熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的復(fù)合誘變選育

付雅欣 雷高 方青 高紅亮 楊雪霞

摘要[目的]提高熱凝膠多糖產(chǎn)量和凝膠特性。[方法]采用紫外線和亞硝基胍對(duì)土壤桿菌714進(jìn)行誘變；通過(guò)平板-搖瓶篩選方法，得到2株高產(chǎn)菌。[結(jié)果]突變菌株0.6-45和0.5-50的熱凝膠多糖粗提得率分別為26.5和26.4 g/L，分別是出發(fā)菌株粗提得率（3.8 g/L）的7.0和6.9倍，熱凝膠多糖精提得率分別為19.4和18.0 g/L。凝膠特性分析表明，突變菌株熱凝膠多糖凝膠的破裂強(qiáng)度、破裂位移、彈性、內(nèi)聚性、恢復(fù)性較好，均高于市售樣品，而凝膠強(qiáng)度、硬度、膠著性和咀嚼性低于市售樣品。GPC測(cè)定菌株0.6-45和菌株0.5-50產(chǎn)熱凝膠多糖的MW分別為1.57×106和1.27×106 Da。[結(jié)論]復(fù)合誘變提高了熱凝膠多糖的產(chǎn)量并改善了多糖的凝膠特性。

關(guān)鍵詞熱凝膠多糖；紫外誘變；亞硝基胍誘變；高產(chǎn)菌株；凝膠特性

中圖分類號(hào)Q93文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0007-04

Abstract[Objective] In order to improve the yield and quality of curdlan.[Method] Agrobacterium sp.714 was mutated by UV and NTG.Two highyield strains were selected by plate spreading and shakingflask fermentation.[Result] The crude yield of curdlan from the strain 0.6-45 and strain 0.5-50 were 26.4 and 26.5 g/L，and were 6.9 and 7.0 times higher than the crude yield of parent strain （3.8 g/L）.The refined yield of curdlan from the strain 0.6-45 and strain 0.5-50 were 19.4 and 18.0 g/L.The characteristics of gel showed that the fracture strength，fracture distance，springiness，cohesiveness and resilience were higher than the sample from market，and the gel strength，hardness，gumminess and chewiness were lower than sample from market.GPC results showed the molecular weights were respectively 1.57×106 and 1.27×106 Da for curdlan from the strain 0.6-45 and 0.5-50.[Conclusion] Combined mutation improves the yield of curdlan and changes the characteristics of gel.

Key wordsCurdlan；UV mutation；NTG mutation；Highyield strain；Gel characteristics

熱凝膠多糖又稱可得然膠，是一種主要由土壤桿菌類微生物產(chǎn)生的胞外β-1，3-葡聚糖[1-3]，因其在加熱條件下可以形成凝膠的獨(dú)特性質(zhì)而得名[4]。熱凝膠多糖最早是在1966年被Harada等[5]發(fā)現(xiàn)并開(kāi)始研究，1996年被美國(guó)FDA（Food and Drug Administration）認(rèn)證安全，可用作食品添加劑[6]。熱凝膠多糖具有獨(dú)特的加熱成膠性[7]、良好的持水性[8]、凍融穩(wěn)定性[9]和安全性[6]等優(yōu)良特性，近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)免疫和抗腫瘤的特性[10]，在食品[11-12]、生物醫(yī)藥[13-15]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

為提高熱凝膠多糖的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，國(guó)內(nèi)外研究人員多采用優(yōu)化發(fā)酵工藝提高熱凝膠多糖的產(chǎn)量。West[16]對(duì)菌株進(jìn)行了誘變并結(jié)合培養(yǎng)基優(yōu)化提高多糖的產(chǎn)量；Lee等[17]通過(guò)熱凝膠多糖發(fā)酵中pH控制策略提高多糖產(chǎn)量；Lawford等[18]從反應(yīng)器設(shè)計(jì)方面提高多糖的發(fā)酵產(chǎn)量；國(guó)內(nèi)自20世紀(jì)90年代開(kāi)始進(jìn)行熱凝膠多糖的研究[19]，詹曉北等主要從發(fā)酵工藝[20-21]和生物反應(yīng)器[22]方面提高多糖的產(chǎn)量。少數(shù)研究者通過(guò)菌種改造提高熱凝膠多糖產(chǎn)量，Kim等[23]對(duì)一株土壤桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，顯著提高了產(chǎn)量，劉楠[24]利用紫外誘變和李衛(wèi)旗等[25]利用60Co γ-射線誘變對(duì)菌株進(jìn)行選育，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院對(duì)從土壤中分離出的產(chǎn)熱凝膠多糖菌株進(jìn)行性能研究和發(fā)酵優(yōu)化并已投入工業(yè)生產(chǎn)[26]，但目前產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量水平仍然無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。熱凝膠多糖作為一種食品凝膠應(yīng)用時(shí)，不僅需要高的產(chǎn)量更需要好的凝膠特性，但目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)熱凝膠多糖的研究主要集中于提高產(chǎn)量，而很少關(guān)注熱凝膠多糖的凝膠特性。筆者以實(shí)驗(yàn)室保存的一株土壤桿菌為出發(fā)菌，分別對(duì)其進(jìn)行了紫外誘變和亞硝基胍誘變，利用不同誘變劑間的協(xié)同效應(yīng)，既提高了熱凝膠多糖的產(chǎn)量又改善了其凝膠特性，旨在為熱凝膠多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。 土壤桿菌（Agrobacterium sp.）714，由東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g/L，牛肉膏3.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，玉米漿1.50 g/L，瓊脂15.00 g/L，pH 7.0。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g/L，（NH4）2HPO4 5.00 g/L，玉米漿1.50 g/L，KH2PO4 1.50 g/L，MgSO4·7H2O 1.00 g/L，pH 7.0。平板篩選培養(yǎng)基：葡萄糖70.00 g/L，酵母提取物4.00 g/L，苯胺藍(lán)0.05 g/L，瓊脂15.00 g/L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50.00 g/L，玉米漿2.00 g/L，（NH4）2HPO4 2.00 g/L，KH2PO4 2.00 g/L， MgSO4·7H2O 1.00 g/L，CaCO3 2.00 g/L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌懸液制備及菌落單位計(jì)數(shù)。 從斜面挑取一環(huán)菌落接入50 mL種子培養(yǎng)基，250 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)20 h。取培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min，去上清，沉淀中加入與上清等體積生理鹽水，振蕩重懸制成菌懸液，稀釋10N倍，取0.1 mL涂布于苯胺藍(lán)平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)行計(jì)數(shù)，平板上平均菌落數(shù)記為A，則該菌懸液密度（CFU/mL）=A×10N+1。

1.2.2紫外誘變。 取900 μL菌懸液（1×108 CFU/mL）于60 mm細(xì)胞板中，進(jìn)行不同時(shí)間的紫外照射，紫外燈功率為15 W，待處理菌液與紫外燈距離為30 cm。

1.2.3亞硝基胍誘變。 稱取0.01 g亞硝基胍溶于1 mL丙酮，加9 mL去離子水，制成1 mg/mL亞硝基胍溶液，過(guò)濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取1 mL菌懸液加入50 mL錐形瓶中，加入不同體積的亞硝基胍母液及PBS緩沖液，使反應(yīng)體系中菌液的OD600為0.6， 30 ℃振蕩處理30 min，再用生理鹽水洗3次終止誘變反應(yīng)，稀釋涂布于苯胺藍(lán)平板。

1.2.4致死率計(jì)算。 誘變后菌液的活菌數(shù)為CFU1，未處理菌液的活菌數(shù)為CFU2，計(jì)算致死率。

1.2.5突變菌株的篩選。 平板篩選：待誘變菌液涂布于篩選平板上，挑選平板上菌落較大、顯色較早或顯色較深的菌落。搖瓶發(fā)酵篩選參考文獻(xiàn)[27]。

1.2.6熱凝膠多糖得率測(cè)定。 包括粗提得率和精提得率測(cè)定[27]。

1.2.7凝膠的質(zhì)構(gòu)分析。 2%熱凝膠多糖的凝膠強(qiáng)度測(cè)定參考國(guó)標(biāo)（GB 28304—2012）方法[28]。6%熱凝膠多糖的TPA分析：稱取0.9 g樣品于15 mL蒸餾水中，用高速勻漿機(jī)在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下分散5 min，將懸濁液置于95 ℃水浴加熱10 min，取出后在冷水中冷卻，用壓縮法測(cè)TPA。測(cè)定條件：Texture Analyser TA XT plus，p/50的不銹鋼圓柱探頭，測(cè)前速度1 mm/s，測(cè)中速度1 mm/s，測(cè)后速度1 mm/s，時(shí)間5 s，形變量75%，感應(yīng)力5 g。

1.2.8GPC測(cè)熱凝膠多糖的分子量。 使用Viscotek GPCmax及Viscotek TDA檢測(cè)（英國(guó)，馬爾文儀器有限公司），樣品溶于DMSO，100 ℃水浴4 h助溶；測(cè)定柱溫5 ℃，流動(dòng)相DMSO（美國(guó)天地，色譜純），流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積100 μL。

2結(jié)果與分析

2.1土壤桿菌714的紫外誘變與突變菌株篩選出發(fā)菌株714是一株產(chǎn)大量水溶性多糖而產(chǎn)少量熱凝膠多糖的菌株。為提高該菌株的熱凝膠多糖產(chǎn)量，先對(duì)該菌株進(jìn)行紫外誘變。紫外照射時(shí)間與致死率的關(guān)系見(jiàn)圖1。當(dāng)紫外照射時(shí)間為10 s時(shí)，致死率較低，在50%～60%。隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸上升。照射時(shí)間為20 s時(shí)，致死率在90%左右。當(dāng)照射時(shí)間為30 s時(shí)，致死率接近100%。試驗(yàn)選擇15和25 s 2個(gè)誘變劑量進(jìn)行紫外誘變。

誘變后的菌液稀釋涂布于苯胺藍(lán)平板上，挑選顯色較早、較深且表面較干的菌落。經(jīng)過(guò)多批紫外誘變?cè)囼?yàn)，共挑選出35株形態(tài)正突變菌，將其接種搖瓶進(jìn)一步發(fā)酵篩選。取發(fā)酵液95 ℃加熱10 min，發(fā)現(xiàn)其中14株菌發(fā)酵液可以形成凝膠，對(duì)這14株菌的發(fā)酵液進(jìn)行熱凝膠多糖粗提并計(jì)算粗提得率，結(jié)果如圖2所示。

將搖瓶發(fā)酵初篩粗提得率較高的前5株菌株再次接搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵液熱凝膠多糖粗提得率如圖3所示，出發(fā)菌株的熱凝膠多糖粗提得率為3.8 g/L，突變菌株25-19-2的粗提得率為18.8 g/L，為出發(fā)菌株的熱凝膠多糖粗提得率的4.9倍。菌株25-19-2用作后續(xù)亞硝基胍誘變的出發(fā)菌株。

2.2菌株25-19-2的亞硝基胍誘變及突變菌株篩選在紫外誘變的基礎(chǔ)上，以紫外誘變獲得的高產(chǎn)菌株25-19-2為出發(fā)菌株，進(jìn)行亞硝基胍誘變。首先考察了亞硝基胍濃度與致死率之間的關(guān)系，誘變處理時(shí)間為30 min，結(jié)果如圖4所示，致死率隨亞硝基胍濃度升高而升高。當(dāng)亞硝基胍濃度為0.1 mg/mL時(shí)，致死率較低為66.73%；亞硝基胍濃度為0.4 mg/mL時(shí)，致死率較高為91.70%；當(dāng)亞硝基胍濃度為0.6 mg/mL時(shí)，致死率已接近100%。

在不同劑量下對(duì)菌株25-19-2進(jìn)行了多輪亞硝基胍誘變，在苯胺藍(lán)平板上共挑選出344株形態(tài)正突變菌，經(jīng)搖瓶發(fā)酵初篩，誘變菌株的熱凝膠多糖粗提得率在各劑量下分布如圖5所示。當(dāng)亞硝基胍濃度低于0.1 mg/mL的低劑量下，所挑選突變菌株熱凝膠多糖粗提得率沒(méi)有顯著提高，而在較高劑量下，即亞硝基胍濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，所選突變菌株的熱凝膠多糖得率提高較多，即更有可能篩得高產(chǎn)菌株。

選取搖瓶初篩中粗提得率較高且比對(duì)照高10%的19株菌再次接搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵液熱凝膠多糖得率結(jié)果如圖6所示。最終篩選出2株高產(chǎn)菌0.5-50和0.6-45，熱凝膠多糖的粗提得率分別為26.5和26.4 g/L，為出發(fā)菌株714粗提得率（3.8 g/L）的6.9和7.0倍。菌株0.6-45和菌株0.5-50的熱凝膠多糖精提得率為19.4和18.0 g/L，表明盡管熱凝膠多糖的粗提得率相近，但菌株0.6-45的精提得率較高，說(shuō)明菌株0.6-45產(chǎn)熱凝膠多糖的能力更強(qiáng)。

2.3凝膠特性分析以市售的進(jìn)口熱凝膠多糖樣品為對(duì)照，對(duì)誘變所得高產(chǎn)菌株0.6-45和0.5-50的熱凝膠多糖凝膠性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。市售樣品的凝膠強(qiáng)度為483.784 g/cm2，菌株0.6-45和菌株0.5-50的熱凝膠多糖的凝膠強(qiáng)度偏低，分別為359.115和326.241 g/cm2，而突變菌株熱凝膠多糖的凝膠破裂強(qiáng)度和破裂位移均高于市售樣品，表明凝膠的韌性好于市售樣品。

凝膠的TPA分析結(jié)果見(jiàn)表2，誘變菌株多糖樣品凝膠的硬度、膠著性和咀嚼性都低于市售樣品，而彈性、內(nèi)聚性、恢復(fù)性都高于市售樣品，表明誘變菌株所產(chǎn)熱凝膠多糖樣品相比于市售樣品更韌、彈性更大，這與凝膠的破裂位移較大是一致的。

2.4突變菌株熱凝膠多糖分子量誘變菌株0.6-45、0.5-50所產(chǎn)熱凝膠多糖精提樣品的GPC分析結(jié)果見(jiàn)表3。 菌株0.5-50多糖的MW在1.27×106 Da左右，菌株0.6-45多糖的MW在1.57×106 Da左右，2株菌所產(chǎn)熱凝膠多糖的分子量均大于市售樣品多糖。結(jié)合上述測(cè)定的凝膠特性可以看出，多糖分子量大時(shí)所形成的凝膠偏韌。

3結(jié)論與討論

該研究首次在篩選菌株時(shí)不僅考察熱凝膠多糖的產(chǎn)量而且測(cè)定多糖的凝膠特性，采用紫外誘變結(jié)合亞硝基胍誘變以及平板篩選-搖瓶初篩-搖瓶復(fù)篩的篩選體系，篩得2株熱凝膠多糖高產(chǎn)菌0.6-45和0.5-50。菌株0.6-45和0.5-50的熱凝膠多糖粗提得率分別為26.5和26.4 g/L，分別是出發(fā)菌株714（3.8 g/L）的7.0和6.9倍。2株高產(chǎn)菌產(chǎn)熱凝膠多糖的凝膠特性差異不大，所產(chǎn)熱凝膠多糖的MW分別為1.57×106和1.27×106 Da，凝膠強(qiáng)度均略低于市售樣品，但比市售樣品凝膠更韌、彈性更大，可利用這個(gè)性質(zhì)將該多糖用于需要一定韌性和彈性的產(chǎn)品中，為熱凝膠多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)可看出熱凝膠多糖的產(chǎn)量和凝膠特性間沒(méi)有相關(guān)性，因此，菌株的誘變篩選中應(yīng)結(jié)合產(chǎn)量和凝膠特性綜合評(píng)價(jià)菌株的特性。

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