高活性納豆激酶工藝改進研究

張浩 王家林

摘要[目的]優(yōu)化高活性納豆激酶的納豆生產(chǎn)工藝條件。[方法]從市售納豆產(chǎn)品中分離篩選出高活性的菌株作為試驗菌株，采用固態(tài)發(fā)酵的方法制備納豆，對影響納豆激酶產(chǎn)量的主要因素浸泡時間、接種量、發(fā)酵時間等進行考察，研究高活性納豆激酶的工藝條件。[結(jié)果]利用對甲基苯磺酰L精氨酸甲酯（TAME）法測定納豆激酶活性，確定最佳納豆激酶酶活的納豆生產(chǎn)工藝條件為浸泡時間8 h、接種量10%、發(fā)酵時間48 h。[結(jié)論]該研究可為高活性納豆激酶的生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞納豆；納豆激酶；活性測定；工藝優(yōu)化

中圖分類號TQ925文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0093-02

Study on the Improvement of High Activity Natto Kinase

ZHANG Hao，WANG Jialin（Biological Engineering Lab of Qingdao University of Science and Technology，Qingdao，Shandong 266042）

Abstract[Objective] To optimize the process conditions of high activity natto kinase.[Method]Natto was isolated from commercial natto products and used as the experimental strain.Natto was prepared by solidstate fermentation.The process conditions of high activity natto kinase were studied.The main factors affecting the yield of natto kinase were as follows：immersion time，inoculation amount and fermentation time.[Result]The activity of natto kinase was determined by TAME method.The optimum natto kinase production process conditions were determined as 8 h soaking time，10% inoculation amount，48 h fermentation time.[Conclusion] The study can provide reference for production of high activity natto kinase.

Key wordsNatto；Natto kinase；Activity determination；Process optimization

納豆是經(jīng)過蒸煮的大豆在納豆芽孢桿菌的發(fā)酵作用下產(chǎn)生的發(fā)酵食品[1]。納豆含有多種生理活性物質(zhì)，具有擴張血管、溶解血栓、促進血液循環(huán)、抗癌、抗菌、抗氧化、延緩衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松、改善腸道環(huán)境等生理功能。納豆激酶是由納豆芽孢桿菌分泌的具有溶栓作用的堿性絲氨酸蛋白酶[2]，是由275個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，屬于胞外酶，其相對分子質(zhì)量不大，具有溶解血栓的作用，并且在人體內(nèi)作用迅速、半衰期短，因此近年來受到世界各國醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

該試驗是在成品納豆中提取納豆芽孢桿菌，經(jīng)過逐級放大培養(yǎng)后接種到高溫蒸汽滅菌的黃豆中，通過改變浸泡時間、接種量、發(fā)酵時間、后熟時間等條件進行發(fā)酵培養(yǎng)。將納豆碾碎后加生理鹽水溶解，通過冷凍離心保留上清液，再經(jīng)過2次硫酸銨沉淀分離提純得到納豆激酶粗酶，再利用pH 6.5的磷酸緩沖液溶解得到粗酶液[3]。利用對甲基苯磺酰L精氨酸甲酯（TAME）法測定納豆激酶活性，確定最佳納豆激酶酶活的納豆生產(chǎn)工藝條件。

1材料與方法

1.1材料

大豆，海琴利群超市購買；芽孢桿菌[4]。主要儀器：T6紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-18SI不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子調(diào)溫萬用電爐等。

1.2方法該試驗以TAME法測定納豆激酶的活性，納豆激酶對精氨酸羧端肽有較強的切割作用，因此以TAME為底物，在一定條件下納豆激酶將TAME切割為對甲基苯磺酰L精氨酸和甲醇，高錳酸鉀具有強氧化性，可以將甲醇氧化為甲醛，甲醛再與變色酸在沸水浴中發(fā)生顯色反應(yīng)，生成藍紫色復(fù)合物[5]。該復(fù)合物顏色穩(wěn)定，在574 nm處有最大的吸光度，因此可以作為常規(guī)檢測納豆激酶酶活的方法。

1.2.1大豆浸泡時間對納豆激酶酶活的影響。

取4個試劑瓶，分別加入10 g大豆， 按照豆水比為1∶2（g∶mL）的比例加入蒸餾水，蓋上瓶塞進行浸泡并計時，浸泡時間依次為6、8、10、12 h；浸泡完成后進行115 ℃高溫滅菌30 min；按照6%的接種量依次接種芽孢桿菌， 接種完后將瓶口封好并在外部附上一層保鮮膜防止其在生化培養(yǎng)箱中水分蒸發(fā)，放入生化培養(yǎng)箱中39 ℃發(fā)酵48 h[6]，然后取出放入冰箱4 ℃保鮮層后熟24 h；之后提取出納豆激酶[7]，采用TAME法測定其活性。

1.2.2發(fā)酵接種量對納豆激酶酶活的影響。

取6個試劑瓶，分別加入10 g大豆， 按照豆水比為1∶2（g∶mL）的比例加入蒸餾水，蓋上瓶塞進行浸泡并計時，浸泡時間為10 h；浸泡完成后進行115 ℃高溫滅菌30 min；按照2%、4%、6%、8%、10%、12%的接種量依次接種芽孢桿菌，接種完后將瓶口封好并在外部附上一層保鮮膜防止其在生化培養(yǎng)箱中水分蒸發(fā)，放入生化培養(yǎng)箱中39 ℃發(fā)酵48 h[6]，然后取出放入冰箱4 ℃保鮮層后熟24 h；之后提取出納豆激酶，采用TAME法測定其活性。

1.2.3發(fā)酵時間對納豆激酶酶活的影響。

取4個試劑瓶，分別加入10 g大豆， 按照豆水比采用1∶2（g∶mL）加入蒸餾水，蓋上瓶塞進行浸泡并計時，浸泡時間為10 h；浸泡完成后進行115 ℃高溫滅菌30 min；按照6%的接種量依次接種芽孢桿菌，接種完后將瓶口封好并在外部附上一層保鮮膜防止在生化培養(yǎng)箱中水分蒸發(fā)，放入生化培養(yǎng)箱中39 ℃發(fā)酵時間依次為24、36、48、60 h，然后取出放入冰箱4 ℃保鮮層后熟24 h；之后提取出納豆激酶，采用TAME法測定其活性。

2結(jié)果與分析

2.1不同大豆浸泡時間對發(fā)酵酶活的影響

由圖1可知，隨著浸泡時間的增加，檢測到的吸光度呈先增加后降低的趨勢。這是由于浸泡時間短，大豆吸水不充分，發(fā)酵過程中水分不足，導(dǎo)致拉絲物質(zhì)少且黏性較差，出現(xiàn)各部分傳質(zhì)不均勻的現(xiàn)象，限制了納豆菌的生長繁殖；當(dāng)浸泡時間過長，大豆吸水膨脹，發(fā)酵過程中得不到足夠的氧氣，也會影響納豆激酶的酶活。因此選擇浸泡時間為8 h時作為最佳工藝控制點。

物質(zhì)，并且氧氣量不足?？紤]到營養(yǎng)成分的利用率，因此選擇接種量10%作為最佳工藝點（前提是菌群密度為1.93×107個/mL菌液）。

2.3不同發(fā)酵時間對發(fā)酵酶活的影響

可知，在發(fā)酵時間為24～48 h時檢測出的吸光度呈不斷增加的趨勢，發(fā)酵時間48 h時達到最高，之后隨著發(fā)酵時間增加，檢測到的吸光度逐漸降低。這是由于隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)減少，納豆菌體逐漸老化，因此將48 h作為最佳發(fā)酵時間。

3結(jié)論

該試驗通過改變大豆浸泡時間、芽孢桿菌接種量、發(fā)酵時間3個因素制作納豆，利用TAME法測定納豆中納豆激酶酶活，最終確定高產(chǎn)納豆激酶最佳工藝條件為浸泡8 h，接種量為10%，發(fā)酵時間48 h，制得納豆的納豆激酶酶活最高。

參考文獻

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[3] 梁一博，白亮，唐鑫媛，等.納豆激酶產(chǎn)品研究現(xiàn)狀及其進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2011（4）：23-25.

[2] 付利，楊志興.納豆激酶的研究與應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，1995，15（5）：46-49.

[4] 奚曉琦，王加啟，卜登攀，等.納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40（11）：69-75.

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[7] 李睿，阮文輝.納豆激酶NKⅡ分離純化及其酶促動力學(xué)研究[J].中國釀造，2016，35（7）：89-92.