張竹君 劉權(quán)
摘要[目的]篩選馬鈴薯瘡痂病的生防菌。[方法]從馬鈴薯瘡痂病發(fā)病土壤中取樣,經(jīng)過(guò)稀釋培養(yǎng)和二次劃線純化獲得單克隆菌株,通過(guò)抑菌試驗(yàn)最終得到1株對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有較好抑制效果的細(xì)菌BU09,通過(guò)16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)該菌株進(jìn)行分子鑒定。[結(jié)果]細(xì)菌BU09屬于普城沙雷氏菌,對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治效果。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為馬鈴薯瘡痂病的田間防治提供了參考。
關(guān)鍵詞馬鈴薯瘡痂病;瘡痂鏈霉菌;普城沙雷氏菌;生物防治
中圖分類號(hào)S435.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2017)11-0123-02
Abstract[Objective] To screen out biocontrol bacteria for potato scab.[Method] We sampled from the potato scab diseased soil, and screened single clone strains by dilution and streak culture. A strain named BU09 which had obvious effect against S. scabies was gained by inhibition zone test. The molecular identification was executed through 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis.[Result] The BU09 strain was classified as Serratia plymuthica. The following pot trail revealed that BU09 had a good inhibition effect against S. scabies.[Conclusion] This result can supply reference for the filed control against potato scab.
Key wordsPotato scab;Scab streptomyces;Serratia plymuthica;Biocontrol
馬鈴薯瘡痂病是由植物病原菌鏈霉菌(Steptomyces spp.)引起的,只侵害馬鈴薯的地下塊莖部。最初在塊莖上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn),后逐漸擴(kuò)大形成圓形病斑,病斑周緣突起,周圍有一圈皺縮木栓層,最后形成瘡痂狀硬斑。該病害不僅會(huì)造成馬鈴薯產(chǎn)量降低,更會(huì)嚴(yán)重影響馬鈴薯的外觀品質(zhì),極大地降低馬鈴薯的商業(yè)價(jià)值[1-2]。瘡痂病原菌鏈霉菌屬放線菌,可在土壤中存活多年,營(yíng)腐生生活,有好氣性,最適生長(zhǎng)與發(fā)病溫度為25 ℃[3-5]。黑龍江省地處北溫帶與寒帶交叉帶,土壤溫度在馬鈴薯生長(zhǎng)期長(zhǎng)時(shí)間維持在25 ℃左右,為馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生和流行提供了機(jī)會(huì)。目前,在黑龍江省各馬鈴薯種植區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多處瘡痂病發(fā)生的種植區(qū),呈現(xiàn)出了大規(guī)模暴發(fā)的態(tài)勢(shì),值得引起足夠的重視,需及早進(jìn)行防控,避免造成更大規(guī)模的損失。
馬鈴薯瘡痂病是一種難防的世界性土傳病害,目前對(duì)該病害還缺乏特別有效的防治方法,生產(chǎn)中針對(duì)該病害的主要防治方法有選用抗病品種、化學(xué)藥劑防治和生物制劑防治等[6-8]。其中,抗病品種具有篩選難度大、適用地區(qū)受限的缺點(diǎn);而化學(xué)藥劑不僅污染環(huán)境,還會(huì)使土壤的微生物生態(tài)系統(tǒng)失衡,不利于可持續(xù)發(fā)展。研究表明,采用生物防治手段抑制馬鈴薯瘡痂病是較有效的方法[9-12]。馬鈴薯瘡痂病在自然條件下發(fā)病的嚴(yán)重程度主要取決于土壤中病原菌的數(shù)量和種類,同時(shí)土壤中還會(huì)相應(yīng)存在對(duì)其具有拮抗性的微生物。這些拮抗菌株可產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的物質(zhì),且可自然分解、無(wú)有害物質(zhì)殘留,因此被廣泛關(guān)注。在黑龍江省馬鈴薯種植面積快速增加的背景下,馬鈴薯瘡痂病暴發(fā)的潛在危險(xiǎn)值得引起重視,針對(duì)馬鈴薯瘡痂病害的生物防治研究應(yīng)盡快開(kāi)展。筆者針對(duì)以上情況,從馬鈴薯瘡痂病害發(fā)生地區(qū)采集發(fā)病土壤和塊莖組織,進(jìn)行了拮抗菌的篩選和鑒定,獲得具有突出抑制效果的生防菌,隨后進(jìn)行盆栽試驗(yàn),測(cè)定了生防菌對(duì)瘡痂鏈霉菌的防治效果,以期為瘡痂鏈霉菌的防治提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1培養(yǎng)基。YME固體平板:酵母粉 4 g,麥芽糖提取物 10 g,葡萄糖右旋糖 4 g,瓊脂粉 15 g,蒸餾水定容至1 L,pH 7.2,121 ℃下濕熱滅菌30 min,冷卻后倒入培養(yǎng)皿。LB固體平板:蛋白胨10 g,酵母粉 5 g,NaCl 10 g,瓊脂粉 15 g,蒸餾水定容至1 L,pH 7.0,121 ℃下濕熱滅菌30 min,冷卻后倒入培養(yǎng)皿。
1.1.2供試菌種。馬鈴薯瘡痂鏈霉菌(S.scabies)為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院保存,測(cè)試馬鈴薯品種為大西洋。
1.1.3試劑。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer購(gòu)自MBI;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T載體試劑盒購(gòu)自天根生化公司。引物合成、測(cè)序由生工生物公司完成。
1.2方法
1.2.1目的菌株的篩選。從黑龍江省克山縣馬鈴薯種植區(qū)瘡痂病發(fā)病地塊中取土樣,稱取1 g,加入含有玻璃珠的200 mL三角瓶中,加蒸餾水50 mL,150 r/min振蕩1 h。取懸浮培養(yǎng)液稀釋10-2后,取100 μL涂布到LB固體平板上,37 ℃倒置靜止培養(yǎng)24 h,得到布滿單克隆的平板。選取不同外觀的克隆分別進(jìn)行劃線培養(yǎng),得到純培養(yǎng)菌株,編號(hào)并溶解到20%甘油的溶液中,于-80 ℃保存。目的菌株的抑菌效果測(cè)試采用抑菌圈法。將瘡痂鏈霉菌制作成菌懸液,取100 μL涂布到Y(jié)ME固體平板上,取5 μL上述待測(cè)試菌株凍存液接種到涂有瘡痂鏈霉菌的YME平板上,28 ℃倒置靜止培養(yǎng)5 d,根據(jù)所產(chǎn)生的抑菌圈大小來(lái)判斷抑菌效果。
1.2.2目的菌株的鑒定。為了所獲得的生防菌株進(jìn)行分子鑒定,使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物對(duì)該菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物為:27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性 6 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化,取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定濃度后,使用T載體試劑盒將PCR產(chǎn)物連接至T載體中,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定陽(yáng)性克隆后送交生工生物測(cè)序。將該菌株的16S rDNA基因序列利用NCBI Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析,使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.3盆栽試驗(yàn)法測(cè)定生防菌的防治效果。選取健康的馬鈴薯塊莖,表面用70%乙醇消毒,然后用清水沖洗干凈,放置在 28 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽。待出芽后將馬鈴薯塊莖切成留有1個(gè)芽眼的三角塊,選取芽長(zhǎng)相近的薯塊播至花盆(直徑25 cm)中,在溫室中培養(yǎng),待薯苗長(zhǎng)出后,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)。將瘡痂鏈霉菌制成 1×107 CFU/mL的菌懸液,采用灌根法接種,每盆加入10 mL,7 d后接入生防菌菌懸液(1×107 CFU/mL),CK為對(duì)照,不加生防菌;處理1為每盆10 mL生防菌,處理2為每盆20 mL生防菌。每個(gè)處理重復(fù)5次。待馬鈴薯收獲后進(jìn)行病害分級(jí)鑒定,并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。
2結(jié)果與分析
2.1目的菌株的獲得從馬鈴薯瘡痂病發(fā)病土壤中取樣,經(jīng)過(guò)稀釋涂板和二次劃線分離后,得到500余株單克隆菌株。進(jìn)而通過(guò)抑菌圈法檢測(cè)菌株對(duì)鏈霉菌的抑制效果,得到多株對(duì)鏈霉菌具有抑制效果的菌株。其中,編號(hào)為BU09號(hào)的菌株效果較好(圖1)。
2.2目的菌株的鑒定通過(guò)對(duì)該菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接至T載體,送交測(cè)序后,得到該菌株的16S rDNA序列,經(jīng)NCBI Blast比對(duì),選取相似序列菌株通過(guò)Mega5軟件系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2),發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與普城沙雷氏菌具有99%的同源性,因此確定該菌株為普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)。
2.3BU09菌株對(duì)瘡痂鏈霉菌的防治效果BU09菌株對(duì)瘡痂鏈霉菌的盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照處理中馬鈴薯瘡痂病發(fā)病較嚴(yán)重,每個(gè)塊莖表面均有多個(gè)病斑;處理1中馬鈴薯瘡痂病發(fā)病較輕,每個(gè)塊莖表面有1~2個(gè)病斑;處理2中馬鈴薯瘡痂病發(fā)病不明顯,塊莖表面未發(fā)現(xiàn)明顯病斑(圖3)。
3結(jié)論與討論
普城沙雷氏菌是革蘭氏陰性菌,1987年首次在植物病害的生物防治上得到應(yīng)用。近些年,在防治Verticllium dahliae、Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、Botrytis cinerea、Phythium spp.等方面研究報(bào)道很多[13]。如Serratia plymuthica A21-4[14]是從洋蔥根際土壤中篩選出的1株對(duì)辣椒疫霉有強(qiáng)烈拮抗能力的菌,對(duì)辣椒疫霉菌的菌絲生長(zhǎng)、游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子的形成、萌發(fā)有著強(qiáng)烈的抑制作用;Serratia plymuthica HRO-C48[15]是從油菜根際分離出的1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和IAA的植物根際促生細(xì)菌,可抑制真菌生長(zhǎng),對(duì)黃瓜
猝倒病、番茄灰霉病具有防治效果。
普城沙雷氏菌BU09對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有較明顯的防治效果,是首次關(guān)于普城沙雷氏菌對(duì)鏈霉菌具有防治效果的研究報(bào)道。此外,經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)BU09的主要抑菌成分存在于培養(yǎng)液上清中,且為脂溶性化合物。因此,該菌抑菌成分的鑒定需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。該研究分離得到的BU09不僅在培養(yǎng)基上對(duì)瘡痂鏈霉菌具有抑制效果,還可以在土壤種植試驗(yàn)中起到明顯的抑菌效果,可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生防菌制劑,為馬鈴薯瘡痂病的防治提供參考。
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