣品的PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證小RNA深度測(cè)序結(jié)果的可靠性，利用PRSV、CGMMV、CMV和WTGs的特異性引物（表2）對(duì)采集的6個(gè)樣本進(jìn)行了PCR檢測(cè)，擴(kuò)增到與預(yù)期大小一致的特異性條帶（圖2），對(duì)上述特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，PRSV在P-CM和P-HK 2個(gè)樣品中存在，GenBank登錄號(hào)分別為MF772332，MF772333；CGMMV在P-CM，P-HK，P-WC和P-DZ 4個(gè)樣品中存在，GenBank登錄號(hào)分別為MF772328，MF772329，MF772330，MF772331；CMV在所有檢測(cè)的6個(gè)樣品P-LD，P-CJ，P-CM，P-HK，P-WC，P-DZ中均存在，GenBank登錄號(hào)分別為MF772322，MF772323，MF772324，MF772325，MF772326，MF772327；WTGs在P-CJ，P-CM，P-HK和P-WC 4個(gè)樣品中存在，GenBank登錄號(hào)分別為MF772318，MF772319，MF772320，MF772321。說(shuō)明所采集的樣品中確實(shí)含有PRSV、CMV、CGMMV和WTGs，證實(shí)了小RNA深度測(cè)序結(jié)果的可靠性。

2.4 中國(guó)南瓜曲葉病毒海南分離物的全基因組測(cè)序分析

經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，WTGs在4個(gè)樣品中存在，選取P-CJ樣品（昌江）進(jìn)行DNA-A和DNA-B全序列測(cè)定，經(jīng)擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，獲得P-CJ DNA-A和DNA-B組分全長(zhǎng)分別為2 735 bp（登錄號(hào)為MF062251）和2 722 bp（登錄號(hào)為MF062252）。DNA-A病毒鏈編碼AV1和AV2共2個(gè)ORF，互補(bǔ)鏈編碼AC1～AC5共5個(gè)ORF；DNA-B病毒鏈和互補(bǔ)鏈分別編碼BV1和BC1 2個(gè)ORF，ORF在基因組中的位置及編碼的氨基酸數(shù)量詳見(jiàn)表3。

經(jīng)Blast檢索發(fā)現(xiàn)，P-CJ樣品DNA-A和DNA-B與SLCCNV分離物的同源性最高，分別在89.2%～99.3%和79.1%～98.8%。為進(jìn)一步明確P-CJ與NCBI上所有已公布全基因組的SLCCNV的進(jìn)化關(guān)系，基于DNA-A全序列構(gòu)建了系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)（圖3），Tomoato pseudo-curly top virus（X84735）為外組，P-CJ與中國(guó)、越南、泰國(guó)、馬拉西亞、東帝汶、菲律賓樣品聚集在同一大的分支上，而印度、巴基斯坦的樣品聚集在另一分支上?；贒NA-B全序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)中（圖4），Abutilon mosaic Bolivia virus（HM585446）為外組，P-CJ與中國(guó)、越南的樣品聚集在同一分支上，而印度、巴基斯坦的樣品聚集在另一分支上。上述結(jié)果說(shuō)明，從海南昌江南瓜上分離到的WTG是SLCCNV的一個(gè)分離物。

3 討論

病毒病是中國(guó)南瓜生產(chǎn)上的一類(lèi)重要病害，本研究利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)，從6個(gè)混合樣品建成的cDNA文庫(kù)池中測(cè)得CMV、PRSV、CGMMV和SLCCNV等4種病毒，這些病毒分屬4個(gè)科，即植物桿狀病毒科（Virgaviridae）、馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）、雙生病毒科（Geminiviridae）和雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）。經(jīng)PCR驗(yàn)證，除P-LD樣品僅檢測(cè)到CMV存在外，其它5個(gè)樣品中均檢測(cè)到2種以上病毒存在，這與重慶、云南和黑龍江等地報(bào)道的一致[2-3]，多種病毒同時(shí)侵染同一株南瓜，可能是南瓜生產(chǎn)上病毒病害發(fā)生嚴(yán)重的主要原因。采用ELISA方法，筆者在2013～2014年采集的180份海南南瓜樣本中檢測(cè)到TMV、CMV和CGMMV等3種病毒[15]。本研究中除檢測(cè)到CMV和CGMMV外，還檢測(cè)到PRSV和SLCCNV，但未檢測(cè)到TMV，可能是由于小RNA深度測(cè)序中僅用了6個(gè)樣品的混合樣進(jìn)行測(cè)序，樣品量少?？紤]到小RNA深度測(cè)序的成本，該方法不適合田間大規(guī)模病毒種類(lèi)普查，下一步需要將ELISA、PCR和小RNA深度測(cè)序技術(shù)三者相結(jié)合，研究海南南瓜上各種病毒的侵染時(shí)期及其在不同地區(qū)的分布情況等。

根據(jù)NCBI和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，目前中國(guó)南瓜曲葉病毒自然寄主有南瓜、甜瓜、西葫蘆、黃瓜、苦瓜、冬瓜、佛手瓜等葫蘆科作物，主要分布在亞洲的中國(guó)（廣東、廣西、海南）、越南、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、菲律賓、東帝汶、印度、巴基斯坦等國(guó)家[16-25]。從構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)（圖3、圖4）可以明顯看出，SLCCNV明顯分為2個(gè)大的分支，印度和巴基斯坦的分離物聚集在一個(gè)分支上，其它國(guó)家的聚集在另外一個(gè)分支，海南不同地區(qū)的南瓜、甜瓜上的所有分離物均聚集在同一小分支，廣東和廣西的分離物聚集在另一小分支。說(shuō)明SLCCNV不同分離物存在明顯的地域性分布。

參考文獻(xiàn)

[1] 李曉穎， 江蓓蓓， 王 迅， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒山東南瓜分離物外殼蛋白基因序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（7）： 1-4.

[2] 青 玲， 包凌云， 周常勇， 等. 重慶南瓜病毒病病原ELISA檢測(cè)及CMV變異分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2010， 37（3）： 405-412.

[3] 楊國(guó)慧， 張仲凱， 崔崇士. 云南、 黑龍江兩省南瓜主要病毒病原種類(lèi)鑒定[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 38（1）： 23-26.

[4] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染觀(guān)賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定[J]. 植物檢疫， 2005， 19（4）： 198-200.

[5] 趙榮樂(lè). 感染新疆甜瓜的南瓜花葉病毒的鑒定[J]. 喀什師范學(xué)院學(xué)， 2004， 25（3）： 46-50.

[6] 陳潔云， 柴立紅， 陳集雙， 等. 侵染南瓜的小西葫蘆黃化花葉病毒的分離與鑒定[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）， 2003， 29（5）： 71-76.

[7] 洪益國(guó)， 蔡健和， 王小鳳， 等. 中國(guó)南瓜曲葉病毒： 一個(gè)雙生病毒新種[J]. 中國(guó)科學(xué)（B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué)）， 1994， 24（6）： 608-613.

[8] 殷勤燕， 楊懷義， 王寰宇， 等. 中國(guó)南瓜曲葉病毒DNA A的克隆及其全序列[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2001， 41（1）： 31-34.

[9] 錢(qián)亞娟， 徐 毅， 周 琦， 等. 利用深度測(cè)序技術(shù)發(fā)掘植物病毒資源[J]. 中國(guó)科學(xué)： 生命科學(xué)， 2014， 44（4）： 351-363.

[10] 蘇 秀， 徐 毅， 陳 莎， 等. 利用小RNA深度測(cè)序和組裝技術(shù)鑒定紫藤花葉病病原[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2015（1）： 88-92.

[11] 馮 耿， 辛 敏， 曹孟籍， 等. 深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)貴陽(yáng)發(fā)生的辣椒病毒病由多種病毒復(fù)合侵染所致[J/OL]. 植物病理學(xué)報(bào)（網(wǎng)絡(luò)出版），2017： 1-11.

[12] 劉雪建. 浙江省和江西省蔬菜病毒鑒定與變異研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2015.

[13] 席德慧， 林宏輝， 向本春. 黃瓜花葉病毒2個(gè)分離物的亞組鑒定及株系分化研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2006， 36（3）： 232-237.

[14] 謝 艷， 張仲凱， 李正和， 等. 粉虱傳雙生病毒的TAS-ELISA及PCR快速檢測(cè)[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2002， 32（2）： 182-186.

[15] 車(chē)海彥， 曹學(xué)仁， 劉培培， 等. 海南省冬季蔬菜病毒病發(fā)生情況調(diào)查[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 37（1）： 71-74.

[16] Revill P A， Ha C V， Porchun S C， et al. The complete nucleotide sequence of two distinct geminiviruses infecting cucurbits in Vietnam[J]. Archives of Virology， 2003， 148（8）： 1 523-1 541.

[17] Singh A K， Mishra K K， Chattopadhyay B， et al. Biological and molecular characterization of a begomovirus associated with yellow mosaic vein mosaic disease of pumpkin from Northern India[J]. Virus Genes， 2009， 39（3）： 359-370.

[18] Ito T， Ogawa T， Samretwanich K， et al. Yellow leaf curl disease of pumpkin in Thailand is associated with Squash leaf curl China virus[J]. Plant Pathology， 2008， 57（4）： 766-766.

[19] Sopid S. The complete nucleotide sequence of Squash leaf curl China virus-[Wax gourd] and its phylogenetic relationship to other geminiviruses[J]. Scienceasia， 2009， 35（2）： 131-136.

[20] Tahir M， Haider M S， Briddon R W. First report of Squash leaf curl China virus， in Pakistan[J]. Australasian Plant Disease Notes， 2010， 5（1）： 21-24.

[21] Saritha R K， Bag T K， M. Loganathan M， et al. First report of Squash leaf curl china virus causing mosaic symptoms on summer squash （Cucurbita pepo） grown in Varanasi district of India[J]. Archives of Phytopathology and Plant Protection， 2011， 44（2）： 179-185.

[22]吳會(huì)杰. 中國(guó)南瓜曲葉病毒侵染甜瓜在國(guó)內(nèi)的首次發(fā)現(xiàn)及其致病性[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì). 中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集， 2012： 203.

[23] 林韶東， 車(chē)海彥. 海南樂(lè)東哈密瓜粉虱傳雙生病毒的PCR檢測(cè)[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2013， 4（2）： 124-128.

[24] Riyaz S U M， Deepan S， Jesse M I， et al. New record of bipartite Squash leaf curl China virus （SLCCNV） and Croton yellow vein mosaic beta satellite associated with yellow vein disease of ash gourd in India[J]. New Disease Reports， 2015： 31.

[25] Nagendran K， Mohankumar S， Aravintharaj R， et al. The occurrence and distribution of major viruses infecting cucurbits in Tamil Nadu state， India[J]. Crop Protection， 2017， 99： 10-16.