藍亞麻花瓣中類黃酮化合物及代謝途徑分析

宋洋　雷霆　金雪花　付燈祥

摘要： 花色是觀賞植物重要的觀賞性狀之一，而類黃酮是其主要的呈色物質(zhì)。該研究以藍亞麻花瓣為研究對象，將藍亞麻開花過程分為5個階段，并用高效液相色譜—光電二極管陣列檢測技術（HPLCPAD）和高效液相色譜—電噴霧離子化—質(zhì)譜連用技術（HPLCESIMS）分析不同開花階段花瓣中類黃酮化合物的成分和含量。結(jié)果表明：藍亞麻花瓣中積累飛燕草素苷、矢車菊素苷和錦葵素苷，未檢測到天竺葵素苷，其中以?；娘w燕草素苷為主要呈色物質(zhì)；而總花青素苷含量在第2階段達到最高。根據(jù)花青素苷終產(chǎn)物和類黃酮中間代謝產(chǎn)物推定了藍亞麻花瓣中類黃酮代謝途徑，其中以F3′5′H所引導的分支途徑占優(yōu)勢，其主要原因可能是F3′5′H酶活高于F3′H。

關鍵詞： 藍亞麻， 花青素苷， 類黃酮， 花色， 代謝途徑

中圖分類號： Q946.8

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）11136810

Abstract： Flower colour is one of the most ornamental quality in ornamental plant， and flavonoid is the main pigment. In this study， the flowering stages of Linum pernne was divided into five stages. We used high performance liquid chromatography with a photodiode array detector（HPLCPAD） and HPLCelectrospray ionizationmass spectrometry（HPLCESIMS） method for qualitative and quantitative analyses of anthocyanins and the key flavonoid intermediate product in the different flower development stages. The results were as follows： L. pernne petals contained delphinidin， cyanidin and malvidin， but pelargonidin was no detected， and the main color substance was acylation of delphinidin； The highest total contents of the anthocyanins was at Stage 2. According to the end product and the intermediate product， we speculate the flavonoid biosynthesis pathways in L. pernne， in which F3′5′H leading branch pathway is dominant， and the main reason for that is F3′5′H enzyme activity is higher than that of F3′H.

Key words： Linum pernne， anthocyanin， flavonoid， flower colour， biosynthesis pathways

花色是觀賞植物重要的觀賞性狀，決定花色的色素成分分為三類：類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素。其中，類黃酮中的花青素苷可使花色呈現(xiàn)橙黃、紅色到紫色和藍色，而黃酮和黃酮醇使花色呈黃色至白色。不同物種合成有限的類黃酮物質(zhì)，使花瓣呈現(xiàn)有限的顏色。菊花、玫瑰、香石竹、百合等因不能積累飛燕草素苷所以花瓣不能呈現(xiàn)藍色（戴思蘭和洪艷，2016），而大花蕙蘭、矮牽牛等不能積累天竺葵素苷，故不能開出磚紅色的花（Johnson et al， 1999；Leonard et al， 2008）。

分析呈色物質(zhì)，解析呈色物質(zhì)的代謝途徑是研究花色的重要手段。迄今，已在多種植物中通過檢測花青素苷的終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，研究花青素苷的代謝途徑，解析花色的形成機理。如通過分析不同花色瓜葉菊花瓣中的花青素苷和中間代謝產(chǎn)物（Jin et al，2016）、對藍色和白色風信子花瓣中類黃酮代謝物質(zhì)（Lou et al，2014）、對藍色和紫色六倍利（Lobelia erinus）進行色素物質(zhì)比較（Hsu et al， 2016）、不同花色耐寒睡蓮花瓣花青素苷成分（朱滿蘭等，2012）以及藍色睡蓮色素物質(zhì)成分（Wu et al， 2016），研究了觀賞植物花瓣中的類黃酮代謝途徑，解析其呈色機理。

當前花青素苷分析的重要方法為HPLCMS（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）法，該方法分析速度快、靈敏度高（De et al，2006），已廣泛應用于類黃酮物質(zhì)的分離和鑒定（Lou et al，2014；Jin et al，2016）。

藍色花具有獨特的觀賞性，可形成園林景觀中罕見的藍色色調(diào)，因此是花色遺傳育種學家研究的重要材料。藍亞麻（Linum pernne）又名亞麻花，是亞麻科，亞麻屬二年生草本花卉，株高60～70 cm，花呈素雅的藍色，是為數(shù)不多的藍色地被植物，是目前國際流行的組合盆栽花材，也是研究藍色花形成機理的好材料。而目前對藍亞麻的研究僅限于栽培和園林應用（孫慧杰等，2009；葉劍秋等，2007；張明麗等，2006），未見對其花色呈色物質(zhì)的研究報告。

本研究以藍亞麻花瓣為研究對象，分析藍亞麻花瓣中花青素苷、黃酮和黃酮醇的成分和含量，以及花青素苷在不同開花階段花瓣中的變化規(guī)律，推定類黃酮的代謝途徑，為探討藍亞麻藍色花呈色機理、為藍色花遺傳育種提供參考。

1材料與方法

1.1 植物材料

以藍亞麻為植物材料，采自昆明理工大學實驗田，選擇花色一致、長勢均一的花瓣，采集不同開花階段的花瓣進行呈色物質(zhì)的分析。按形態(tài)特征，將藍亞麻開花過程分為5個階段（表1）。

1.2 黃酮、黃酮醇和花青素苷的提取

摘取5個開花階段的藍亞麻花瓣，用液氮研磨至粉末狀。液氮揮發(fā)后，用花青苷提取液：甲醇∶水∶甲酸∶三氟醋酸=70∶27∶2∶1提取，每250 mg鮮重加1 mL提取液。黃酮和黃酮醇的樣品處理方法與花青素苷相同，提取液為甲醇，每100 mg鮮重加1 mL甲醇提取。將兩種提取液均置于4 ℃處放置，浸提24 h，每隔12 h震蕩一次（Yoshitama，1981； Jia et al，2008）、（張劍亮等，2009），提取液經(jīng)0.2 μm的過濾器過濾，得到待測樣品。

1.3 花青素苷、黃酮和黃酮醇含量測定

采用高效液相色譜法（HPLCPAD）來分析藍亞麻花青素苷、代謝途徑的中間產(chǎn)物（黃酮和黃酮醇）的含量（李崇暉等，2008）?；ㄇ嗨剀諟y定儀器使用Agilent高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent公司的ZORBAX型SBAq （4.6 mm × 250 mm）。HPLC測定條件：檢測波長530 nm，流動相為A、B兩相。A相為水∶甲酸∶三氟醋酸= 97.9∶2∶0.1；B相為水∶乙腈∶甲酸∶三氟醋酸= 62. 9∶35∶2∶0.1。進樣量為10 μL，柱溫25 ℃，流速0.8 mL·min1。流動相B的洗脫梯度為0～20 min，30%～53%；20～40 min，53%～53%；40～45 min，53%～30%；45～50 min，30%～30%。配制不同濃度的為氯化矢車菊素（Cyanidin），根據(jù)濃度和峰面積繪制標準曲線，計算花青素苷含量。

黃酮和黃酮醇的測定使用戴安公司生產(chǎn)的高效液相色譜儀（Ultimate 3000API 3200 Q TRAP）。色譜柱型號為MSLab HPC18（150*4.6 mm 5 μm）， HPLC測定條件：流動相為A（水）、B（乙腈）兩相。進樣量為10 μL，柱溫50 ℃，流速1 mL·min1。流動相B的洗脫梯度為0～1.5 min，90%；1.5～7 min，70%；7～8 min，40%；8～10 min，5%；10～15 min，90%。配制不同濃度的標準品，根據(jù)濃度和峰面積繪制標準曲線，計算黃酮和黃酮醇含量。

采用高效液質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLCESIMS）分析樣本的花青素苷成分。高效液質(zhì)聯(lián)用法分析條件：采用Agilent 6540QTOT液質(zhì)聯(lián)用儀進行HPLCESIMS分析。液相色譜的分析條件與上文相同。質(zhì)譜分析條件：ESI正離子掃描，掃描范圍（m/z）：100～1 600；干燥氣為氮氣，干燥溫度350 ℃，流速6.0 L·min1，毛細管電壓3 500 V，噴霧器壓力200 kPa，毛細管出口電壓100 V。用MZmine軟件分析質(zhì)譜結(jié)果。

本研究所用標準品為氯化矢車菊素（Cyanidin）、柚皮素（Naringenin）、芹菜色素（Apigenin）、木犀草素（Luteolin）、二氫楊梅素（Dihydromyricetin）、二氫山奈酚（Dihydrokaempferol）、二氫槲皮素（Dihydroquercetin）、楊梅素（Myricetin）、山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercetin），均購于上海源葉生物科技有限公司。

2結(jié)果與分析

2.1 不同開花階段藍亞麻花瓣中花青素苷組成的特征

采用高效液相色譜法分析藍亞麻花瓣花青素苷的含量，在檢測波長530 nm處出現(xiàn)4個峰（圖1），按保留時間順序分別定義為A1、A2、A3、A4?；ㄇ嗨剀盏淖贤夤庾V吸收峰表明，A1～A4均在紫外光區(qū)有兩個吸收峰，可見光區(qū)有一個吸收峰（圖2）。經(jīng)過?；揎椀幕ㄇ嗨剀赵谧贤夤鈪^(qū)有2個吸收峰，可見光區(qū)485～550 nm之間有1個吸收峰（安田奇，1989）。

花青素苷的質(zhì)譜中分子離子常帶一個氫離子，以 [M+H]+的形式存在，花青素苷的類型依據(jù)質(zhì)譜中苷元離子 [Y0]+質(zhì)荷比推定（Beatriz et al，2009； Stobiecki，2000； Cuyckens & Claeys， 2004）。

本研究對4種花青素苷進行質(zhì)譜分析，花青素苷的類型可根據(jù)質(zhì)譜圖中的花青素苷碎片特征推定（圖3，表2，表3）。從4個質(zhì)譜圖中推定各花青素苷的碎片離子，花青素苷A1，經(jīng)過一級質(zhì)譜得到分子離子773（[M+H]+），釋放出飛燕草苷元（[Y0]+）特征碎片離子m/z 303（[Y0]+），釋放出碎片離子m/z 470（[Glu+Caf+Glu] +）為分子離子減去2個葡萄糖和1個咖啡?；慕Y(jié)果?；ㄇ嗨剀誂2，經(jīng)過一級質(zhì)譜得到分子離子757（[M+H]+），釋放出飛燕草苷元（[Y0]+）特征碎片離子m/z 303（[Y0]+），釋放出碎片離子m/z 454（[Rha+Cou+Glu] +）為分子離子減去1個鼠李糖、1個香豆?；?個葡萄糖的結(jié)果?；ㄇ嗨剀誂3，經(jīng)過一級質(zhì)譜得到分子離子757（[M+H]+），釋放出矢車菊苷元（[Y0]+）特征碎片離子m/z 287（[Y0]+），釋放出碎片離子m/z 470（[Glu+Caf+Rha]+）為分子離子減去1個葡萄糖、1個咖啡酰基和1個鼠李糖的結(jié)果。花青素苷A4，經(jīng)過一級質(zhì)譜得到分子離子669（[M+H]+），釋放出錦葵素苷元（[Y0]+）特征碎片離子m/z 331（[Y0]+），釋放出碎片離子m/z 338（[Glu+Fer]+）為分子離子減去1個葡萄糖和1個阿魏?；慕Y(jié)果。綜上所述，A1、A2為飛燕草素苷，A3為矢車菊素苷，A4為錦葵素苷。

2.2 藍亞麻不同開花階段花瓣中花青素苷含量及變化規(guī)律

對5個開花階段藍亞麻花瓣中花青素苷進行定量分析（表4），得知A1、A2含量除第一階段外，均占總花青素苷含量在60%以上，即飛燕草素苷在花朵開放過程中為主要的呈色物質(zhì)。

對藍亞麻花青素苷A1、A2、A3、A4含量在花朵開放過程中的變化來看，A1、A2、A3在第2階段含量最高，其他4個階段無顯著差異。而A4含量在第1階段最高，然后呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。各花青素苷合成高峰均在早期。

2.3 藍亞麻黃酮和黃酮醇組成

為了進一步解析藍亞麻花色呈色物質(zhì)基礎，解析其花瓣片中類黃酮的代謝途徑，本研究對處于花朵開放第5階段的花瓣片，進行關鍵中間代謝產(chǎn)物的檢測（表5）。結(jié)果三種二氫黃酮醇均檢測到，其中二氫槲皮素含量最高，然后是二氫山奈酚，二氫楊梅素最少。同時檢測到楊梅素和山奈酚，但未檢測到槲皮素。

3討論

3.1 藍亞麻花瓣呈色物質(zhì)種類及其含量的動態(tài)變化

決定花色的主要色素物質(zhì)為花青素苷，花青素苷主要合成于細胞質(zhì)，積累于液泡中，使花色呈現(xiàn)橙、粉、紅、紫和藍色。其中天竺葵素苷使花色呈現(xiàn)紅色到磚紅色，矢車菊素苷使花色呈現(xiàn)紅色、深紅色，而飛燕草素苷可使花色呈現(xiàn)藍色，錦葵素苷使花瓣呈現(xiàn)藍紫色（Tanaka et al，2008）。

本研究在藍亞麻花瓣中檢測到4種花青素苷：飛燕草素苷（A1和A2）、矢車菊素苷（A3）以及錦葵素苷（A4）。其中飛燕草素苷含量除第1階段外，其余階段均占花青素苷總量的60%以上。同時發(fā)現(xiàn)這些花青素苷都得到了芳香?；揎?。因此，認為芳香?；w燕草素苷是藍亞麻花瓣呈藍色的主要原因。智利藍番紅花（Tecophilaea cyanocrocus）和藍色銀蓮花（Anemone coronaria）中，使其呈藍色的呈色物質(zhì)也為?；w燕草素苷（Mori et al，2014；Saito et al，2002）。酰基化（Acylation）是花青素苷重要的修飾方式之一，其中芳香酰基化修飾，可使最大吸收波長藍移有效產(chǎn)生藍色的同時，通過分子間的堆疊使藍色更穩(wěn)定（Honda & Saito，2002；Luo et al，2007；Sasaki & Nakayama， 2015）。

在藍亞麻中花青素苷的積累，前2個階段最高，即在未完全開放前達到最高值，之后花青素苷含量下降，這可能是因為開花過程中花瓣面積的增加速度大于花青素苷合成的速度。也有人認為隨著花瓣的展開，受光的面積增大，光照引起花青素苷的降解或氧化，引起花青素苷含量的降低（張玲等，2015）。也有些植物為了防止紫外線對細胞的毒害，在完全開放前就完成了花青素苷的合成，草原龍膽就有類似的現(xiàn)象（Uddin et al，2002）。

3.2 藍亞麻類黃酮合成途徑競爭關系

我們根據(jù)終產(chǎn)物花青素苷和中間產(chǎn)物黃酮、黃酮醇，推定了類黃酮的代謝途徑（圖4），即在藍亞麻花瓣中，類黃酮合成途徑，在柚皮素處，由F3′H、F3H和F3′5′H催化發(fā)生了三個分支，分別生成圣草酚、二氫山奈酚（DHK）和五羥黃酮。圣草酚在F3H和FNS的作用下分別生成二氫槲皮素（DHQ）和木犀草素。DHK在F3′H、FLS和F3′5′H作用下分別生成DHQ、山奈酚和二氫楊梅素（DHM）。DHQ接著在DFR、ANS、GT、AT的催化下生成了酰基化的矢車菊素苷。而DHM一部分在FLS的作用下生成楊梅素，一部分在DFR、ANS催化下生成了飛燕草素。而飛燕草素分為兩個分支，一個是甲基化合成錦葵素，錦葵素在GT、AT作用下進一步生成?；\葵素苷；而大部分飛燕草素在GT、AT作用下生成2種?；w燕草素苷。從而最終生成4種花青素苷。

F3′5′H所引導的分支產(chǎn)物飛燕草素苷（A1和A2）和錦葵素苷（A4）含量占花青素苷總量的80.62%，F(xiàn)3′H所引導的分支產(chǎn)物矢車菊苷（A3）僅占19.38%。這說明F3′5′H的酶活遠高于F3′H，使代謝流流向飛燕草素分支方向，從而使花色呈藍色。下一步可以檢測兩個酶所編碼的基因轉(zhuǎn)錄表達水平及酶活，進行比較鑒定，并分析F3′5′H基因序列。F3′5′H和F3′H決定飛燕草素和矢車菊素的分支流（戴思蘭和洪艷，2016）， 在瓜葉菊中F3′5′H與F3′H表達量的比率決定了DHK處的代謝流走向（Jin et al，2016），在枸杞中，F(xiàn)3′H和F3′5′H的酶活特性決定產(chǎn)生矢車菊素或飛燕草素代謝流（Zeng et al，2014）。

在藍亞麻花瓣中我們并未檢測到天竺葵素苷（表4）。這可能因為F3′H、FLS和F3′5′H活性高于DFR，且其DFR可能具有底物特異性，所以二氫山奈酚（DHK）沒有進一步被DFR催化生成無色天竺葵素，也就不能生成天竺葵素苷。前人研究認為抑制F3′5′H和/或F3′H基因的表達可改變花青素的分支途徑合成天竺葵素（Tanaka & Brugliera， 2013）。在煙草（Forkjrnan & Ruhnau， 1987）、大花蕙蘭、大花牽牛等植物中由于DFR具有底物特異性，不能有效還原DHK，導致天竺葵素的缺乏（Johnson et al，1999；Leonard et al，2008）。另外，阻斷花青素的積累會增強黃酮和黃酮醇的代謝流，反過來阻斷黃酮和黃酮醇的合成，將會促進花青素苷的積累，如通過下調(diào)黃酮醇合成酶（FLS）的表達，阻斷黃酮醇的合成，增加了花青素苷合成代謝流（Davies et al，2003），而干擾黃酮合成酶（FNS），阻斷黃酮的合成，促使大量花青素苷的積累，如大麗花（Deguchi et al，2013；Deguchi et al，2015）。

綜上所述，在藍亞麻花瓣中不同花青素苷分支途徑、黃酮和黃酮醇合成途徑之間存在競爭關系。其中，之所以大量積累F3′5′H所誘導的分支產(chǎn)物，可能是因為F3′5′H的酶活遠高于F3′H，故藍亞麻F3′5′H可能是培育藍色花的有效基因資源。本研究在藍亞麻花瓣中所檢測到的花青素苷均酰基化修飾，故認為藍亞麻是挖掘酰基修飾基因的有效種質(zhì)資源。這些結(jié)果將為進一步解析藍亞麻呈色機理提供依據(jù)，為花色研究提供方法。

致謝感謝昆明理工大學建筑與城市規(guī)劃學院的本科生：顧希婧、夏俊紅、王阿娟、李瑞林和母其杰5位同學在本研究實驗材料處理中給予的幫助。

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