云南省部分煙區(qū)根結(jié)線蟲形態(tài)和分子鑒定

楊艷梅　梁艷　袁紹杰　趙希城　胡先奇

摘要：【目的】明確當(dāng)前云南省部分煙草種植區(qū)根結(jié)線蟲的種類和分布，為煙草根結(jié)線蟲病綜合防治及煙草品種布局提供理論依據(jù)。【方法】2015年8～10月，在云南省主要煙草種植區(qū)昆明、曲靖和玉溪市采集54份煙草根結(jié)線蟲病根樣本，采用雌成蟲會(huì)陰花紋形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)（rDNA-ITS區(qū)和SCAR特異性鑒定）對(duì)病原根結(jié)線蟲種類進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】采集的54份樣本中有24份樣本的病原為花生根結(jié)線蟲（Meloidogyne arenaria），占44.44 %；7份樣本為南方根結(jié)線蟲（M. incognita），占12.96%；1份樣本為爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica），占1.85%；11份樣本為爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群，占20.37%；5份樣本為南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群，占9.26%；3份樣本為南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的復(fù)合種群，占5.56%；3份樣本為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種線蟲的復(fù)合種群，占5.56 %。【結(jié)論】當(dāng)前危害云南省部分煙草種植區(qū)（昆明、曲靖和玉溪煙區(qū)）的根結(jié)線蟲種類主要有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種，以花生根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種群。

關(guān)鍵詞： 煙草；根結(jié)線蟲；種類；云南

中圖分類號(hào)： S432.45 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）02-0284-08

Abstract：【Objective】The present study investigated species and distribution of root-knot nematodes in tobacco growing regions of Yunnan， in order to provide reference for comprehensive prevention of root-knot nematodes disease and tobacco variety layout. 【Method】During August to October， 2015， 54 samples of root-knot nematode host on tobacco crops were collected from Kunming city， Qujing city and Yuxi city in Yunnan. The species of root-knot nematodes were identified by observing perineal patterns and molecular biological testing（PCR of ITS region of ribosomal DNA and sequence characterized amplified region， SCAR）. 【Result】There were 24 samples belonging to Meloidogyne arenaria， accounting for 44.44%； seven M. incognita samples， accounting for 12.96%； one M. javanica sample， accounting for 1.85%. Eleven samples were compound population of M. javanica and M. arenaria， accounting for 20.37%. Five were compound population of M. incognita and M. arenaria， accounting for 9.26%. Three were compound population of M. incognita and M. javanica， accounting for 5.56%. Three belonged to compound population of M. incognita， M. javanica and M. arenaria， accounting for 5.56%. 【Conclusion】The species of root-knot nematodes in tobacco growing areas of Yunnan mainly include M. incognita， M. javanica and M. arenaria. M. arenaria is the dominant population.

Key words： tobacco； root-knot nematode； species； Yunnan

0 引言

【研究意義】煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，為我國(guó)財(cái)政資金積累作出了重要貢獻(xiàn)，在反哺農(nóng)業(yè)中也發(fā)揮著不可替代的作用。生產(chǎn)上煙草深受根結(jié)線蟲危害，煙株受害后，初期植株整體矮化，生長(zhǎng)緩慢，后期根部形成“雞爪狀”，烘烤出的煙葉葉片薄，質(zhì)量下降（吳杰，2014）。云南省是煙草生產(chǎn)和消費(fèi)大省，但由于煙草連年種植，致使根結(jié)線蟲病發(fā)生為害日趨嚴(yán)重，一般可造成減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)30%以上，甚至絕產(chǎn)（秦公偉等，2006）。此外，根結(jié)線蟲的侵染還會(huì)加重其他煙草根莖病如黑脛病的為害（孔凡玉等，1995），煙草根結(jié)線蟲病已成為制約煙草生產(chǎn)的重要因子。因此，對(duì)云南省煙草主要種植區(qū)根結(jié)線蟲種類進(jìn)行鑒定，對(duì)指導(dǎo)煙草種植區(qū)根結(jié)線蟲病的綜合防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】煙草根結(jié)線蟲首次被發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇島，1922年Tisdale發(fā)現(xiàn)美國(guó)佛羅里達(dá)根結(jié)線蟲嚴(yán)重危害烤煙生產(chǎn)（Sasser et al.，1983）。在我國(guó)，余茂勛最早報(bào)道了煙草根結(jié)線蟲?。追灿窈屯蹯o，2001）。目前，我國(guó)煙草產(chǎn)區(qū)幾乎都有煙草根結(jié)線蟲發(fā)生和為害的報(bào)道。李慶平（1995）研究表明，危害云南省楚雄州煙草的根結(jié)線蟲種類主要有南方根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲，優(yōu)勢(shì)種為南方根結(jié)線蟲。楊銘等（1995）通過(guò)會(huì)陰花紋鑒定發(fā)現(xiàn)危害云南煙草的根結(jié)線蟲為4種常見(jiàn)種，以南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種群，其中北方根結(jié)線蟲出現(xiàn)于海拔1900～2000 m的滇北亞熱帶（年均氣溫14.4～14.7 ℃）。陳永芳等（1997）采用形態(tài)學(xué)、鑒別寄主試驗(yàn)及生物化學(xué)方法對(duì)云南省103份煙草樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3種根結(jié)線蟲，分別為花生根結(jié)線蟲2號(hào)小種、爪哇根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲1號(hào)小種。董瑩等（2014）采用會(huì)陰花紋、同工酶及SCAR分析對(duì)云南省耿馬縣的7份樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，危害耿馬縣的根結(jié)線蟲主要有花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。馬俊平等（2014）通過(guò)形態(tài)學(xué)、rDNA-D2/D3和SCAR分析對(duì)滇中引種美煙品種55個(gè)煙草根結(jié)線蟲病樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示滇中引種美煙品種主產(chǎn)區(qū)的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種，優(yōu)勢(shì)種為爪哇根結(jié)線蟲?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)云南省煙草根結(jié)線蟲種類鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道雖較多，但大多集中在20世紀(jì)90年代。近年來(lái)，云南不斷引進(jìn)一些烤煙新品種，當(dāng)?shù)責(zé)煵葜髟云贩N布局發(fā)生新的變化，這些新變化是否導(dǎo)致根結(jié)線蟲種類發(fā)生變化尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法相結(jié)合對(duì)云南省煙草主要種植區(qū)根結(jié)線蟲種類進(jìn)行鑒定，以明確當(dāng)前云南煙草種植區(qū)的根結(jié)線蟲種類及分布，分析優(yōu)勢(shì)種群的發(fā)生情況，為云南省煙草根結(jié)線蟲的有效防治提供理論依據(jù)，也為煙草品種布局提供參考。

1 材料與方法

1. 1 田間采樣

2015年8～10月，在云南省煙草主要種植區(qū)昆明、曲靖和玉溪市共采集54份煙草根結(jié)線蟲病根樣本，其中昆明16份、曲靖18份、玉溪20份，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣本保存及根結(jié)線蟲種類鑒定。樣本信息見(jiàn)表1。

1. 2 雌成蟲會(huì)陰花紋制作及觀察

參考Hartman和Sasser（1985）、Hirschmann（1985）的方法制作根結(jié)線蟲會(huì)陰花紋，制作好的會(huì)陰花紋玻片用指甲油封片，貼好標(biāo)簽，于顯微鏡下拍照觀察。

1. 3 分子生物學(xué)鑒定

1. 3. 1 根結(jié)線蟲DNA提取 線蟲DNA提取參照Adam等（2007）的方法并略有改進(jìn)。用單頭根結(jié)線蟲成熟雌蟲提取DNA。

1. 3. 2 rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增 采用Vrain等（1992）設(shè)計(jì)的通用引物V5367/F195進(jìn)行根結(jié)線蟲rDNA的ITS區(qū)PCR擴(kuò)增。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物系列：V5367（5′-TTGATTACGTCC

CTGCCCTTT-3′），F(xiàn)195（5′-TTTCACTCGCCGTTACT

AAGG-3′）。PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：模板DNA 5.0 μL，10×PCR Buffer（Mg2+，Plus）5.0 μL，dNTP（Mixture）4.0 μL，V5367（10 μmol/L）2.0 μL，F(xiàn)195（10 μmol/L）2.0 μL，Tap酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取6.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2.0 μL 6×Loading Buffer混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀測(cè)拍照。

1. 3. 3 根結(jié)線蟲SCAR特異性鑒定 通過(guò)查找文獻(xiàn)篩選出4對(duì)特異性引物（表2），對(duì)供試樣本進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）：2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL，引物1（10 μmol/L）1.0 μL，引物2（10 μmol/L）1.0 μL，模板DNA 2.0 μL。擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃ 30 s，退火30 s（Finc/Rinc：55 ℃；Fjav/Rjav：64 ℃；Ma-F/Ma-R：61 ℃；Mh-F/Mh-R：61 ℃），72 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取6.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2.0 μL 6×Loading Buffer混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并在照膠儀下觀測(cè)拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雌成蟲會(huì)陰花紋形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)云南省昆明、曲靖和玉溪市烤煙種植區(qū)采集的54份煙草根結(jié)線蟲寄主樣本進(jìn)行雌成蟲會(huì)陰花紋觀察，經(jīng)初步鑒定，54份煙草樣本中有24份樣本為花生根結(jié)線蟲；7份為南方根結(jié)線蟲；1份為爪哇根結(jié)線蟲；11份為爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群；5份為南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群；3份為南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的復(fù)合種群；3份為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種線蟲的復(fù)合種群；混合種群共22份（圖1）。

南方根結(jié)線蟲雌蟲會(huì)陰花紋：會(huì)陰花紋變異大，大多數(shù)有明顯高的背弓，似方形或梯形；線紋較粗呈波浪狀，側(cè)線有或無(wú)，不明顯，有一些彎向陰門的線紋（圖1-A、圖1-B）。爪哇根結(jié)線蟲雌蟲會(huì)陰花紋：具有把花紋分成背區(qū)和腹區(qū)的明顯的溝形側(cè)線（側(cè)溝），極少有線紋通過(guò)側(cè)溝，背弓低圓或略高；線紋平滑或稍波浪狀（圖1-C、圖1-D）?；ㄉY(jié)線蟲雌蟲會(huì)陰花紋：花紋變異較大，側(cè)線附近有由稍呈鋸齒狀的背線形成的肩狀突起，背弓較低、扁平至圓形；線紋粗平滑或稍波浪狀，背線和腹線在側(cè)線處交叉相遇（圖1-E、圖1-F）。

2. 2 rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

采用通用引物V5367/F195擴(kuò)增54份煙草根結(jié)線蟲rDNA的ITS區(qū)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，供試的所有種群在此區(qū)域均產(chǎn)生約760 bp大小的片段，表明供試種群在此區(qū)域的擴(kuò)增片段差別甚微，通過(guò)電泳檢測(cè)無(wú)法將其區(qū)分（圖2）。

2. 3 SCAR特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

選用4對(duì)特異性引物進(jìn)行SCAR特異性鑒定，結(jié)果顯示，選用Finc/Rinc引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共有18個(gè)種群擴(kuò)增出條帶，條帶大小約1200 bp；選用Fjav/Rjav引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共有18個(gè)種群擴(kuò)增出條帶，條帶大小約700 bp；選用Ma-F/Ma-R特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，共有43個(gè)種群擴(kuò)增出條帶，條帶大小約420 bp；其中，11份樣本為爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群，5份樣本為南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群，3份樣本為南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的復(fù)合種群，3份樣本為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種線蟲的復(fù)合種群（圖3）。

2. 4 形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法相結(jié)合綜合鑒定結(jié)果

從上述分析結(jié)果可知，采用雌蟲會(huì)陰花紋形態(tài)特征的鑒定結(jié)果與結(jié)合通用引物V5367/F195擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小、SCAR特異性鑒定的結(jié)果一致。采集的54份煙草根結(jié)線蟲病害樣本的病原線蟲分別是：花生根結(jié)線蟲24份，占44.44%；南方根結(jié)線蟲7份，占12.96%；爪哇根結(jié)線蟲1份，占1.85%；爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群11份，占20.37%；南方根結(jié)線和花生根結(jié)線蟲的復(fù)合種群5份，占9.26%；南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的復(fù)合種群3份，占5.56%；南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種線蟲的復(fù)合種群3份，占5.56%；混合種群共22份，占40.74%。從分布上看，3種根結(jié)線蟲均遍布各采集地點(diǎn)，其中，昆明市所采集的16份樣本中，有4份為南方根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，6份為花生根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，2份為南方根結(jié)線蟲與花生根結(jié)線蟲混合侵染，1份為爪哇根結(jié)線蟲與花生根結(jié)線蟲混合侵染，3份為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合侵染；曲靖市所采集的18份樣本中，有2份為南方根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，1份為爪哇根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，5份為花生根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，2份為南方根結(jié)線蟲與爪哇根結(jié)線蟲混合侵染，2份為南方根結(jié)線蟲與花生根結(jié)線蟲混合侵染，6份為爪哇根結(jié)線蟲與花生根結(jié)線蟲混合侵染；玉溪市所采集的20份樣本中，有2份為南方根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，13份為花生根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，4份為爪哇根結(jié)線蟲與花生根結(jié)線蟲混合侵染，1份為南方根結(jié)線蟲與爪哇根結(jié)線蟲混合侵染。

3 討論

利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合進(jìn)行根結(jié)線蟲種類鑒定是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究者常采用的一種方法，其準(zhǔn)確性和客觀性已得到國(guó)際公認(rèn)。本研究采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合鑒定出云南省昆明、曲靖和玉溪煙區(qū)根結(jié)線蟲種類主要有花生根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲，從分布上來(lái)看，這3種根結(jié)線蟲均遍布各采集地點(diǎn)，其中，花生根結(jié)線蟲均為這3個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，但每個(gè)地區(qū)所采樣本數(shù)量較少，無(wú)法對(duì)各自占有比例做出準(zhǔn)確判定，有待后續(xù)研究。

煙草根結(jié)線蟲病作為一種世界性病害嚴(yán)重制約煙草生產(chǎn)，世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)危害煙草的根結(jié)線蟲主要有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和高弓根結(jié)線蟲5種（Taylor and Sasser， 1978）。我國(guó)煙草上5種根結(jié)線蟲均有發(fā)現(xiàn)，以南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲為主要種群，北方根結(jié)線蟲和高弓根結(jié)線蟲只在少數(shù)地區(qū)發(fā)現(xiàn)?？追灿竦龋?000）研究表明，南方根結(jié)線蟲1號(hào)小種、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲2號(hào)小種為山東省煙草根結(jié)線蟲主要病原，南方根結(jié)線蟲1號(hào)小種為優(yōu)勢(shì)種群；李錫宏等（2002）和李建立等（2012）鑒定出湖北省煙草根結(jié)線蟲病原為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲；朱斌等（2005）研究表明陜西省陜南煙區(qū)根結(jié)線蟲病原物為南方根結(jié)線蟲；王仁剛等（2007）研究表明貴州省煙草根結(jié)線蟲有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種；焦永吉等（2014）檢測(cè)出河南省煙草根結(jié)線蟲有4種，分別為南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲，優(yōu)勢(shì)種群為南方根結(jié)線蟲。云南煙草根結(jié)線蟲最早在1991年初見(jiàn)報(bào)道，1991～1995年相關(guān)研究表明云南煙草根結(jié)線蟲種類有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲4種常見(jiàn)種，且以南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種群（秦西云等，1991；李慶平，1995；楊銘等，1995）；1997～1998年研究顯示南方根結(jié)線蟲已由云南煙草根結(jié)線蟲的優(yōu)勢(shì)種群下降為次要種群，花生根結(jié)線蟲上升為優(yōu)勢(shì)種群（陳永芳等，1997；喻盛甫等，1998）；2013～2014年，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲依然為云南省煙草根結(jié)線蟲主要種群，其優(yōu)勢(shì)種群在局部地區(qū)顯示不一（徐興陽(yáng)等，2013；董瑩等，2014；馬俊平等，2014）。

本研究結(jié)果顯示，危害云南煙草的根結(jié)線蟲種類（南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲）與我國(guó)煙草上主要根結(jié)線蟲種類相符，研究未發(fā)現(xiàn)有北方根結(jié)線蟲存在，可能是本研究采集點(diǎn)的氣候條件不適于北方根結(jié)線蟲所需的寒冷氣候所致（張紹升，1991）。本研究鑒定結(jié)果顯示花生根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種群，與河南省、山東省、陜西省及云南省1991～1995和2013年報(bào)道的煙草根結(jié)線蟲以南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種群的研究結(jié)果不符，且與馬俊平等（2014）報(bào)道的滇中美煙品種根結(jié)線蟲優(yōu)勢(shì)種群為爪哇根結(jié)線蟲的研究結(jié)果也不相符，但與云南省1997～1998年及董瑩等（2014）報(bào)道的云南省其他煙草種植區(qū)煙草根結(jié)線蟲以花生根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種群的研究結(jié)果相符。相關(guān)研究顯示，煙草品種K326屬抗南方根結(jié)線蟲品種，但對(duì)爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲均感病；紅花大金元對(duì)南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲均感?。愑婪嫉?，1997；喻盛甫等，1998）。本研究所收集的煙草品種主要包括紅花大金元和K326，兩品種所占比例分別為22.22%和53.70%，即K326占所收集樣本的一半以上，可能是本研究根結(jié)線蟲優(yōu)勢(shì)種群發(fā)生變化的主要原因。本研究54份煙草樣本中有12份樣本為紅花大金元，29份樣本為K326。12份紅花大金元樣本中，5份樣本檢出南方根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，2份樣本檢出花生根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，2份樣本檢出南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合侵染，2份樣本檢出南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲混合侵染，1份樣本檢出爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合侵染，可見(jiàn)，紅花大金元對(duì)3種根結(jié)線蟲均感病。29份K326樣本中，2份樣本檢出南方根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，19份樣本檢出花生根結(jié)線蟲單獨(dú)侵染，1份樣本檢出南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合侵染，1份樣本檢出南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲混合侵染，5份樣本檢出爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合侵染，1份樣本檢出南方、爪哇和花生根結(jié)線蟲混合侵染?？梢?jiàn)，K326對(duì)爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲均感病。此外，29份K326樣本中，有5份樣本檢出南方根結(jié)線蟲，其中3份以混合侵染方式感染，可能是侵染性線蟲的侵入使K326對(duì)南方根結(jié)線蟲的抗性減弱所致。本研究結(jié)果表明，云南省煙草根結(jié)線蟲混合發(fā)生侵染的比例上升，可能是由于近年來(lái)云南省新引進(jìn)煙草品種的介入，寄主與病原的互作關(guān)系發(fā)生變化，打破了原有的種群結(jié)構(gòu)，且基于大田采樣，環(huán)境相對(duì)開(kāi)放，利于線蟲種群交流所致。

本研究結(jié)果可為抗病育種學(xué)家及生防工作者們今后開(kāi)展對(duì)該煙區(qū)根結(jié)線蟲的綜合防控體系的建立提供參考依據(jù)。但由于時(shí)間的局限性，本研究?jī)H鑒定到根結(jié)線蟲種，未鑒定到其所屬的生理小種范圍，有待后續(xù)工作中進(jìn)一步探討。此外，鑒于本研究采樣地點(diǎn)僅涉及云南省煙草主產(chǎn)區(qū)的昆明、曲靖和玉溪市，研究結(jié)果僅能反應(yīng)云南省部分煙區(qū)的根結(jié)線蟲種群分布情況，無(wú)法對(duì)整個(gè)云南省煙草種植區(qū)的根結(jié)線蟲種類分布及占有比例做出最終判定，還有待進(jìn)一步調(diào)查研究。

由于根結(jié)線蟲不同種之間具有顯著的致病性差異，因此，準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲顯得尤為重要。根結(jié)線蟲雌成蟲會(huì)陰花紋形態(tài)觀察雖然作為形態(tài)學(xué)鑒定的核心方法，但由于受寄主與營(yíng)養(yǎng)的差異、年輕雌蟲與老熟雌蟲的不同等多種因素影響而存在一定程度的變異，故常造成鑒定結(jié)果的不確定性。根結(jié)線蟲核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）在種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又表現(xiàn)不同程度的差異，是根結(jié)線蟲種間鑒定的理想遺傳標(biāo)記區(qū)（王曦茁等，2013），但Powers等（1997）發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種根結(jié)線蟲的ITS區(qū)系列非常保守；Blok等（1997）也發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種根結(jié)線蟲ITS區(qū)片段差別甚微，本研究結(jié)果也與之相符，故單用ITS系列進(jìn)行根結(jié)線蟲種類鑒定也不可行。SCAR特異性鑒定技術(shù)使用的引物長(zhǎng)、退火溫度高，因而穩(wěn)定性好，被廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲種類鑒定。Wiliamson等（1997）采用SCAR鑒定方法設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，快速準(zhǔn)確鑒定了M. haple；Carolien等（2000）基于SCAR-PCR設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，準(zhǔn)確鑒定出南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲。本研究采用SCAR特異性鑒定技術(shù)進(jìn)行根結(jié)線蟲種類鑒定不失為一種簡(jiǎn)便、快速的鑒定方法，再結(jié)合ITS及會(huì)陰花紋綜合測(cè)定使得鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。

4 結(jié)論

本研究采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法有機(jī)結(jié)合對(duì)所采集樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，當(dāng)前危害云南省部分煙草種植區(qū)（昆明、曲靖和玉溪煙區(qū)）的根結(jié)線蟲種類主要有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種，且花生根結(jié)線蟲已上升為優(yōu)勢(shì)種群，成為影響該煙區(qū)煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要病害，并已對(duì)煙葉生產(chǎn)構(gòu)成巨大危害。

參考文獻(xiàn)：

陳永芳，喻盛甫，陳海如，張世光. 1997. 云南省煙草根結(jié)線蟲的比較鑒定及種類分布研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，3（4）：33-40.

Chen Y F，Yu S F，Chen H R， Zhang S G. 1997. Studies on the comparative identifieation and distribution of root-knot（Me-

loidogyne spp.）on tobacco in Yunnan province[J]. Acta Tabacaria Sinica，3（4）：33-40.

董瑩，周厚發(fā)，夏振遠(yuǎn)，詹開(kāi)旺，王揚(yáng)，謝勇，崔華棟，魏環(huán)宇，姬廣海. 2014. 云南省耿馬縣煙草根結(jié)線蟲病發(fā)病因素調(diào)查[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，27（2）：670-675.

Dong Y，Zhou H F，Xia Z Y，Zhan K W，Wang Y，Xie Y，Cui H D，Wei H Y，Ji G H. 2014. Investigation on pathogenic factors of tobacco root-knot nematode disease in Gengma county，Yunnan province[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，27（2）：670-675.

焦永吉，王悶靈，趙云波，趙世民，張涵，蔣士君. 2014. 河南省煙草根結(jié)線蟲種類的PCR鑒定與種群分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，20（3）：79-83.

Jiao Y J，Wang M L，Zhao Y B，Zhao S M，Zhang H，Jiang S J.2014. PCR-based identification of root-knot nematodes （Meloidogyne spp） in tobacco in Henan province[J]. Acta Tabacaria Sinica，20（3）：79-83.

孔凡玉，王靜. 2001. 煙草根結(jié)線蟲病研究進(jìn)展[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，32（3）：232-235.

Kong F Y，Wang J. 2001. Advance of the research on root-knot nematodes in tobacco[J]. Journal of Shenyang Agricultural University，32（3）：232-235.

孔凡玉，王年，王從麗，石金開(kāi)，郭永峰，王靜，楊德廉，孟凡剛，姜鵬超，周忠仁. 2000. 山東煙草根結(jié)線蟲病病原種、小種鑒定初報(bào)[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，（3）：29-32.

Kong F Y，Wang N，Wang C L，Shi J K，Guo Y F，Wang J，Yang D L，Meng F G，Jiang P C，Zhou Z R. 2000. Identification of root-knot nematodes（Meloidogyne spp）on tobacco in Shandong province[J]. Chinese Tobacco Science，（3）：29-32.

孔凡玉，朱賢朝，石金開(kāi)，郭振業(yè). 1995. 我國(guó)煙草侵染性病害發(fā)生趨勢(shì)原因及防治對(duì)策[J]. 中國(guó)煙草，（1）：31-34.

Kong F Y，Zhu X C，Shi J K，Guo Z Y. 1995. Developing tendency causes and control measures of tobacco infectious diseases in China[J]. China Tobacco，（1）：31-34.

李建立，趙洪海，李錫宏，孔凡玉. 2012. 湖北省煙草上植物線蟲種類鑒定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，51（21）：4795-4798.

Li J L，Zhao H H，Li X H，Kong F Y. 2012. Identification of plant nematode species on tobacco in Hubei province[J]. Hubei Agricultural Sciences，51（21）：4795-4798.

李慶平. 1995.楚雄州煙草根結(jié)線蟲病發(fā)生規(guī)律及防治研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，10（2）：128-130.

Li Q P. 1995. Studies on the occurrence pattern and control of tobacco root-knot nematode in Chuxiong perfecture[J]. Journal of Yunnan Agriculture University，10（2）：128-130.

李錫宏，李進(jìn)平，卓靜萍， 孟貴星，陳明輝，孔凡玉. 2002. 恩施州煙草根結(jié)線蟲病病原種、小種鑒定及綜合防治技術(shù)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，（1）：45-47.

Li X H，Li J P，Zhuo J P，Meng G X，Chen M H，Kong F Y. 2002. Identification and control of protospecies and micro-

species of tobacco root-knot nematodes（Meloidogyne spp） in Enshi prefecture[J]. Hubei Agricultural Sciences，（1）：45-47.

馬俊平，陳麗，黃月揖，胡先奇. 2014. 滇中美煙品種主要引種區(qū)根結(jié)線蟲的種類及優(yōu)勢(shì)種變化[C]//廖金鈴，彭德良，簡(jiǎn)恒，段玉璽，文艷華，陳綿才. 中國(guó)線蟲學(xué)研究（第五卷）. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社：232-234.

Ma J P，Chen L，Huang Y Y，Hu X Q. 2014. Root-knot nematode species in main producing areas of American tobacco varieties and dominant species variation in central Yunnan[C]//Liao M L，Peng D L，Jian H，Duan Y X，Wen Y H，Chen M C. Nematology Research in China Vol.5. Beijing：China Agricultural Scientech Press：232-234.

秦公偉，李文麗，王富. 2006. 番茄根結(jié)線蟲的危害與防治[J].北方園藝，（2）：132-133.

Qin G W，Li W L，Wang F. 2006. Damage and control of tomato root-knot nematodes[J]. Northern Horticulture，（2）：132-133.

秦西云，段玉琪，楊銘. 1991. 云南煙草根結(jié)線蟲病病原鑒定初報(bào)[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，（4）： 22-23.

Qin X Y，Duan Y Q，Yang M. 1991. Preliminary report of toba-

cco root knot nematode disease pathogens identified in Yunnan province[J]. Yunnan Agricultural Science and Technology，（4）： 22-23.

王仁剛，李莉，楊春元，任學(xué)良，商勝華，向紅瓊. 2007. 貴州烤煙品種資源對(duì)根結(jié)線蟲的抗性鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（6）：57-59.

Wang R G，Li L，Yang C Y，Ren X L，Shang S H，Xiang H Q.2007. Identification of resistance to root-knot nematode of tobacco germplasm resources in Guizhou[J]. Guizhou Agricultural Sciences，35（6）：57 -59.

王曦茁，馬建偉，汪來(lái)發(fā)，郭志斌，郭民偉. 2013. 安微省3種中草藥植物的根結(jié)線蟲種類鑒定[J]. 安微農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，40（5）： 758-764.

Wang X Z，Ma J W，Wang L F，Guo Z B，Guo M W. 2013. Identification of the root-knot nematodes on three herbal medicine plants in Anhui province[J]. Journal of Anhui Agricultural University，40（5）： 758-764.

吳杰. 2014. 重慶煙草根結(jié)線蟲病的發(fā)生規(guī)律及防治建議[J].重慶與世界，11（31）：58-61.

Wu J. 2014. Occurrence regular and control advice for tobacco root-knot nematode in Chongqing[J]. The world and Chong-

qing，11（31）：58-61.

徐興陽(yáng)，羅華元，饒智，楊明，端永明，楊應(yīng)明，孫勝，周紹松.2013. 昆明植煙土壤根結(jié)線蟲種群動(dòng)態(tài)研究[J]. 昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，35（6）：11-14.

Xu X Y，Luo H Y，Rao Z，Yang M，Duan Y M，Yang Y M，Sun S，Zhou S S. 2013. Study on population dynamics of root-knot nematodes in tobacco-growing areas of Kunming[J]. Journal of Kunming University，35（6）：11-14.

楊銘，秦西云，段玉琪，李慶平. 1995. 云南煙草根結(jié)線蟲病發(fā)生及防治研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，10（2）：134-135.

Yang M，Qin X Y，Duan Y Q，Li Q P. 1995. Studies on the occurrence and control of the root-knot nematodes on tobacco in Yunnan[J]. Journal of Yunnan Agriculture University，10（2）：134-135.

喻盛甫，胡先奇，王揚(yáng). 1998. 云南煙草根結(jié)線蟲優(yōu)勢(shì)種群動(dòng)態(tài)規(guī)律研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，13（1）：52-58.

Yu S F，Hu X Q，Wang Y. 1998. Studies on dynamic change of root-knot nematode dominant population on tobacco in Yunnan[J]. Journal of Yunnan Agriculture University，13（1）：52-58.

張紹升. 1991. 煙草根結(jié)線蟲病的病原鑒定初報(bào)[J]. 中國(guó)煙草，（3）：20-21.

Zhang S S. 1991. Preliminary report of tobacco root knot nematode disease pathogens identification[J]. China Tobacco，（3）：20-21.

朱斌，王軍，喬永信. 2005. 陜南煙草根結(jié)線蟲病發(fā)病規(guī)律研究初報(bào)[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，（1）：6-8.

Zhu B，Wang J，Qiao Y X. 2005. Preliminary report of the occurrence regularity of tobacco root-knot nematode in south Shaanxi[J]. Shaanxi Journal of Agricultural Sciences，（1）：6-8.

Adam M A M，Phillips M S，Blok V C. 2007. Molecular diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically important species of root-knot nematode（Meloidogyne spp.）[J]. Plant Pathology， 56（1）：190-197.

Blok V C，Phillips M S，F(xiàn)argette M. 1997. Comparison of sequences from the ribosomal DNA intergenic Region of Meloidogyne mayaguensis and other major tropical root-knot nematodes[J]. Journal of Nematology，29（1）：16-22.

Carolien Z，Donkers-Venne D T H M，Mireille F. 2000. Identification of Meloidogyne incognita，M. javanica and M. arenaria using sequence characterised amplified region（SCAR） based PCR assays[J]. Nematology，2（8）：847-853.

Dong K，Dean R A，F(xiàn)ortnum B A，Lewis S A. 2001. Development of PCR primers to identity species of root-knot nematodes：Meloidogyne arenaria， M. hapla， M. incognita and M. javanica[J]. Nematropica，31（2）：271-280.

Hartman K M，Sasser J N. 1985. Identification of Meloidogyne species on the basis of differential host test and perineal pattern morphology[J]. In：An advanced treatise on Meloido-

gyne，Vol Ⅱ.Methodology（edited by Barkar K R， Carter C C and Sasser J N） Raleigh，NC，USA：North Carolina State University Graphics：69-77.

Hirschmann H. 1985. The genus Meloidogyne and morphological characters differentiating its species[A]. In：An advance treatise on Meloidogyne，Vol Ⅰ.Biology and Control（edited by Sasser J N and Carter C C）[M]. Raleigh，NC，USA：North Carolina State University Graphics：79-93.

Powers T O，Todd T C，Burnell A M，Murray P C，F(xiàn)leming C C，Szalanski A L，Adams B A，Harris T S. 1997. The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes[J]. Journal of Nematology，29（4）：441-450.

Sasser J N， Eisenback J D， Carter C C， Triantaphyllou A C. 1983. The international Meloidogyne project-its goals and accomplishments[J]. Annual Review of Phytopathology，21（21）：271-288.

Taylor A L，Sasser J N. 1978. Biology， identification and control of root-knot nematodes（Meloidogyne species）[M]. North Carolina State University Graphics：1-2.

Vrain T C，Wakarchuk D A，Levesque A C，Hamilton R I. 1992.Intraspecific rDNA restrietion fragment length polymorphisrn in the Xiphinema americanum americanum group[J]. Fundamental and Applied Nematology，5（6）：563-573.

Wiliamson V M，Caswell-Chen E P，Westerdahl B B，Wu F F，Caryl G. 1997. A PCR assay to identify and distinguish single juveniles of Meloidogyne. hapla and M. chitwoodi[J]. Journal of Nematology，29（1）：9-15.

（責(zé)任編輯 麻小燕）