廣西豬源致病性大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性變化分析

馮世文　李軍　潘艷　彭昊　胡帥　楊威　陳澤祥

摘要：【目的】分析2007和2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性差異，為獸醫(yī)臨床用藥防治豬大腸桿菌病提供參考依據(jù)?！痉椒ā?016年初從廣西25個豬場采集腹瀉仔豬的腸內(nèi)容物、直腸棉拭子或腸系膜淋巴結(jié)等200份樣品，分離大腸桿菌后進(jìn)行致病力試驗(yàn)，選取103株致病性大腸桿菌用于體外藥敏試驗(yàn)，將藥敏試驗(yàn)結(jié)果與2007年的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行對比分析。【結(jié)果】從腹瀉仔豬的體內(nèi)共分離獲得大腸桿菌178株，分離率為89%，其中有143株大腸桿菌可致試驗(yàn)小鼠死亡。與2007年相比，2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對50%的抗菌藥物（9種）的敏感率上升，50%的抗菌藥物的敏感率下降，上升最明顯的為壯觀霉素，升高34.9%，下降最明顯的為氟苯尼考，降低46.9%；除頭孢曲松和強(qiáng)力霉素的中介率與2007年相比基本無變化外，其余16種抗菌藥物的中介率均降低，最明顯的為頭孢拉啶，降低55.2%；耐藥率降低的抗菌藥物只有阿米卡星、壯觀霉素和強(qiáng)力霉素3種，降低12.3%～15.5%，耐藥率升高的抗菌藥物有15種，上升率為1.2%～62.1%，其中阿莫西林上升62.1%，氟苯尼考上升57.0%。耐藥譜方面，2007年以5～11重耐藥為主，占受試菌總數(shù)的75.7%，2016年以11重耐藥以上為主，占74.8%。【結(jié)論】當(dāng)前廣西豬源致病性大腸桿菌以廣譜耐藥為主，敏感性降低，中介率降低，耐藥率明顯升高，生產(chǎn)中可選用阿米卡星和壯觀霉素進(jìn)行豬大腸桿菌病防治。

關(guān)鍵詞： 豬源致病性大腸桿菌；抗菌藥物；耐藥性

中圖分類號： S852.723 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0350-07

Abstract：【Objective】The present study determined antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli isolated from pig in Guangxi in 2007 and 2016，so as to provide a foundation for the use of antimicrobials in veterinary clinical medication for prevention and treatment of porcine colibacillosis. 【Method】Two hundred samples of intestinal content， rectum cotton swab， or mesentery lymph node of diarrhea piglets were collected from twenty-five pig farms in Guangxi to isolate E. coli， pathogenicity of the isolates was detected. One hundred and three pathogenic strains were selected for in vitro antimicrobial sensitivity test. The results were compared with those in 2007. 【Result】One hundred and seventy-eight E. coli strains were isolated from the samples with isolation rate of 89%， one hundred and forty-three strains of them were deadly to lab mice. In terms of drug susceptibility of pathogenic E. coli from pig， its drug susceptibility toward 50% of antimicrobials（nine kinds） increased while the other 50% decreased in 2016 compared to 2007. The increase of drug susceptibi-

lity of spectinomycin was the maximum（34.9%） while the decrease of drug susceptibility of florfenicol was the maximum（46.9%）. Intermediary rate of ceftriaxone and doxycycline remained stable， but intermediary rate of other 16 antimicrobials decreased in 2006 compared to 2007. The most obvious one is cephradine， which reduced by 55.2%. The statistical results of resistance rate showed that only three kinds of antimicrobial（amikacin， spectinomycin and doxycycline） decreased by 12.3%-15.5%，while the other fifteen kinds of antimicrobial increased by 1.2%-62.1%，and resistance rate of amoxicillin increased by 62.1%， resistance rate of florfenicol increased 57.0%. The results showed that， 75.7% of the strains isolated in 2007 were resistant to 5-11 kinds of antimicrobial agents， while 74.8% of the strains isolated in 2016 were resistant to 11 kinds of antimicrobial agents. 【Conclusion】At present， pathogenic E. coli isolated from pig in Guangxi are mainly broad spectrum resistant， drug susceptibility and intermediary rate decrease and drug resistance rate increases greatly. Amikacin and spectinomycin can be used in production for prevention and treatment of porcine colibacillosis.

Key words： porcine pathogenic Escherichia coli； antimicrobial； drug resistance

0 引言

【研究意義】豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起以腹瀉為主的仔豬腸道傳染?。▌粼龋?004），依據(jù)發(fā)病仔豬的臨床癥狀、病理剖檢變化及流行病學(xué)，可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病等。仔豬發(fā)病后發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，并導(dǎo)致脫水，出現(xiàn)敗血癥或繼發(fā)其他疾病，仔豬發(fā)育受阻，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失（崔赟等，2008）。目前抗菌藥物仍是治療豬大腸桿菌病的首選，其在養(yǎng)豬業(yè)的廣泛持續(xù)使用，使得大腸桿菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性（孫麗等，2008；曾祥煉等，2015），藥物治療效果不顯著，仔豬經(jīng)常反復(fù)發(fā)病，給豬大腸桿菌病的防控帶來新的挑戰(zhàn)。因此，調(diào)查分析豬源致病性大腸桿菌的耐藥性變化，對獸醫(yī)臨床科學(xué)用藥防治豬大腸桿菌病，減緩細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，國內(nèi)外已有不少學(xué)者對豬源大腸桿菌的耐藥情況進(jìn)行研究。張廣群等（2006）對采自河北、北京和天津的55株豬源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)菌株對鏈霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氟苯尼考的耐藥率分別為80.0%、53.3%、86.7%、51.7%、51.7%和55.0%；多重耐藥顯示，1～5耐和10～15耐均有12株，6～10耐有36株。杜向黨等（2008）通過調(diào)查河南地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)菌株對阿米卡星最敏感，耐藥率僅為2.0%，對阿莫西林的耐藥率為56.5%，對鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星等高度耐藥，以17～23耐藥株為主。阮祥春等（2013）調(diào)查發(fā)現(xiàn)安徽地區(qū)大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林和多粘菌素B的耐藥率高達(dá)70.0%以上。郭瀟木等（2014）調(diào)查廣東地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，共存在128種耐藥譜型，分離菌株對氨芐西林、復(fù)方新諾明和四環(huán)素高度耐藥。王基偉等（2014）通過調(diào)查長春地區(qū)的大腸桿菌耐藥情況，發(fā)現(xiàn)菌株對四環(huán)素和氨芐西林耐藥最嚴(yán)重（83.63%和52.72%）。Smith等（2014）對比了越南和澳大利亞豬源大腸桿菌的藥物耐藥性，發(fā)現(xiàn)二者對氨芐西林、四環(huán)素和磺胺類藥物高度耐藥，越南分離菌株主要表現(xiàn)為對7種以上抗菌藥物耐藥，其中10重耐藥的菌株占15%，而4重耐藥以下的菌株僅占10%；澳大利亞分離株主要表現(xiàn)為對3～7種抗菌藥物耐藥。王敏等（2016）對貴州2013～2014年大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株對氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素和氟苯尼考的耐藥率分別為87.19%、81.10%、53.66%、53.05%、47.56%和21.95%，且大多為多重耐藥。Jahanbakhsh等（2016）調(diào)查了85株分離自1997～2012年的豬源致病大腸桿菌的藥敏情況，發(fā)現(xiàn)菌株對頭孢噻呋、頭孢曲松和氨芐西林的耐藥率為100.0%，對頭孢西丁和阿莫西林的耐藥率為96.5%，對鏈霉素和四環(huán)素的耐藥率為89.4%，對卡那霉素和慶大霉素的耐藥率分別為50.6%和40.0%。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于廣西地區(qū)豬源致病性大腸桿菌耐藥性的相關(guān)研究報(bào)道較少，特別是針對耐藥性變化的分析至今未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對2016年廣西豬源致病性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定和體外藥敏試驗(yàn)，對比分析2007和2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性差異，豐富廣西地區(qū)豬源致病性大腸桿菌耐藥性變化的數(shù)據(jù)，為獸醫(yī)臨床用藥防治豬大腸桿菌病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

本課題組在2007年對廣西10個縣（市）56個豬場進(jìn)行了豬大腸桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查，共分離出致病性大腸桿菌103株（謝永平等，2010）。2016年初從廣西25個豬場采集腹瀉仔豬的腸內(nèi)容物、直腸棉拭子或腸系膜淋巴結(jié)等樣品共200份，用于分離致病性大腸桿菌。試驗(yàn)小白鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血平板和MHA培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；微量生化反應(yīng)管和18種受試抗菌藥物的藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1. 2 細(xì)菌分離和生長形態(tài)觀察

無菌操作將采集的樣品分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)陽性用麥康凱培養(yǎng)基劃線分離，挑取單個典型菌落接種于肉湯增菌培養(yǎng)，保種。取上述各培養(yǎng)基上24 h培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。另取分離菌株純培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)肉湯、麥康凱、伊紅美藍(lán)、血平板等培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其培養(yǎng)特性。

1. 3 生化試驗(yàn)

取分離菌株純培養(yǎng)物分別接種于微量生化反應(yīng)管，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)觀察3～5 d，觀察分離菌的生化特性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）進(jìn)行鑒定。

1. 4 致病性試驗(yàn)

將培養(yǎng)特性和生化特性符合大腸桿菌的分離菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，用滅菌生理鹽水將細(xì)菌懸液調(diào)整至3×108 CFU/mL（0.5麥?zhǔn)媳葷幔?，?.02 mL/g的劑量腹腔注射試驗(yàn)小白鼠，對照組小白鼠按同樣劑量腹腔注射滅菌生理鹽水，每個菌株注射試驗(yàn)小白鼠3只，做好標(biāo)記。連續(xù)7 d觀察小白鼠的發(fā)病和死亡情況，剖檢死亡小白鼠，并取其臟器接種于麥康凱培養(yǎng)基，用于接種菌的回收試驗(yàn)，將培養(yǎng)特性和生化特性符合大腸桿菌的菌株判定為致病性大腸桿菌。

1. 5 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株數(shù)量與2007年相同，為103株。選用頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等7類共18種常用抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，采用美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）推薦的K-B紙片法。將致病性大腸桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，用滅菌生理鹽水將細(xì)菌懸液調(diào)整至3×108 CFU/mL（0.5麥?zhǔn)媳葷幔?.2 mL均勻鋪于MHA培養(yǎng)基，將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑（Ф），按照Ф≥20 mm為敏感、15 mm≤Ф<20 mm為中介、Ф<15 mm為耐藥的標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏結(jié)果。統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)菌株的抗菌藥物敏感性情況，并與2007年試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大腸桿菌分離鑒定

分離菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中快速生長、均勻渾濁，在麥康凱培養(yǎng)基上形成邊緣整齊、隆起、光滑、濕潤的紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成邊緣整齊、隆起、帶有黑色金屬光澤的菌落。純化培養(yǎng)的分離菌經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可觀察到兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌。分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖，能使用鼠李糖、木糖和海藻糖，吲哚和甲基紅試驗(yàn)呈陽性，V-P試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)呈陰性。依據(jù)分離菌株的培養(yǎng)特性、革蘭氏染色形態(tài)和生化特性，共分離大腸桿菌178株，分離率為89%。

2. 2 致病力試驗(yàn)結(jié)果

將178株大腸桿菌經(jīng)腹腔注射小白鼠，試驗(yàn)結(jié)束共觀察到其中的143株大腸桿菌可使試驗(yàn)小白鼠死亡，對照試驗(yàn)小白鼠健康存活。經(jīng)接種菌回收試驗(yàn)，從死亡小白鼠臟器分離到的病原菌為大腸桿菌。選取103株致病性大腸桿菌用于后續(xù)的藥敏試驗(yàn)。

2. 3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2007和2016年廣西豬源致病性大腸桿菌的抗菌藥物敏感性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

2. 3. 1 2007年廣西豬源致病性大腸桿菌的抗菌藥物敏感性 由圖1可知，2007年廣西豬源大腸桿菌敏感率較高的抗菌藥物為頭孢曲松（84.5%）、頭孢西?。?3.1%）和氟苯尼考（62.4%），敏感率較低的抗菌藥物為青霉素G（0）、利福平（1.0%）和強(qiáng)力霉素（1.5%）；中介率較高的抗菌藥物為頭孢拉啶（60.1%）、頭孢氨芐（58.2%）和阿莫西林（52.4%），中介率較低的抗菌藥物為青霉素G（3.6%）、利福平（4.0%）和強(qiáng)力霉素（4.6%）；耐藥率較高的抗菌藥物為青霉素G（96.4%）、利福平（95.0%）和強(qiáng)力霉素（93.9%），耐藥率較低的抗菌藥物為頭孢曲松（3.9%）、頭孢西?。?.9%）和頭孢拉啶（11.7%）。敏感率在50.0%以上的有3種抗菌藥物，占受試抗菌藥物數(shù)的16.7%，耐藥率在50.0%以上的有6種藥物，占33.3%。

2. 3. 2 2016年廣西豬源致病性大腸桿菌的抗菌藥物敏感性 由圖2可知，2016年廣西豬源大腸桿菌敏感率較高的抗菌藥物為頭孢西?。?4.5%）、阿米卡星（75.7%）和壯觀霉素（56.3%），敏感率較低的抗菌藥物為青霉素G（0）、利福平（1.9%）和阿莫西林（2.9%）；中介率較高的抗菌藥物為壯觀霉素（13.6%）、頭孢曲松（11.7%）、環(huán)丙沙星（10.7%）和慶大霉素（10.7%），中介率較低的抗菌藥物為阿莫西林（0）、青霉素G（1.0%）和利福平（1.9%）；耐藥率較高的抗菌藥物為青霉素G（99.0%）、阿莫西林（97.1%）和利福平（96.2%），耐藥率較低的抗菌藥物為頭孢西丁（11.6%）、阿米卡星（16.5%）和壯觀霉素（30.1%）。敏感率在50.0%以上的有4種抗菌藥物，占22.2%，耐藥率在50.0%以上的有15種抗菌藥物，占83.3%。

2. 3. 3 耐藥譜 從圖3可看出，2007年分離的廣西豬源致病性大腸桿菌主要以5～11重耐藥為主，共有78株，占受試菌總數(shù)的75.7%，其中10重耐藥15株（14.6%）、6重耐藥12株（11.7%）、8重耐藥12株（11.7%）和7重耐藥11株（10.7%）；12重耐藥及以上的菌株數(shù)為25株，占24.3%；最高耐藥數(shù)為16重耐藥，共3株，占2.9%。2016年分離的廣西豬源致病性大腸桿菌中，5～10重耐藥共有26株，占受試菌總數(shù)的25.2%；以11重耐藥以上的菌株為主，共77株，占74.8%，其中12重耐藥17株（16.5%）、13重耐藥15株（14.6%）、14重耐藥12株（11.7%）和16重耐藥11株（10.7%）；最高耐藥數(shù)為17重耐藥，共4株，占3.9%。

2. 3. 4 豬源致病性大腸桿菌對抗菌藥物耐藥性能的對比 敏感性方面：與2007年相比，2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對頭孢氨芐、頭孢拉啶、頭孢西丁、阿米卡星等9種抗菌藥物的敏感率升高0.9%～34.9%（絕對值，下同），其中壯觀霉素的敏感率上升最明顯，從21.4%升至56.3%，上升了34.9%；其次為阿米卡星，敏感率由48.5%升至75.7%，上升了27.2%。敏感率明顯降低的有頭孢曲松、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考等9種抗菌藥物，降低0.9%～46.9%，其中敏感率降低最明顯的為氟苯尼考，從62.4%降至15.5%，下降了46.9%；其次為環(huán)丙沙星，從37.4%降至5.8%，下降了31.6%（圖4）。

中介率方面：除頭孢曲松和強(qiáng)力霉素的中介率與2007年基本持平外，2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對其他抗菌藥物的中介率明顯低于2007年，其中阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢拉啶、頭孢西丁、鏈霉素和壯觀霉素的中介率下降明顯，降低最明顯的是頭孢拉啶，下降了55.2%，其次是阿莫西林，下降了52.4%（圖5）。

耐藥性方面：與2007年相比，2016年抗菌藥物耐藥率降低的抗菌藥物只有阿米卡星、壯觀霉素和強(qiáng)力霉素3種，降低12.3%～15.5%；耐藥率升高的抗菌藥物有16種，上升率為1.2%～62.1%，其中阿莫西林耐藥率從35.0%升至97.1%，上升了62.1%，氟苯尼考的耐藥率從17.8%上升至74.8%，上升了57.0%，頭孢拉啶的耐藥率從11.7%升至51.4%，上升了39.7%（圖6）。

3 討論

抗菌藥物的廣泛、持續(xù)及不科學(xué)使用，致使細(xì)菌對其產(chǎn)生越來越嚴(yán)重的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，與2007年相比，2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對青霉素類的阿莫西林，頭孢菌素類的頭孢曲松，氟喹諾酮類的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和環(huán)丙沙星，氨基糖苷類的慶大霉素，酰胺醇類的氟苯尼考表現(xiàn)為敏感率降低，中介率降低，耐藥率提高。

耐藥基因位于一個可移動的質(zhì)粒中，是耐藥性快速轉(zhuǎn)移傳播的關(guān)鍵因素，在質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移作用下，耐藥基因可整合至新宿主的質(zhì)粒中并進(jìn)行有效表達(dá)，使得新宿主快速獲得對某種或某類抗菌藥物的耐藥性，同時新宿主的耐藥譜變得更廣（Schaechter，2009）。耐藥基因的存在并不一定使得菌株表現(xiàn)為耐藥，可能與其表達(dá)量相關(guān)，當(dāng)敏感菌株持續(xù)處于藥物環(huán)境時，耐藥基因表達(dá)量增加，菌株對抗菌藥物的敏感性可從敏感變?yōu)槟退?，而?dāng)高度耐藥菌株在沒有藥物環(huán)境下連續(xù)傳代培養(yǎng)后，耐藥基因表達(dá)量降低，菌株對抗菌藥物的敏感性可從耐藥變?yōu)槊舾校险绲龋?003；田淑琴等，2007；崔耀明等，2015；馮世文等，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素類的頭孢氨芐、頭孢拉啶和頭孢西丁，氨基糖苷類的鏈霉素和卡那霉素，2016年的中介率比2007年明顯降低；但在敏感率和耐藥率方面，2016年表現(xiàn)為明顯升高。這說明對抗菌藥物表現(xiàn)為中介的菌株具有恢復(fù)對藥物敏感的可能，也有發(fā)展為耐藥的可能。此外，在耐藥率方面，盡管同為氨基糖苷類，阿米卡星和壯觀霉素表現(xiàn)為降低，而鏈霉素和卡那霉素表現(xiàn)為升高，可能與抗菌藥物的使用情況相關(guān)。

與國內(nèi)其他地區(qū)耐藥性相比，2016年廣西地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對阿莫西林的耐藥率與安徽地區(qū)（阮祥春等，2013）相似，高于河南地區(qū)（王克領(lǐng)等，2014），遠(yuǎn)高于長春地區(qū)（王基偉等，2014），對頭孢曲松的耐藥率遠(yuǎn)高于河南地區(qū)和長春地區(qū)；對氨基糖苷類慶大霉素的耐藥率高于長春地區(qū)，低于安徽地區(qū)和河南地區(qū)；對氟喹諾酮類環(huán)丙沙星的耐藥率均高于河南地區(qū)和長春地區(qū)，對氧氟沙星的耐藥率均高于安徽地區(qū)和長春地區(qū)；對四環(huán)素類強(qiáng)力霉素的耐藥率與河南地區(qū)相似，低于安徽地區(qū)；對氯霉素類氟苯尼考的耐藥率與安徽地區(qū)相似。多重耐藥方面，與安徽地區(qū)、河南地區(qū)和長春地區(qū)相比，2016年廣西豬源致病性大腸桿菌的耐藥譜更寬，最低耐藥數(shù)為5耐，最高為17耐，且以11耐以上為主。說明不同地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥性存在差異，但總體表現(xiàn)為耐藥嚴(yán)重。

4 結(jié)論

當(dāng)前廣西豬源致病性大腸桿菌以廣譜耐藥為主，敏感性降低，中介率降低，耐藥率明顯升高，生產(chǎn)中可選用阿米卡星和壯觀霉素進(jìn)行豬大腸桿菌病防治。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）