甘露醇脅迫下模式植物狗尾草種子萌發(fā)期抗旱性鑒定與評價指標研究

趙輝 張麗麗 郭靜遠 霍姍姍 賀萍萍 夏啟玉 符冬妹 郭安平

摘 要 狗尾草是一種新型的模式植物，符合作為模式植物的所有要求，是C4光合作用的優(yōu)秀模型，也是研究非生物脅迫耐受性很好的模型。在狗尾草高效遺傳轉化技術的基礎上，以適宜轉化的狗尾草ME34品系非轉基因成熟種子為外植體，根據甘露醇高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)法，設計了0、200、300、400、500、600 mmol/L 6個梯度，對狗尾草ME34品系種子萌發(fā)期的抗旱性進行了鑒定。結果表明：甘露醇200～300 mmol/L的梯度是鑒定狗尾草ME34品系抗旱性的關鍵梯度，種子萌發(fā)期發(fā)芽率、鮮重、根長、芽長等各項生長指標都受到顯著或極顯著的影響，各生長指標對甘露醇干旱脅迫的敏感性依次為鮮重>根長>芽長>發(fā)芽率，參數間兩兩顯著或極顯著正相關；鮮重對甘露醇的脅迫的反應最敏感和直接，在200 mmol/L梯度下已表現為極顯著降低，可作為該品系種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的一級指標；根長對甘露醇梯度的反應是低濃度促進根的生長，高濃度抑制根的生長，極顯著促進生長的梯度（200 mmol/L）適合用作鑒定依據，此外，芽長對甘露醇也敏感，200、300 mmol/L分別顯著和極顯著抑制芽長，根長和芽長可作為該品系種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的二級指標；種子發(fā)芽率對甘露醇的敏感性稍弱，200 mmol/L條件下發(fā)芽率變化不明顯，在300 mmol/L條件下才表現為極顯著下降，可作為該品系種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的三級指標。實驗為狗尾草作為抗旱模式植物的研究準備了抗旱性評價指標基礎，無論是外源抗旱基因在狗尾草內的過表達，還是內源抗旱基因的敲除，都需要這些具體評價指標的支撐。

關鍵詞 狗尾草；萌發(fā)期；抗旱性鑒定；甘露醇

中圖分類號 S544.3 文獻標識碼 A

Abstract Setaria viridis was a new model plant， which meets all the requirements of model plants. It was an excellent model of C4 photosynthesis， and for studying the tolerance of abiotic stress. Based on the efficient genetic transformation of Setaria viridis， the non-transgenic mature seeds of ME34 strain which was Setaria viridis suitable for transformation were choosen as explants to study drought tolerance. According to Mannitol medium culture method，0， 200， 300， 400， 500， 600 mmol/L 6 gradients were designed. The germination rate，bud length，root length and fresh weight of each gradient were measured and analyzed. The results showed that the 200-300 mmol/L gradient of Mannitol were the key gradients of the Mannitol tolerance for ME34 strain. The germination rate，fresh weight，root length and bud length of seed germination were significant or extremely significant affected. The susceptibility of each growth index to mannitol drought stress was fresh weight>root length>bud length>germination rate. There were significant or extremely significant correlations between the four parameters. The fresh weight was the most sensitive and direct to the mannitol stress and extremely significant reduced at 200 mmol/L gradient，which could be used as the first grade index for drought resistance identification at seed germination stage. The sensitivity of the root length to mannitol stress was also very strong，but as a drought resistance index，only the extremely significant gradient（200 mmol/L）was suitable for identification. In addition，bud length was also sensitive to mannitol，200， 300 mmol/L，was the significant and extremely significant reduced gradient，respectively. Root length and bud length could be used as the second grade index for drought resistance identification at seed germination stage. The seed germination rate was not significant at 200 mmol/L，and it showed a extremely significant decrease under the condition of 300 mmol/L. Compared with other growth indexes，the susceptibility was weak， which could be used as the third grade of drought resistance identification index. The study prepared the identification and evaluation index of drought tolerance at seed germination stage for the pattern plant of Setaria viridis under Mannitol Stress. Whether the overexpression of exogenous drought-resistant genes of Setaria viridis，or the knockout of endogenous anti-drought gene，both need the support of these specific evaluation indicators.

Key words Setaria viridis； germination stage； identification of drought tolerance； mannitol

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.011

狗尾草（Setaria viridis）起源于熱帶，屬單子葉植物綱禾本科黍亞科，該科植物具有熱帶植物的典型特征。狗尾草與谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草類親緣關系接近，具有C4光合作用系統(tǒng)，在國際上主要作為C4光合作用的優(yōu)秀模型。此外，狗尾草本身耐熱、耐旱、耐鹽，是研究非生物脅迫耐受性很好的模型；狗尾草是新型的轉基因模式植物，與雙子葉模式植物擬南芥相比具有生長周期短、植株矮小、易于種植、容易轉化、基因組小、呈二倍體、能產生大量自交系種子等優(yōu)點，是優(yōu)良的單子葉模式植物[1-10]，幾乎符合作為一種模式植物的所有要求。

在擬南芥模式植物實際應用中科學家們發(fā)現，由于許多糧食作物為禾本科、單子葉植物，而擬南芥為雙子葉植物，較遠的親緣關系，導致同家族基因的功能出現嚴重分化，致基因功能完全相反。因此，擬南芥中基因功能的研究，離其在最終農作物中的應用還很遠[11-12]。于是，科學家們又發(fā)展了水稻作為禾本科的模式生物，由于其基因組小，易于轉化等諸多優(yōu)點，以水稻為模式植物開展的研究也越來越多，尤其是中國在水稻的功能基因組學方面的研究已經走在世界的前列。但是，水稻作為模式植物有先天的缺點，它對生長對環(huán)境的要求比較嚴格，在北方每年只能種一季。

狗尾草在研究C4植物的光合作用機理和非生物脅迫耐受性方面，具有得天獨厚的優(yōu)勢，與許多禾本科農作物如谷子、玉米等具有較近的親緣關系，它們的基因功能更具有較高的保守性。Huang等[13]以狗尾草為模式植物，通過NMU誘變，篩選到了一個花絮稀疏的突變體，通過BSA重測序方法，鑒定到了突變基因，而且玉米中的同源基因突變后也表現出與狗尾草突變體相同的表型，這進一步證明了以狗尾草為模式植物進行玉米基因組功能研究的優(yōu)越性。

干旱是一種世界性的災害，因干旱而引起的糧食減產比其它所有逆境因素所導致的減產總和還要多。 據統(tǒng)計，世界上干旱及半干旱地區(qū)約占地球陸地面積的34.9%，中國干旱、半干旱地區(qū)占國土面積的47%，占總耕地面積的51%，干旱缺水是中國農業(yè)面臨的最嚴重的問題之一[14-17]。因此，作為模式植物的狗尾草，在高效遺傳轉化技術的基礎上開展的抗旱基因功能研究在中國必將具有更重要的意義，但國內外將狗尾草作為抗旱轉基因育種模式植物的研究還很少。本研究在狗尾草高效遺傳轉化技術的基礎上，以適宜轉化的狗尾草ME34品系非轉基因種子為外植體，根據甘露醇高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)法，設計了0、200、300、400、500、600 mmol/L 6個梯度，對狗尾草ME34品系種子萌發(fā)期的抗旱性進行了鑒定，為狗尾草作為抗旱轉基因育種模式植物的抗旱性評價指標的鑒定打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以適宜遺傳轉化的狗尾草ME34品系為植物材料，材料由美國Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell 實驗室提供，以ME34品系經休眠處理的成熟種子為外植體材料，研究種子萌發(fā)期的抗旱性。

1.2 方法

1.2.1 相關組培技術 甘露醇高滲培養(yǎng)基配制：1/2MS培養(yǎng)基，10 g蔗糖，pH5.8，Gelzan植物凝膠4 g，在基礎培養(yǎng)基內分別添加甘露醇，添加濃度梯度為0、200、300、400、500、600 mmol/L，于120 ℃高壓滅菌20 min后倒皿備用。

種子的無菌處理和接種：選取經休眠處理的狗尾草干燥成熟種子，去除種皮后將約1 g種子裝入14 mL離心管，加入10 mL有效濃度約1%～3%的次氯酸鈉溶液，再加50 μL吐溫20溶液，滅菌消毒處理約10 min；用無菌水清洗多次后，將種子接種于含不同濃度梯度的甘露醇的高滲培養(yǎng)基上，種子的芽朝上，每皿培養(yǎng)基約接20粒種子，每個梯度接3皿（3個重復），于24 ℃光/暗培養(yǎng)（12 000 lx，16 h/8 h，50%～60%濕度），7 d以后觀察記錄各生長指標。

1.2.2 調查項目及分析方法

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數/接種的種子數×100%。

芽長平均值=同一脅迫梯度下發(fā)芽種子苗地上芽長的均值。

根長平均值=同一脅迫梯度下發(fā)芽種子苗地下主根長的均值。

相對發(fā)芽率=脅迫處理的發(fā)芽率/對照處理的發(fā)芽率×100%。

芽生長抑制率=（對照芽長的均值-脅迫處理芽長的均值）/對照芽長的均值×100%。

根生長抑制率=（對照根長的均值-脅迫處理根長的均值）/對照根長的均值×100%。

鮮重抑制率=（對照鮮重的均值-脅迫處理鮮重的均值）/對照鮮重的均值×100%。

1.3 數據分析

數據、圖標處理采用Excel 2010軟件完成， 利用Sigma Plot 10.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析、差異顯著性檢驗和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 甘露醇對狗尾草種子萌發(fā)的整體影響

從圖1可知，與無甘露醇的對照相比，從種子萌發(fā)第7天的整個生長情況看，200 mmol/L甘露醇已經開始抑制狗尾草生長量（B），300 mmol/L表現出非常明顯的抑制作用（C），B、C、D、E、F中狗尾草中的生長受抑制情況依次加重，400 mmol/L以上非轉基因的ME34種子已很難生長（D）。根據測算，表1具體列出了各生長指標數據。

2.2 甘露醇對狗尾草種子發(fā)芽率的影響

圖2是發(fā)芽率隨甘露醇濃度梯度的變化圖。從圖中可知，發(fā)芽率隨著甘露醇濃度的提高總體呈下降趨勢，在0～300 mmol/L的范圍內發(fā)芽率下降較快，300～400 mmol/L的范圍內變化平緩，400～600 mmol/L范圍內再次急速下降。此外，從各梯度發(fā)芽率方差分析可知，0 mmol/L與200 mmol/L的發(fā)芽率差異不顯著（p=0.095>0.05），與300～600 mmol/L差異極顯著（p=0.000 54，0.000 79，0.000 24， 1.17E-05<0.01）；200 mmol/L與300～600 mmol/L差異極顯著（p=1.41E-05，8.03E-05，7.37E-05，8.42E-08<0.01）；300 mmol/L與400 mmol/L差異不顯著（p=0.4625>0.05），與500～600 mmol/L差異極顯著（p=0.003 3，2.47E-06<0.01）；400 mmol/L與500～600 mmol/L差異極顯著（p=0.0032，6.1521E-06<0.01）；500 mmol/L與600 mmol/L差異極顯著（p=0.0002<0.01）。從各梯度變化圖和方差分析的整體情況看，200 mmol/L對發(fā)芽率影響不顯著，300 mmol/L極顯著影響發(fā)芽率，如果需要通過發(fā)芽率考察ME34品系轉基因后的抗旱能力，需要用到300 mmol/L的梯度。

2.3 甘露醇對狗尾草種子萌發(fā)期鮮重的影響

圖3是鮮重隨甘露醇濃度梯度的變化圖。從圖3可知，鮮重隨著甘露醇濃度的提高總體呈下降趨勢，在0～200 mmol/L的范圍內鮮重下降明顯，200～600 mmol/L范圍內鮮重下降平緩。此外，從各梯度鮮重方差分析可知，0 mmol/L與200、300、400、500、600 mmol/L的鮮重差異極顯著（p=0.006 2， 0.002 3，0.001 8，0.001 4，0.000 8<0.01）；200 mmol/L與300、400 mmol/L差異不顯著（p=0.124 6， 0.051 8>0.05），與500 mmol/L差異顯著（p=0.021 1 <0.05），與600 mmol/L差異極顯著（p=0.003 6<0.01）；300 mmol/L與400 mmol/L差異不顯著（p=0.226 7>0.05），與500 mmol/L差異顯著（p=0.042 2 <0.05），與600 mmol/L差異極顯著（p=0.001 3<0.01）；400 mmol/L與500 mmol/L差異不顯著（p=0.202 5>0.05），與600 mmol/L差異極顯著（p=0.005 2 <0.01）；500 mmol/L與600 mmol/L差異顯著（p=0.031 3<0.05）。從各梯度變化圖和方差分析的整體情況看，200 mmol/L極顯著影響鮮重，如果需要通過鮮重考察ME34品系轉基因后的抗旱能力，需要用到200 mmol/L的梯度。

2.4 甘露醇對狗尾草種子胚芽生長的影響

圖4是芽長隨甘露醇濃度梯度的變化圖。從圖中可知，芽長隨著甘露醇濃度的提高總體呈縮短趨勢，在0～300 mmol/L的范圍內芽長下降明顯，300～600 mmol/L范圍內芽長下降平緩。此外，從各梯度芽長方差分析可知：0 mmol/L與200 mmol/L的芽長差異顯著（p=0.017 9<0.05），與300～600 mmol/L差異極顯著（p=0.000 8，0.000 4，0.000 3， 0.000 2<0.01）；200 mmol/L與300～600 mmol/L差異極顯著（p=0.002 8，0.001 0，0.000 4，0.000 2<0.01）；300 mmol/L與400 mmol/L差異顯著（p=0.026 1<0.05），與500～600 mmol/L差異極顯著（p=0.002 7，0.000 5<0.01）；400 mmol/L與500 mmol/L差異顯著（p=0.046 1<0.05），與600 mmol/L差異極顯著（p=0.002 5<0.01）；500 mmol/L與600 mmol/L差異顯著（p=0.012 9<0.05）。從各梯度變化圖和方差分析的整體情況看，200 mmol/L顯著影響芽長，300 mmol/L極顯著影響芽長。如果需要通過芽長考察ME34品系轉基因后的抗旱能力，需要用到200 mmol/L和300 mmol/L的梯度。

2.5 甘露醇對狗尾草種子胚根生長的影響

圖5是根長隨甘露醇濃度梯度的變化圖。從圖中可知，根長的變化與發(fā)芽率、鮮重、芽長的變化有所不同，隨著甘露醇濃度的提高總的趨勢是先升高后降低，在0～300 mmol/L的范圍內根長有先顯著升高后下降的趨勢，300～600 mmol/L范圍內根長一直下降。此外，從各梯度根長方差分析可知，0 mmol/L與200 mmol/L的根長差異顯著（p=0.012 7<0.05），與300 mmol/L差異不顯著（p=0.383 8>0.05），與400 mmol/L差異顯著（p=0.032 6<0.05），與500～600 mmol/L差異極顯著（p=0.004 5，0.000 3<0.01）；200 mmol/L與300～600 mmol/L差異極顯著（p=0.006 1， 0.001 1，0.000 4，7.19E-05<0.01）；300 mmol/L與400 mmol/L差異不顯著（p=0.1140>0.05），與500～600 mmol/L差異極顯著（p=0.009 8，0.000 4<0.01）；400 mmol/L與500 mmol/L差異顯著（p=0.011 9<0.05），與600 mmol/L差異極顯著（p=5.85E-05<0.01）；500 mmol/L與600 mmol/L差異極顯著（p=0.000 4<0.01）。從各梯度變化圖和方差分析的整體情況看，根長隨著甘露醇脅迫濃度的增加有先增長后縮短的趨勢，在200 mmol/L梯度下根長極顯著增長。如果考察ME34品系轉基因后的抗旱能力，200 mmol/L梯度下根長的增長量可以用來鑒定抗旱性的強弱；由于0 mmol/L與300 mmol/L差異不顯著，同時，300 mmol/L的梯度下非轉基因ME34品系的總體生長量已經很小，所以300 mmol/L以上的梯度不適合用來從根長的角度進行轉基因狗尾草抗旱鑒定。

2.6 甘露醇脅迫下狗尾草種子萌發(fā)期各生長指標的相關性分析

甘露醇脅迫下狗尾草ME34品系種子萌發(fā)期各生長指標的相關性見表2。其中，發(fā)芽率與根長、芽長、鮮重呈極顯著正相關；根長與芽長呈極顯著正相關，根長與鮮重呈顯著正相關；芽長與鮮重呈極顯著正相關。

3 討論

從狗尾草的起源、分布和生存環(huán)境可知，狗尾草具有豐富的抗性基因資源，狗尾草是谷子（Setaria italica）的野緣近親，有研究表明谷子的很多栽培品系明顯抗旱，1 g的干物質產量，玉米需要470 g水，小麥需要510 g水，谷子只需要257 g水[18-19]。狗尾草是比擬南芥更貼近主要農作物的模式植物，目前針對狗尾草的研究主要還在C4機理方面，針對其抗旱性開展的研究還很少，有很大的研究空間[11-13]。狗尾草的抗旱機理涉及代謝、蛋白水解和信號傳遞等各種機制[20-21]。在狗尾草高效遺傳轉化技術的基礎上，以狗尾草為模式植物，通過轉基因技術的過表達或基因編輯等技術對狗尾草的抗旱機理進行研究，必將取得豐碩的研究成果，并指導作物育種工作。

植物的抗旱性是一個極其復雜的數量性狀，針對模式植物狗尾草尚無一個簡單有效、經濟方便、實用可靠、便于實驗室參考使用的抗旱性鑒定指標體系。本研究在參考玉米、大豆、水稻等大宗作物抗旱性鑒定方法的基礎上，選擇甘露醇高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)法，在組織培養(yǎng)條件下，對狗尾草ME34品系種子萌發(fā)期的抗旱性進行了鑒定，為模式植物狗尾草抗旱轉基因研究提供了抗旱性鑒定指標體系。

實驗結果表明，甘露醇200～300 mmol/L梯度是鑒定狗尾草ME34品系抗旱性的關鍵梯度，種子萌發(fā)期發(fā)芽率、鮮重、根長、芽長等各項生長指標都受到顯著或極顯著的影響。其中鮮重對甘露醇的脅迫最敏感，在200 mmol/L梯度下已表現出極顯著降低趨勢，可作為該品系種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的一級指標；根長對甘露醇脅迫的敏感性也很強，在200 mmol/L梯度下根長極顯著增加，但根長對甘露醇梯度的反應是低濃度促進根的生長，高濃度抑制根的生長，在高濃度抑制的條件下種子已難以萌發(fā)生長，所以作為抗旱指標，極顯著促進生長的梯度（200 mmol/L）適合用作鑒定依據；此外，芽長對甘露醇也敏感，200、300 mmol/L分別顯著和極顯著抑制芽長，根長和芽長可作為該品系種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的二級指標；種子發(fā)芽率在200 mmol/L條件下變化不明顯，在300 mmol/L條件下才表現出極顯著下降趨勢，相對其它的生長指標，其敏感性稍弱，可作為該品系種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的三級指標。

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