應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化辣木γ—氨基丁酸富集工藝研究

段雙梅 趙恒 馬燕 蘇小琴 萬晶瓊 李振華 張石先 張磊 趙明

摘 要 通過富集方式和干燥方法的單因素實驗，最陡爬坡試驗和響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化辣木鮮葉γ-氨基丁酸（γ- aminobutyric acid，GABA）的富集工藝。建立的辣木鮮葉中GABA最適富集條件為辣木鮮葉在45 ℃下，真空處理34 h，然后50 ℃干燥。該條件處理的辣木GABA含量為（19.70±0.16）mg/g，是對照的2.63倍。

關(guān)鍵詞 辣木；真空處理；γ-氨基丁酸；響應(yīng)面設(shè)計

中圖分類號 TS201 文獻標識碼 A

Abstract The γ-aminobutyric acid（GABA）enrichment technology in Moringa was optimized through single factor experiments， the steepest ascent experiment and a response surface design. An optimized technology was developed as follow： The fresh leaves of Moringa were treated in vacuum at 45 ℃ for 34 h and dired at 50 ℃. The content of GABA in Moringa was（19.70±0.16）mg/g， it was 2.63 times than that of the control. This study would provide technical support for the development of GABA-rich Moringa food.

Key words Moringa oleifera； vacuum treatment； γ-aminobutyric acid； response surface designs

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.027

辣木（Moringa oleifera）為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa），多年生速生樹木，最早產(chǎn)于印度[1]。其根、莖、葉、花、種子、樹枝及樹皮等均含有豐富的營養(yǎng)及藥用成分，如高蛋白質(zhì)、高鈣、維生素、氨基酸等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)辣木具有活化細胞、增強免疫力、保護心臟、降低血脂、預(yù)防癌癥等保健功效[4]。2012年，中國衛(wèi)生部批準辣木鮮葉為新資源性食品（2012年第19號）。近年來，隨著人們對健康的日漸重視和大健康產(chǎn)業(yè)的興起，辣木的營養(yǎng)價值、功能成分的研究及健康產(chǎn)品的開發(fā)受到廣泛關(guān)注[5]。隨著種植面積不斷擴大以及進入豐產(chǎn)期，辣木產(chǎn)量將極大地增加，精深加工將是產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

GABA是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中樞中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[6]，還具有降血壓[7-8]、降低膽固醇[9-11]、改善腦機能、抗驚厥、預(yù)防和調(diào)治癲癇[12]、活化腎肝功能、促進精子受精等多種生理活性及保健功能[13-14]。隨著人年齡增長及精神壓力增大會導(dǎo)致 GABA的積累異常困難，需通過日常飲食補充才能有效地改善這種狀況[15]。2009年，中華人民共和國衛(wèi)生部批準GABA為可用于食品生產(chǎn)加工的新資源食品[16]。目前，GABA功能性食品、保健品的研究開發(fā)已成為食品領(lǐng)域的研究熱點之一。

關(guān)于GABA食品的研究與開發(fā)火熱，主要有3種方式加工GABA食品，第一是通過真空等物理方式處理食品原料。如：日本、中國、斯里蘭卡等國[17]有報道，通過厭氧或紅外線處理鮮葉，加工GABA綠茶[18]、紅茶[19]、普洱茶[20]、白茶[21]、桑葉[22]等產(chǎn)品。又如，通過處理原料加工富含GABA萌芽糙米[23]、玉米[24]、米胚芽[25-26]、 GABA米糠[27]等產(chǎn)品。第二是應(yīng)用產(chǎn)GABA的微生物發(fā)酵加工富含GABA的食品。如應(yīng)用產(chǎn)GABA微生物發(fā)酵加工富含GABA的豆豉[28]、醬和腐乳[29]和四川泡菜[30]等發(fā)酵食品。此外，乳酸菌參與酸奶、奶酪的發(fā)酵，同時部分乳酸菌也能產(chǎn)生GABA，因此將二者結(jié)合可以加工出富含GABA的發(fā)酵乳制品。如Wang[31]、Nomur[32]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用乳酸菌發(fā)酵加工富含GABA奶酪。第三是外源添加加工富含GABA的食品。已有加工富含GABA的番茄紅素[33]、桑葉豆腐腦[34]和水晶粉絲[35]等專利。

盡管有很多研究和專利開展富含GABA的食品研究[35-38]，但未見富含GABA的辣木研究報道?；谏罴庸ぎa(chǎn)品是解決辣木產(chǎn)能過剩的重要途徑，以及GABA產(chǎn)品具有的廣闊市場前景，將兩種新資源性食品原料結(jié)合，研究加工富含GABA的辣木產(chǎn)品，具有重要理論與實際意義。為此，筆者研究辣木GABA富積條件，為富含GABA的辣木產(chǎn)品加工提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 辣木樣品 本研究所用材料，分別購置于云南曲靖與廣西南寧。其中富積方式、干燥方式以及爬坡實驗的材料購于云南曲靖；響應(yīng)面及驗證試驗所用的辣木鮮葉購自廣西南寧。

1.1.2 主要試劑 色譜純甲醇、乙腈為美國TEDIA試劑公司產(chǎn)品；乙酸、四氫呋喃、三乙胺、氯仿、無水乙酸鈉、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 應(yīng)用安捷倫1200系列HPLC系統(tǒng)，包括LC-20AB溶劑輸送單位，SIL-20A自動進樣器，CTO-20A柱溫箱（40 ℃），G1321A的熒光檢測器（激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm），LC Ver1.23工作站。色譜柱為Agilent Hypersil AA-ODS（2.1×200 mm，5 μm，U.S.A），配有保護柱為Hypersil ODS柱（20×2.1）（安捷倫，美國）。

1.2 方法

1.2.1 辣木GABA提取 辣木干燥葉粉碎過60目篩，稱取1.0 g樣品，用量筒量取70 ℃水100 mL，加入三角瓶中，沸水浴提取1 h，過濾，定容至100 mL。取1 mL濾液，加入200 μL氯仿，靜置5 min，離心5 min（4 ℃ 12 000 r/min），取上清液。上清液用0.45 μm硝酸纖維素膜過濾，濾液為待測液。

1.2.2 辣木GABA富集工藝優(yōu)化

（1）富集方式單因素試驗。根據(jù)文獻報道和實驗室條件，各稱取辣木鮮葉100 g，分別置于凍干機（FD5-series，美國金西盟國際集團）中9 h、真空干燥箱（DZF-6020，上海博訊實業(yè)有限公司）中真空（0.07 MPa）處理9 h以及自制容器中充氮處理9 h。每種處理重復(fù)2次，處理之后，按下述優(yōu)化的干燥方式干燥，按方法提取測定樣品GABA含量，研究富集方式對辣木GABA含量的影響。

（2）干燥方式單因素試驗。各稱取辣木鮮葉100 g，分別用鼓風50 ℃烘干、鼓風60 ℃烘干、鼓風80 ℃烘干、自然陰干（20 ℃）和微波干燥[G70F23N1P-M8（S0），廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司]，每種干燥方式重復(fù)2次，干燥之后按方法提取并測定GABA含量，研究干燥方式對辣木GABA含量的影響。

（3）爬坡試驗。在確定處理方式的基礎(chǔ)上，參考GABA茶葉[39]等加工工藝，各以100 g鮮葉，開展真空處理溫度/時間為25 ℃/6 h、30 ℃/12 h、35 ℃/18 h、40 ℃/24 h、45 ℃/30 h、50 ℃/36 h的爬坡實驗。每個處理重復(fù)2次。干燥后測定GABA含量，初步研究溫度與時間對辣木GABA含量的影響。

（4）響應(yīng)面設(shè)計?；谂榔略囼灥幕A(chǔ)，根據(jù)中心復(fù)合原理，利用JMP 10.0軟件以GABA的生成量（Y）為響應(yīng)值，溫度（X1，40～50 ℃）和時間（X2，24～36 h）為因子水平，中心點數(shù)為2個，重復(fù)次數(shù)為1次，進行響應(yīng)曲面中心復(fù)合設(shè)計。每個實驗處理重復(fù)2次，按方法干燥、提取測定樣品的GABA含量。以真空處理溫度、時間為考察因素，以辣木中GABA含量為指標進行曲面三維圖的繪制，預(yù)測最佳處理溫度、時間及GABA含量。并根據(jù)預(yù)測條件重復(fù)2次實驗，測定含量，驗證響面優(yōu)化加工工藝。

1.2.3 辣木GABA含量測定

（1）色譜條件。采用自動進樣器進行OPA柱前在線衍生，衍生程序為抽取硼酸緩沖液5.0 μL，抽取衍生試劑（OPA）0.2 μL，洗針，抽取1.0 μL標液或樣品，混合9次后進樣。流動相A為25 μmoL無水乙酸鈉、0.018%三乙胺、0.3%四氫呋喃，pH7.2；流動相B為40%乙腈、40%甲醇和0.1%冰醋酸。洗脫梯度程序：0～1 min，B液從5%線性梯度增加至15%；1～11 min，B液從15%線性梯度增加至18%；11～25 min，B液從18%線性梯度增加至60%；25～27 min，B液由60%線性梯度增加至100%B；27～31.5 min，B液保持在100%；31.5～31.9 min，B液由100%降低至5%；32 min程序停止；以5% B液后運行平衡6 min；流速為0.5 mL/min。柱溫為40 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每一樣品提取2次，每個提取液測定2次，以mean±SD表示平均值。實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間采用最小顯著差數(shù)法進行兩兩比較，p<0.05為差異顯著。所有的統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)處理應(yīng)用軟件IBM spss statistics 22（SPSS Inc.， Chicago， IL）進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA辣木茶加工工藝優(yōu)化

2.1.1 富集方式的優(yōu)化 應(yīng)用HPLC測定3種方式處理的辣木樣品的GABA含量，均值與方差分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，真空處理加工的辣木GABA含量顯著高于其他處理（p<0.05）。因此，本研究后續(xù)試驗對辣木的富集方式均采用真空處理。

2.1.2 干燥方式的優(yōu)化 按方法進行干燥方式單因素實驗，應(yīng)用HPLC測定5種干燥方式的辣木樣品GABA的含量，部分測定色譜圖見圖2。GABA保留時間為22.373 min，且與其他氨基酸基線分離。各干燥方式樣品的平均值與比較結(jié)果見圖3。由圖3可知，自然干燥和50 ℃干燥的辣木GABA含量無顯著差異（p>0.05），但是二者的含量顯著高于其他處理方式（p<0.05）。自然干燥耗時長、易受天氣制約、不易控制，故本研究的后續(xù)實驗中選擇50 ℃鼓風烘干。

2.1.3 最陡爬坡試驗結(jié)果 各辣木樣品中GABA含量，均值與方差分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，在溫度40～45 ℃和時間24～30 h范圍，GABA含量隨溫度升高和時間增加而升高。在溫度/時間為45 ℃/30 h時達到拐點；在溫度/時間為45～50 ℃和30～36 h范圍內(nèi)，GABA含量隨著溫度升高和時間增加而緩慢降低。因此，通過最陡爬坡試驗確定了后續(xù)實驗中，真空處理的溫度為40～50 ℃，時間為24～36 h。

2.1.4 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果 按方法進行響應(yīng)面實驗設(shè)計處理，測定各處理辣木樣品GABA含量，結(jié)果見表1。對表1中GABA實測值的數(shù)據(jù)用最小二乘法擬合的二次多項方程，進行多元回歸擬合，獲得Y對處理溫度（X1）和處理時間（X2）的二次多項回歸方程：

Y=19.51-0.073×[（X1-45）/5]+1.45×[（X2-30）/6]-0.63×[（X1-45）/5]×[（X2-30）/6]-4.64×[（X1-45）/5]2-0.84×[（X2-30）/6]2，式中Y為預(yù)測響應(yīng)值。

應(yīng)用F檢驗檢測響應(yīng)曲面設(shè)計的多元回歸方程及失擬顯著性檢驗兩者的有效性。從響應(yīng)面回歸方程的方差與均值分析，F(xiàn)>0.01（5，14）、p<0.01，F(xiàn)極顯著。F檢驗結(jié)果表明該響應(yīng)面模擬效果顯著，其矯正決定系數(shù)R2=0.97，表示此模型可以解釋97%的GABA總變異。

2.1.5 響應(yīng)面兩因素交互作用分析 通過JMP 10.0軟件分析溫度和時間對辣木樣品中GABA含量的影響，并繪制交互作用圖（圖5）和響應(yīng)曲面圖（圖6）。由圖5、6可知，真空處理的時間和溫度2個因素間的交互作用極顯著。隨著溫度的升高，辣木樣品GABA含量逐漸增加，且在真空處理時間33.43 h、溫度44.69 ℃時達到最大值為20.23 mg/g，隨后緩慢減少。即真空處理的時間34.43 h、溫度44.69 ℃，在此條件下辣木茶中GABA富集量為20.23 mg/g。

2.2 模型的優(yōu)化和驗證

應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計分析得到辣木中GABA的富積最優(yōu)條件為：溫度44.69 ℃、時間34.43 h，辣木中GABA含量可達20.23 mg/g。為了檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性，分別稱取辣木鮮葉1 000 g，選擇處理溫度45 ℃、處理時間34 h，重復(fù)2次，真空處理試驗。測定發(fā)現(xiàn)GABA的平均為（19.70±0.16）mg/g。綜上優(yōu)化發(fā)現(xiàn)辣木中GABA富集的工藝如下：鮮葉45 ℃真空處理34 h，50 ℃鼓風干燥。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)辣木對糖尿病、高血壓、心血管病、肥胖癥、免疫力低下、壞血病、腫瘤等疾病都有顯著的治療作用[40]。由于辣木的保健功能顯著，以及批準成為新資源食品，國內(nèi)辣木食品的開發(fā)如火如荼，如：辣木片劑、辣木綠茶、辣木含片、辣木面包、辣木營養(yǎng)豆腐、辣木營養(yǎng)飲料、辣木保健靈芝等產(chǎn)品，成為補充人體營養(yǎng)、增強免疫力、預(yù)防疾病、提高生活品質(zhì)、保證身體健康的產(chǎn)品。隨著健康中國成為國家戰(zhàn)略，具有多種保健功能的辣木和辣木產(chǎn)品將成為大健康產(chǎn)品的重要組成部分，具有廣闊的市場前景。

GABA是一種具有多種生理功能的新資源食品，其在藥品、食品、保健品等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用[41]。本研究創(chuàng)新地將2種新資源食品結(jié)合起來，研究加工富含GABA的辣木產(chǎn)品，加工的產(chǎn)品同時具有辣木和GABA的保健功能，因此可能具有廣闊的市場前景。但是加工的富含GABA辣木產(chǎn)品的保健功能需要進一步研究。

GABA廣泛分布于植物中，具有抵抗逆境的功能。一般來講，植物組織中的GABA含量較低，約0.03～2.00 μmoL/g FW，但在不同外界應(yīng)激條件包括熱擊、機械震動、缺氧、植物激素等刺激后可成倍增加。例如，缺氧條件可使水稻幼苗的GABA含量提高到8 μmol/g FW；大豆葉片的GABA含量在機械刺激、冷擊5 min后，可增加20～40倍，上升到1～2 μmol/g FW[42]。利用植物對外界的應(yīng)激性原理，可以對植物GABA進行富集，如通過厭氧處理、浸泡處理、紅外線照射、低溫沖擊、葉面噴施等技術(shù)處理茶葉鮮葉，加工GABA茶葉[43]。其中厭氧、低溫、真空等以物理方法提高GABA含量，具有工藝簡單、易于后續(xù)處理、天然等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于茶葉、桑葉等植物材料的GABA加工[44-45]。植物富集法主要通過改變溫度、壓力、時間、研磨和氧濃度等因素增加GABA含量。根據(jù)相關(guān)報道，鄒鋒揚等[46]真空處理鐵觀音品種茶樹鮮葉，GABA含量為2.11 mg/g；王芳等[21]真空處理白茶品種茶樹鮮葉，GABA含量為2.41 mg/g；邊偉等[47]采用O2 ∶ CO2 ∶ N2=1 ∶ 1 ∶ 8處理桑葉8 h，GABA含量為2.28 mg/g；何娜等[48]低溫處理結(jié)球甘藍內(nèi)葉，GABA含量為2.41 mg/g；林智等[49]真空處理茶鮮葉，GABA含量為3.33 mg/g；陳慶等[50]真空/氧氣交替處理桑葉，GABA含量為4.48 mg/g；朱云輝等[51]用苦蕎子在黑暗培養(yǎng)箱中發(fā)芽，測定苦蕎子葉GABA的含量為0.23 mg/g。與已有研究相比，本研究首次采用響應(yīng)面設(shè)計的方法對GABA富積工藝中的溫度與時間這兩個關(guān)鍵因素進行了優(yōu)化，不僅優(yōu)化的工藝與已有報道不同，且GABA含量達到了19.70 mg/g。

植物體中GABA主要由GABA支路合成和轉(zhuǎn)化：由谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxy-lase， GAD， EC 4.1.1.15）催化谷氨酸脫羧合成GABA，GABA又在GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase， GABA-T， EC2.6.1.19）的作用下和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用形成琥珀酸半醛進入三羧酸循環(huán)[52]。其中GABA 轉(zhuǎn)氨酶在厭氧情況下活性降低，而谷氨酸脫羧酶則在厭氧、有氧的條件下，均有活性。本研究選擇真空處理辣木鮮葉，就是利用厭氧條件下，谷氨酸脫羧酶將谷氨酸脫羧合成GABA，而GABA轉(zhuǎn)氨酶活性降低，促使GABA累積的原理。本研究優(yōu)化的溫度，是辣木谷氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度，優(yōu)化的時間是谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸形成GABA的反應(yīng)持續(xù)時間，與谷氨酸脫羧酶活性持續(xù)時間以及辣木的谷氨酸含量有關(guān)。

本研究應(yīng)用響應(yīng)面技術(shù)優(yōu)化了辣木GABA富積工藝，研究中發(fā)現(xiàn)原料對產(chǎn)品GABA含量影響顯著。本研究所用材料，分別購置于云南曲靖與廣西南寧，研究中發(fā)現(xiàn)購于云南曲靖的辣木鮮葉，處理后GABA含量低于廣西南寧樣品。推測辣木品種、生長地區(qū)以及時間導(dǎo)致辣木鮮葉GABA以及谷氨酸含量差異，而這種差異決定了富積之后的辣木產(chǎn)品中GABA含量。因此，開展辣木GABA產(chǎn)品加工，首先需要檢測辣木原料的GABA含量，本課題組正在檢測不同產(chǎn)地的辣木GABA含量。

總之，通過干燥方式、富集方式的單因素實驗，最陡爬坡實驗、響應(yīng)面設(shè)計與驗證，本研究建立了以辣木鮮葉為原料，45 ℃真空處理34 h，50 ℃熱風干燥的工藝，該工藝處理的辣木GABA含量達19.70 mg/g左右，為今后開發(fā)高含量的GABA辣木食品提供了理論依據(jù)。

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