水稻細菌性條斑病的廣譜抗性資源篩選

洪登偉　趙嚴　羅登杰　施力軍　李容柏　劉芳

摘要：【目的】篩選在多個生育期對多個強致病力細菌性條斑病病菌具有廣譜抗性的水稻材料，為水稻細菌性條斑病抗性品種的培育提供可靠抗源材料?！痉椒ā恳?100份具有豐富遺傳背景的水稻品系為試驗材料，以高感病品種金剛30為感病對照，以5株強致病力水稻細菌性條斑病病菌為接種對象，采用針刺法進行多生育期、多個強致病力細菌性條斑病菌菌株重復接種抗性篩選鑒定?！窘Y果】初篩獲得14份抗病材料，占全部材料的1.27%。復篩獲得9份具有中抗級別以上的材料，占全部材料的0.82%，其中有3份材料（RL6、RL9和RL14）在水稻的3個生育期對多株水稻細條病菌菌株具有抗性，尤其是RL6表現(xiàn)出對多菌株的廣譜抗性，且抗性水平高；6份材料（RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12）在單個生育期對單株水稻細條病菌菌株具有抗性?！窘Y論】獲得3份對水稻細菌性條斑病具有多生育期廣譜抗性的材料，可作為重要的抗源應用于水稻抗性品種培育，其中RL6可作為優(yōu)質抗源優(yōu)先應用于水稻抗性品種培育；獲得6份在特定生育期對水稻細菌性條斑病具有抗性的材料，可作為候選抗源應用于水稻抗性品種培育。

關鍵詞： 水稻；細菌性條斑??；廣譜抗性；抗性資源

中圖分類號： S435；S511 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0272-05

Abstract：【Objective】Rice lines with broad-spectrum resistance toward several kinds of pathogenic bacteria of Xanthomans oryzae pv. Oryzicola at multiple growth stages were selected in order to provide source for rice bacterial leaf streak resistance breeding. 【Method】A total of 1100 rice lines with rich genetic background were offered as selective objects. Highly susceptible cultivar Jingang 30 was used as control. Inoculation was carried out on five strong pathogenic bacteria. Acupuncture method was used in resistance identification using multiple pathogenic strains at various growth stages. 【Result】Fourteen disease-resistant materials were obtained through preliminary screening， accounting for 1.27% of the total materials. Nine materials over mediately resistant were obtained via secondary screening， accounting for 0.82% of the total materials. Besides， three of them（RL6，RL9 and RL14） were resistant to a number of bacterial leaf streaks at three growth stages. In particular， RL6 presented broad-spectrum resistance to multi-strains with high resistance levels. Six of them（RL2、RL4、RL5、RL8、RL11 and RL12） were resistant to single strain at single growth period. 【Conclusion】The obtained three materials are broad-spectrum resistant to rice bacterial leaf streak at multiple growth periods， which can be served as an important source for cultivating disease-resistant rice varieties. RL6 maintains high broad-spectrum resistance at all growth stages， which can be used as a prior resistance source for breeding rice varieties. While the six materials obtained with resistance at particular growth stages can be used as alternative resistance sources.

Key words： rice； bacterial leaf streak； broad-spectrum resistance； resistant resource

0 引言

【研究意義】水稻細菌性條斑?。ê喎Q細條?。┦怯蒟anthomans oryzae pv. oryzicola引起、廣泛分布在亞熱帶地區(qū)的細菌性水稻病害，能導致水稻減產15%～20%，嚴重時可減產40%以上（陳玉奇等，1990）。目前生產上的水稻主栽品種普遍對細條病缺乏抗性，且隨著種質資源交流的日益頻繁，水稻細條病在我國傳播越來越廣，已成為制約我國水稻產量的重要因素?？剐云贩N的選育與推廣是目前控制水稻細條病最有效的方法，而抗源的篩選與有效利用是抗性品種培育的關鍵。已有研究表明大多數(shù)細條病菌菌株與水稻品種之間表現(xiàn)為弱互作關系，就單個菌株而言，對水稻苗期和成株期的致病力分化表現(xiàn)并不一致（張榮勝等，2011）。即使在同一生育期，同一水稻品種對不同菌株所表現(xiàn)的抗性也不相同（郭亞輝和許志剛，2006），這使得通過單一生育期單菌株的抗性篩選方式得到的抗源極易在實際使用中失去抗性而造成損失。因此，只有篩選出在多個生育期具有廣譜抗性的抗源，對水稻細條病的抗性品種培育才能起到較大的作用?！厩叭搜芯窟M展】目前已有研究證實在水稻種質中存在部分對細條病具有一定抗性的材料。張曉葵等（1992）對2551份水稻材料進行了抗細條病鑒定，得到高抗材料3份、較抗病材料538份；李友榮等（1994）鑒定了5024份水稻材料對細條病的抗性，結果發(fā)現(xiàn)有1.0%的材料屬于抗性材料，3.5%屬于中抗材料；王漢榮等（1995）鑒定了3343份水稻材料對細條病的抗性，結果發(fā)現(xiàn)有5.77%的材料屬于抗性材料，15.55%屬于中抗材料。在野生稻資源中存在更高比例的抗性資源，如岑貞陸等（2007）從977份廣西野生稻材料中篩選獲得37份中抗細條病材料；黃大輝等（2008）從31份藥用野生稻材料中篩選獲得15份抗細條病材料。【本研究切入點】前人研究獲得的水稻細條病抗性資源均是在材料的單一生育期對某一菌株進行抗性鑒定獲得，不具有多生育期的廣譜抗性，在實際應用中存在缺陷和局限性。至今尚未見水稻細條病廣譜抗源發(fā)掘的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】通過對遺傳背景豐富的水稻種質資源進行多生育期、多強致病細條病菌菌株重復接種進行抗性篩選，以期獲得在多個生育期對細條病具有穩(wěn)定抗性的水稻廣譜抗源，為水稻細條病抗性品種的培育提供可靠的抗源材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試水稻品系材料共1100份，包括秈稻品系400份、粳稻品系50份、秈粳雜交后代品系200份、普通野生稻與秈稻雜交后代品系400份、普通野生稻與粳稻雜交后代品系50份，具有較豐富的遺傳多樣性；以通用感病品種金剛30為感病對照；供試材料均由亞熱帶農業(yè)資源保護與利用國家重點實驗室野生稻資源保護與利用課題組提供。供試的強致病力水稻細條病菌菌株共5株（WR1、WR2、WR3、WR4和WR5），由亞熱帶農業(yè)資源保護與利用國家重點實驗室何勇強教授提供，5株菌株分別分離自廣西玉林、百色、河池、博白和南寧等地，具有地區(qū)代表性。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 材料種植 初篩材料種植：1100份水稻材料浸種催芽后播種，4葉期時移植于有隔離欄的種植池內，每份材料種植5株；感病對照金剛30種植2行10株。復篩材料種植：將初篩獲得的抗性材料分為3份，間隔20 d進行播種，4葉期時移植于有隔離欄的種植池內，每份材料種植5行，每行5株；感病對照金剛30種植2行10株。試驗均設3次重復，按常規(guī)進行田間管理。

1. 2. 2 菌液配制 將供試細條病菌菌種分別在NA培養(yǎng)基上活化48 h，挑取單菌落接種于200 mL NB培養(yǎng)基上，28 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)期，6000 r/min離心10 min后去上清液，用滅菌水配成懸濁液，再稀釋至3×10 8 CFU/mL用于接種，現(xiàn)配現(xiàn)用。將5個配制好的等濃度強致病性菌液等比例混合即為混合接種菌液。

1. 2. 3 抗性鑒定方法 參照謝關林（1991）的方法采用針刺法接種進行抗性鑒定。將2枚滅菌大頭針固定于橡皮塊上，2針間距0.8 cm，滅菌備用。在培養(yǎng)皿中放置直徑9 cm、厚2 cm的吸水海綿，海綿吸飽菌液后，將距葉尖15 cm處的葉片放置于海綿碟上，用橡皮上的2枚大頭針隔葉脈刺下，使橡皮擠壓海綿，保證針刺傷口接觸到菌液。接種過程中根據(jù)需要適當補充海綿碟中的菌液。接種完畢后蓋膜保濕24 h。

初篩僅在成株期進行抗性鑒定，每份材料以混合菌液接種5株，每株接種3片健康葉片，接種15 d后待感病對照金剛30充分發(fā)病時調查針孔處病斑長度，以每個材料的病斑平均長度劃分抗性級別。復篩在苗期、分蘗初期、成株期3個時期進行，3期材料分期播種，同時進行接種處理；接種時采用分菌株接種，每份材料每個菌株每處理接種5株，每株接種3片健康葉片，接種15 d后待感病對照金剛30充分發(fā)病時調查針孔處病斑長度，以3次試驗重復的病斑平均長度劃分抗性級別。

1. 2. 4 抗性級別劃分 參考農秀美等（1994）的方法，依照病斑長度劃分抗性級別（表1）。同時，判定病斑長度小于1.5 cm為抗性反應（0、1、3、5級），病斑長度大于或等于1.5 cm為感性反應（7、9級）。

2 結果與分析

2. 1 初篩結果

對1100份水稻品系材料使用強致病力細條病混合菌株進行接種篩選，結果（表2）顯示，在1100份材料中有抗病材料（1～5級）14份，僅占全部材料的1.27%，感病材料（7～9級）1086份，占98.73%。初篩未發(fā)現(xiàn)對細條病免疫的材料，對細條病表現(xiàn)高抗、抗和中抗的材料分別有2、6和6份。

2. 2 復篩結果

為了獲得抗性穩(wěn)定的抗源，進一步對初篩結果中的抗性材料在苗期、分蘗初期和成株期分別用5株強致病性水稻細條病菌菌株進行重復接種鑒定。

2. 2. 1 各材料對各病原菌的抗性反應 將初篩獲得的14份抗性材料分別命名為RL1～RL14，復種鑒定結果（表3）顯示，有9份材料（RL2、RL4、RL5、RL6、RL8、RL9、RL11、RL12和RL14）至少在一個生育期對1株菌株表現(xiàn)出抗性反應，有5份材料（RL1、RL3、RL7、RL10和RL13，表3中未列出）在全生育期對5株菌株均表現(xiàn)為感性反應。

2. 2. 2 抗性材料在各生育期的抗性 由表4可知，大部分抗性材料只在單個生育期對某一菌株表現(xiàn)出抗性，如RL2只在苗期對WR5表現(xiàn)抗性，RL5只在苗期對WR1表現(xiàn)抗性，RL4、RL8、RL11和RL12只在成株期對WR4表現(xiàn)抗性。小部分抗性材料即使在多個生育期表現(xiàn)抗性，但在不同菌株間表現(xiàn)不同：RL14對WR1在苗期和分蘗初期表現(xiàn)抗性，對WR4在苗期和成株期表現(xiàn)抗性，對WR5則在分蘗初期和成株期表現(xiàn)抗性，對WR2和WR3只在苗期表現(xiàn)出抗性；RL9對WR4和WR5能保持全生育期抗性，對WR3則在苗期和分蘗初期2個生育期表現(xiàn)出抗性，對WR1和WR2都只在分蘗初期具有抗性。RL6在全生育期對5個菌株均保持抗性。

2. 2. 3 抗性材料的抗譜 由表5可知，大部分抗性材料僅具有窄譜抗性：RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12均在某個生育期只對1株菌株具有抗性；3份材料在某些生育期具有廣譜抗性：RL14在苗期對4株菌株具有抗性；RL9在分蘗初期對5株菌株均具有抗性，苗期和分蘗初期對3株菌株同時保持抗性，而在全生育期對2株菌株保持抗性；RL6在全生育期對5株菌株均具有抗性。

2. 2. 4 優(yōu)良抗性材料的抗性表現(xiàn) 抗性材料RL6、RL9和RL14均在多個生育期具有廣譜抗性（表4、表5和表6）。進一步分析3份優(yōu)秀抗性材料的抗性級別，RL6在3個生育期對5株致病菌株主要表現(xiàn)為高抗級（HR級）和抗級（R級）；RL9對5株致病菌株的抗性主要為抗級（R級）和中抗級（MR級）；RL14在苗期的廣譜抗性主要為抗級（R級），分蘗初期和成株期對各菌株的抗性則以中抗級（MR級）為主（表6）。

3 討論

本研究對1100份水稻品系進行抗水稻細條病篩選，初篩結果顯示有14份材料表現(xiàn)出抗性反應，再通過復篩確定了9份抗性穩(wěn)定的材料，其中有1份材料（RL6）在3個生育期表現(xiàn)出對多菌株的廣譜抗性，且抗性水平高，抗性級別達HR和R級，表明這份廣譜抗性材料具有重要的應用價值，另外2份抗性材料（RL9和RL14）雖然抗性略弱于RL6，但仍在多個生育期具有廣譜抗性，且對部分菌株具有較高抗性。在目前水稻育種嚴重缺乏多生育期廣譜抗細條病抗源的情況下，本研究發(fā)現(xiàn)的這3份廣譜抗源可為水稻育種和基因挖掘提供理想材料。

為減少工作量和提高效率，本研究初篩時每份材料重復較少。一部分在初篩中表現(xiàn)出抗性的材料在復篩時不具有抗性，表明水稻對細條病的抗性穩(wěn)定性差，易受環(huán)境影響，特別是由于細條病菌對水稻的侵染受溫度、濕度、宿主生理狀況等環(huán)境因素影響較大（年少良，2009），導致抗性篩選的準確性降低。因此，進行多環(huán)境條件下重復篩選，才能獲得穩(wěn)定的抗性資源。另一方面，目前國際上對水稻細條病的致病機理研究或抗源篩選絕大部分均基于其在分蘗期或成株期對某一個菌種抗性鑒定的基礎上進行（戴良英和陳貞，1988；張曉葵等，1992；農秀美等，1994；岑貞陸等，2007；黃大輝等，2008；賀文愛等，2010），針對多個生育期多菌株的抗性變化研究較少。已有研究表明大多數(shù)細條病菌菌株與水稻品種之間表現(xiàn)為弱互作關系，就單個菌株而言，對苗期和成株期的致病力分化并不一致（郭亞輝和許智剛，2006），本研究結果也能反應出相同的信息。某一生育期的鑒定結果無法代表其他生育期的抗性情況，即使是同一生育期，同一水稻品種對不同的細條病菌菌株也可能表現(xiàn)出完全不同的抗性能力。在水稻細條病抗性品種選育上，若對抗源僅進行單個生育期、單個菌種的篩選，則很可能最終培育出的品種在其他生育期對細條病菌表現(xiàn)為感，或對其他細條病菌菌株表現(xiàn)為感，降低了品種的實用價值。因此，在水稻細條病抗性品種選育過程中，對抗源的篩選宜進行多生育期多菌株的抗性鑒定，才能獲得抗性穩(wěn)定可靠的廣譜性抗源。本研究從1100份水稻材料中僅獲得3份廣譜抗源材料（0.27%），表明在水稻種質中對水稻細條病具有廣譜高抗的材料非常缺乏，進一步對水稻資源進行多生育期多菌株篩選，獲得更多廣譜抗源仍是抗細條病品種育種的重要途徑。

已有研究認為，水稻對細條病菌的抗性是由一系列QTL相互作用的結果（Khush，1977；夏怡厚等，1992； Tang et al.，2000；Chen et al.，2006），正好解釋了水稻在不同生育期抗性變化無明顯規(guī)律，且對不同菌種表現(xiàn)不同抗性的原因，因而在細條病抗性品種選育過程中對抗性基因/QTL的聚合顯得尤為重要。但同一抗性基因，在不同的遺傳背景下發(fā)揮的抗性能力也可能不一致（Hammond-Kosack et al.，1994；Dixon et al.，2000）。因此，只有在具有豐富遺傳背景的材料中進行篩選，才有可能發(fā)掘出抗性更強的水稻材料。

4 結論

本研究通過初篩及多生育期多菌株復篩，獲得9份對細條病具有一定抗性的水稻材料，其中有3份材料（RL6、RL9和RL14）在水稻3個生育期均對多株水稻細條病菌菌株具有抗性，可作為重要的水稻抗源應用于水稻抗細條病品種培育，其中RL6在各生育期均保持較高的廣譜抗性，可作為優(yōu)質抗源優(yōu)先應用于水稻抗性品種培育；另有6份材料（RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12）在單株水稻細條病菌生育期對單株水稻細條病菌菌株具有抗性，可作為抗性品種培育的候選材料。

致謝：本研究所用細菌性條斑病菌株由亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室的何勇強教授提供，特此感謝！

參考文獻：

岑貞陸，黃思良，李容柏，李衛(wèi)民，覃麗萍，謝玲，胡春錦，李小勇，付崗. 2007. 稻種材料抗細菌性條斑病性鑒定[J]. 安徽農業(yè)科學， 35（22）： 6850-6851.

Cen Z L， Huang S L， Li R B， Li W M， Qin L P， Xie L， Hu C J， Li X Y， Fu G. 2007. Identification of resistance of rice materials to bacterial leaf streak[J]. Journal of Anhui Agricultural sciences， 35（22）： 6850-6851.

陳玉奇，余明智，樂承偉. 1990. 水稻細條病發(fā)病程度與損失率的關系[J]. 植物保護，16（4）： 52.

Chen Y Q，Yu M Z，Le C W. 1990. The relationship between disease severityof rice bacterial leaf streak and loss rate of rice[J]. Plant Protection， 16（4）： 52.

戴良英， 陳貞. 1988. 水稻品種對水稻細菌性條斑病抗性鑒定和抗性機制的研究[J]. 湖南農學院學報，14（4）： 39-45.

Dai L Y，Chen Z. 1988. Studies on the identification and mecha-

nism of resistance of rice varieties to bacterial leaf streak disease[J]. Journal of Hunan Agricultural College，14（4）： 39-45.

郭亞輝，許志剛. 2006. 水稻條斑病菌致病力分化研究進展[J]. 安徽農業(yè)科學，34（23）：6247-6248.

Guo Y H，Xu Z G. 2006. Advances in pathogenicity differentiation of bacterial leaf streak[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences ， 34（23）：6247-6248.

賀文愛， 黃大輝， 劉馳， 岑貞陸，張月雄，馬增風，陳英之，盧雙楠，劉開勇，武波，李容柏. 2010. 普通野生稻抗源對細菌性條斑病的抗性遺傳分析[J]. 植物病理學報， 40（2）：180-185.

He W A， Huang D H， Liu C， Cen Z L， Zhang Y X， Ma Z F， Chen Y Z， Lu S N， Liu K Y， Wu B， Li R B. 2010. Inheri-

tance of resistance to bacteria leaf streak in four accessions of common wild rice（Oryza rufipogon Griff.）[J]. Acta Phytopathologica Scienca， 40（2）：180-185.

黃大輝， 岑貞陸， 劉馳，賀文愛，陳英之，馬增鳳，楊朗，韋紹麗，劉亞麗，黃思良，楊新慶，李容柏. 2008. 野生稻細菌性條斑病抗性資源篩選及遺傳分析[J]. 植物遺傳資源學報，9（1）： 11-14.

Huang D H， Cen Z L， Liu C， He W A， Chen Y Z， Ma Z F， Yang L， Wei S L， Liu Y L， Huang S L， Yang X Q， Li R B. 2008. Identification and genetic analysis of resistance to bacterial leaf streak in wild rice[J]. Journal of Plant Genetic Resources ，9（1）： 11-14 .

李友榮，候小華，魏子生. 1994. 水稻品種對細菌性條斑病的抗性研究[J]. 湖南農業(yè)科學，（1）：39-40.

Li Y R， Hou X H， Wei Z S. 1994. Study on resistance of rice varieties to bacterial leaf streak[J]. Journal of Hunan Agricultural Sciences，（1）：39-40.

年少良. 2009.水稻細菌性條斑病的發(fā)生原因與防治技術[J]. 農技服務，26（8）：85.

Nian S L. 2009. Occurrence reason and prevention technique of rice bacterial leaf streak[J]. Agricultural Technology Service， 26（8）：85.

農秀美， 廖恒登， 劉志明， 李為杏. 1994.廣西水稻細菌性條斑病菌致病力分化研究初報[J]. 西南農業(yè)學報，4（4）：94-97.

Nong X M， Liao H D， Liu Z M， Li W X. 1994. Preliminary report on variation in pathogenicity of pathogen of bacterial streak in Guangxi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，4（4）： 94-97.

王漢榮，謝關林，馮仲民. 1995. 水稻品種（系）對水稻細菌性條斑病的抗性評價[J]. 中國農學通報，11（3）：17-19.

Wang H R，Xie G L， Feng Z M. 1995. Resistance evaluation of rice varieties（lines） to rice bacterial leaf streak[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，11（3）：17-19.，

夏怡厚， 林維英， 陳藕英. 1992. 水稻品種（系）對稻細菌性條斑病的抗性鑒定和抗源篩選[J]. 福建農學院學報，21（1）：32-36.

Xia Y H，Lin W Y，Chen O Y. 1992. Resistance-identification and resistant-source screening for rice varieties against bacteria leaf streak[J]. Journal of Fujian Agricultural College ， 21（1）：32-36.

謝關林. 1991. 水稻細菌性條病抗性鑒定技術述評[J]. 水稻文摘， 10（5）： 1-4.

Xie G L. 1991. Review on identification technique of resistance to rice bacterial leaf streak disease[J]. Rice Abstract，10（5）： 1-4.

張榮勝，陳志誼，劉永鋒. 2011. 細菌性條斑病菌致病力分化及其對水稻幼苗和成株的致病力差異[J]. 江蘇農業(yè)學報，27（5）：996-999.

Zhang R S， Chen Z Y， Liu Y F. 2011. Virulence differentiation of Xanthomonas oryzae pv.oryzicola in rice at seedling and adult stages[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences， 27（5）：996-999.

張曉葵，肖利人，黃河清，趙波林，李東漢，楊念軍，張燮卿. 1992. 稻種資源抗水稻細菌性條斑病鑒定[J]. 湖南農業(yè)科學，（2）： 33-35.

Zhang X K，Xiao L R，Huang H Q，Zhao B L，Li D H，Yang N J，Zhang X Q. 1992. Identification of rice resources against rice bacterial leaf streak[J]. Hunan Agricultural Sciences，（2）： 33-35.

Chen C H，Zheng W， Huang X M，Zhang D P，Lin X H. 2006.Major QTL conferring resistance to rice bacterial leaf streak[J]. Agricultural Sciences in China，（5）： 101-105.

Dixon M S， Golstein C， Thomas C M， van der Biezen E A，Jones J D G. 2000. Geneticcomplexity of pathogen perception by plants：The example of Rcr3，a tomato generequired specifically by Cf2[J]. Proceedings of the National Academy of Science，97（16）：8807-8814.

Hammond-Kosack K E，Jones D A，Jones J. 1994. Identification of two genes required in tomato for full Cf-9-dependent resistance to Cladosporium fulvum[J]. Plant Cell，6（3）：361-374.

Khush G S. 1977. The Genetic Basis of Epidemics in Agriculture（Day Red）[M]. New York： Academy of Sciences：296-308.

Tang D，Wu W，Li W，Lu H，Worland A J. 2000. Mapping of QTLs conferring resistance to bacterial leaf streak in rice[J]. Theoretical and Applied Genetics，101（1）：286-291.

（責任編輯 麻小燕）