煙管菌T1原生質(zhì)體制備及菌絲再生條件優(yōu)化

高雪艷 儲巧玲 周凌峰 韓國民

摘要[目的]研究煙管菌T1（Bjerkandera adusta）原生質(zhì)體制備及菌絲再生的最佳條件。[方法]研究菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度、pH、酶濃度及酶解時間對原生質(zhì)體得率的影響，并研究再生培養(yǎng)基種類對菌絲再生的影響。[結(jié)果]在 PDA 液體培養(yǎng)基中，以28 ℃搖床培養(yǎng)3 d 的菌絲最適于該菌原生質(zhì)體制備；用0.5 mol/L KCl配制的含有15 mg/mL的溶壁酶于30 ℃下酶解3 h，獲得原產(chǎn)量最高，達118×106個/mL；RM1培養(yǎng)基再生率最高，達1.22%。[結(jié)論]該研究優(yōu)化了原生質(zhì)體制備及菌絲再生條件，為進一步研究煙管菌噬藻分子機制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞煙管菌T1；原生質(zhì)體制備；菌絲再生；優(yōu)化

中圖分類號S182文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0001-02

Abstract[Objective]To study protoplasts preparation and hyphae regeneration conditions of Bjerkandera adusta.[Method] The effect of different culture conditions （hyphae age，stabilizer and stabilizer concentration，pH， enzymatic concenfration，enzymatic hydrolysis time） on protoplasts preparation and hyphae regeneration conditions of Bjerkandera adusta was studied.[Result] The fungal mycelia cultured in the liquid PDA medium at 28 ℃ for 3 days was the most suitable for protoplast preparation.15 mg/mL soluble wall enzyme in 0.5 mol /L KCl hydrolyzing for 4 hours could generate as many as 118×106 protoplasts/mL.The RM1 medium was the preferred regeneration medium on which the regeneration rate was as high as 1.22%.[Conclusion] The study optimize the conditions of protoplasts preparation and regeneration， and provide theory basis for further study of molecular mechanism of Bjerkandera adusta.

Key wordsBjerkandera adusta T1；Protoplast preparation；Hyphae regeneration；Optimization

近年來，水華的暴發(fā)越來越頻繁，巢湖、太湖、滇池、北美的伊利湖、歐洲的波羅的海、非洲的維多利亞湖等全世界的許多主干水系均曾出現(xiàn)過嚴(yán)重的藍藻水華[1-3]。水華常釋放大量的有毒物質(zhì)——藻毒素，引起水生和陸生生物中毒，導(dǎo)致人體過敏、致癌、肝受損等，嚴(yán)重影響人類生活。利用真菌菌膜包裹并去除藍藻是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新的除藻方式[3-4]。Jia等[5-6]發(fā)現(xiàn)真菌冷杉附毛孔菌——1302BG（Trichaptum abietinum）菌絲體將活體藻細胞包裹后并將其完全分解，藻細胞在48 h內(nèi)完全消失，藻溶液變得澄清透明，并可以在較短時間內(nèi)（12 h）降解藍藻毒素。Wang等[7]分離到一株類似除藻模式的真菌Lopharia spadicea，該菌在39 h內(nèi)可以分解所有藻細胞，再生菌絲體仍具有高效的除藻能力。Han等[8]從紫金山分離得到的約60種真菌中，其中4種真菌Irpex lacteus T2b，Trametes hirsuta T24、Trametes versicolor F21a和Bjerkandera adusta T1除藻效果較好，而真菌Penicillium sp.F02、Hypocrea koningii F50和Aureobasidium pullulans F11等完全不能抑制藍藻生長。

煙管菌T1（Bjerkandera adusta）是一株消除藍藻能力較強的真菌，在染料降解及藥物污染廢水處理中具有潛在應(yīng)用價值[9- 10]，然而，國內(nèi)外對此種真菌原生質(zhì)體制備和再生的研究鮮見報道。為了進一步研究煙管菌噬藻分子機制，筆者以煙管菌T1為對象，從菌齡、酶濃度、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度、再生培養(yǎng)基等方面對原生質(zhì)體制備和再生條件進行優(yōu)化，獲得較優(yōu)的原生質(zhì)體制備和菌絲再生條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及主要試劑。煙管菌T1分離自南京紫金山[8]，溶壁酶購自廣東省微生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L；PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L；PDA再生培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，KCl 0.55 mol/L；RM1再生培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KCl 0.55 mol/L；RM2再生培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏20 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KCl 0.55 mol/L。

1.2方法

1.2.1菌體培養(yǎng)。從保存的試管斜面上挑選菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)5 d，用接種環(huán)取出部分菌絲接種至PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 、150 r/min搖動培養(yǎng)。

1.2.2原生質(zhì)體制備。取搖床培養(yǎng)3 d的真菌菌絲0.2 g，用無菌水洗滌2次，再用0.5 mol/L KCl洗滌2次，轉(zhuǎn)移至0.5 mol/L KCl滲透壓穩(wěn)定劑配制的15 mg/mL溶壁酶中，30 ℃處理4 h，每隔1 h振蕩1次，用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.3原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化。搖瓶培養(yǎng)時間為3、4、5、6、7 d的菌絲分別用于制備原生質(zhì)體；分別選用0.5 mol/L KCl、MgSO4、甘露醇、蔗糖、山梨醇作為滲透壓穩(wěn)定劑進行篩選，得到最佳滲透壓穩(wěn)定劑，在此基礎(chǔ)上篩選最適酶濃度、酶解時間及最適pH。

1.2.4原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的選擇。將配制好的原生質(zhì)體用等滲液稀釋至104 個/mL，分別取100 μL涂布在PDA再生培養(yǎng)基、RM1再生培養(yǎng)基、RM2再生培養(yǎng)基3種培養(yǎng)基上，以不含滲透壓穩(wěn)定劑的低滲培養(yǎng)基為對照，28 ℃培養(yǎng)，每組設(shè)置3個重復(fù)，計算再生率[4]。

X=B-C1A×100%

式中，X為再生率；A為原生質(zhì)體數(shù)量；B為再生菌落數(shù)量；C為對照組菌落數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1菌齡對原生質(zhì)體得率的影響在溫度28 ℃、pH 6.5、05 mol/L KCl滲透壓穩(wěn)定劑、15 mg/mL溶壁酶的條件下，分別酶解菌齡3、4、5、6、7 d的菌絲進行原生質(zhì)體制備。由圖1A可知，菌齡在3 d時原生質(zhì)體數(shù)量最多，隨后原生質(zhì)體數(shù)量明顯下降，而在第1天、第2天時由于菌絲體剛剛生長，菌絲量很少，不適合制備原生質(zhì)體。

2.2滲透壓穩(wěn)定劑種類對原生質(zhì)體得率的影響在3 d菌齡、其他條件不變的條件下，利用相同濃度的MgSO4、甘露醇、蔗糖、山梨醇分別代替KCl，分析不同種類滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體得率的影響。由圖1B可知，KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑時，原生質(zhì)體數(shù)量最多，山梨醇次之，甘露醇、蔗糖和MgSO4作為滲透壓穩(wěn)定劑時，原生質(zhì)體數(shù)量較少。

2.3滲透壓穩(wěn)定劑濃度對原生質(zhì)體得率的影響滲透壓穩(wěn)定劑濃度對原生質(zhì)體得率及原生質(zhì)體活力具有重要影響。滲透壓穩(wěn)定劑濃度過低時，原生質(zhì)體容易破裂，而滲透壓穩(wěn)定劑濃度過高時，細胞容易發(fā)生質(zhì)壁分離，且不利于原生質(zhì)體的釋放。由圖1C可知，當(dāng)滲透壓穩(wěn)定劑KCl濃度為0.5 mol/L時最優(yōu)。

2.4pH對原生質(zhì)體得率的影響pH也是影響原生質(zhì)體數(shù)量的重要因素之一。由圖1D可知，當(dāng)pH為5.5時，原生質(zhì)體數(shù)量最多，之后隨著pH的升高而降低。

2.5酶濃度及酶解時間對原生質(zhì)體得率的影響由圖1E可知，向菌絲中加入10、15、20、30 mg/mL 溶壁酶后，濃度為15、20、30 mg/mL時，原生質(zhì)體數(shù)量無顯著差異，但均比10 mg/mL的高。由圖1F可知，隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體數(shù)量逐漸增多，酶解時間3 h時原生質(zhì)體數(shù)量最多，達118×106 個/mL。隨著酶解時間的進一步延長，原生質(zhì)體數(shù)量呈下降趨勢。

2.6再生培養(yǎng)基種類對煙管菌T1菌絲再生的影響制備的原生質(zhì)體在不同再生培養(yǎng)基上經(jīng)過12～16 h靜置培養(yǎng)，可長出細胞壁并萌發(fā)菌絲。分別以PDA再生培養(yǎng)基、RM1再生培養(yǎng)基、RM2再生培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，研究不同再生培養(yǎng)基對煙管菌T1菌絲再生的效果。由圖2可知，RM1培養(yǎng)基中再生率最高，達1.22%，RM2培養(yǎng)基次之，PDA再生培養(yǎng)基的再生效果最差。

3結(jié)論與討論

利用真菌菌絲體抑制并消除活體藻細胞是一種新型的真菌-藍藻相互作用，煙管菌T1是筆者所在課題組前期分離獲得的一株具有較強分解能力的抑藻真菌。唐黎等[11]利用煙管菌XX-2處理銅綠微囊藻廢水，結(jié)果表明，煙管菌XX-2具有抑藻能力。任申榮[12]對煙管菌T1抑藻過程進行轉(zhuǎn)錄組分析，獲得大量的差異分解酶基因，而制備大量高質(zhì)量的原生質(zhì)體是對該真菌抑藻關(guān)鍵基因功能進一步驗證的前提和基礎(chǔ)。

不同種類微生物細胞壁組成差異較大，因此制備原生質(zhì)體的最佳條件也有較大差異。不同培養(yǎng)時間的菌絲，其細胞壁組成也有差異，老的菌絲細胞壁上沉積有不易被酶降解的物質(zhì)，從而大大減少了原生質(zhì)體的形成和釋放，因此生長時間較短的幼嫩菌絲比較適合用于原生質(zhì)體的制備[13]。煙管菌T1菌齡在3 d時原生質(zhì)體數(shù)量最多，而云芝F21a在4 d時原生質(zhì)體數(shù)量最多[4]。通過對其他參數(shù)進一步優(yōu)化，原生質(zhì)體產(chǎn)量達1.18×106個/mL，但比云芝F21a及古尼蟲草小孢變種原生質(zhì)體制備效果差[4，13]，而煙管菌T1再生率達122%，略高于云芝 F21a再生率（0.74%），這可能是由于不同菌株遺傳背景差異造成的。該試驗通過對煙管菌T1原生質(zhì)體制備和再生條件進行研究，獲得了該菌制備和再生的最佳條件，為進一步開展相關(guān)基因功能驗證奠定基礎(chǔ)。

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