江蘇省大豐地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

譚菊 匡存林 劉子豪

摘要[目的]探討江蘇省大豐地區(qū)雞大腸桿菌病的流行情況及耐藥情況。[方法]對來自江蘇省大豐區(qū)不同雞場疑患大腸桿菌病的237只病雞，通過病理剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、鏡檢和生化試驗等對致病菌進行分離與鑒定，然后對鑒定的大腸桿菌進行血清型定型，并對定型的大腸桿菌進行藥敏試驗。[結(jié)果]共分離到218株大腸桿菌；通過血清學(xué)鑒定，獲得11個血清型，其中52株為O88，44株為O18，32株為O1，21株為O2，12株為O35，9株為O81，8株為O115，5株為O78，O11、O26、O114各1株，另有32株沒有定型。對定型的186株大腸桿菌進行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對大多數(shù)抗菌藥物耐藥，但硫酸黏菌素、頭孢噻呋、頭孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星和新霉素高度敏感。[結(jié)論]研究結(jié)果可為制備大腸桿菌自家疫苗奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞雞；大腸桿菌；血清型鑒定；藥敏試驗

中圖分類號S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）20-0117-02

Abstract [Objective] To investigate the epidemic situations and drug resistance of chicken colibacillosis in Dafeng Region of Jiangsu Province.[Method]237 diseased chicken suspected to be infected with Escherichia coli from different chicken farms in Dafeng Region of Jiangsu Province were taken to make pathological autopsy，bacterial isolation and culture， Gram staining microscopy and biochemical tests.The pathogen were isolated and identified.And the serotype identification was made on the identified strains of E.coli and the drug sensitivity test was made.[Result]218 strains of E.coli were isolated.Through serotype identification，11 serotypes were obtained， including O88（52 strains），O18（44 strains），O1（32 strains），O2（21 strains），O35（12 strains），O81（9 strains），O115（8 strains），O78（5 strains），O11（1 strain），O26（1 strain），O114（1 strain）.Other 32 strains were not serotyped.Drug sensitivity test was made on 186 serotyped strains of E.coli， the results showed that they were resistant to most of antibacterial drugs，but they were highly sensitive to colistin sulfate，ceftiofur，cefotaxime，kanamycin，ofloxacin and neomycin.[Conclusion] The research results can lay the foundation for preparing selfmade vaccine for E.coli.

Key wordsChicken；Escherichia coli；Serotype identification；Drug sensitivity test

雞大腸桿菌病是由致病性大腸埃希桿菌引起雞的一種常見多發(fā)病，在國內(nèi)中小規(guī)模養(yǎng)殖場普遍存在，發(fā)病率較高，如果與其他病原混合感染，如新城疫、球蟲、支原體等，病死率可達(dá)25%。雞大腸桿菌常見的病理變化包括心包炎、肝周炎、腹膜炎、輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎、眼炎和氣囊炎等，根據(jù)臨床癥狀和病理變化，可以做出初步診斷，而進一步確診則需進行細(xì)菌分離與鑒定。

目前，大腸桿菌的防治主要是通過加強飼養(yǎng)管理，做好生物安全措施，并使用抗菌藥物來治療。但是，隨著抗菌藥物在臨床上的不合理使用，療效越來越差，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌的產(chǎn)生，造成可食性組織中藥物殘留，從而危害人類健康。為了更好地控制雞大腸桿菌病，筆者對江蘇省大豐地區(qū)禽源大腸桿菌進行了分離與鑒定，并通過藥敏試驗篩選出防治大腸桿菌病的有效藥物，旨在為制備大腸桿菌自家疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源。病死雞來源于大豐區(qū)不同規(guī)模的養(yǎng)殖場，共237只，均疑似大腸桿菌病，剖檢有典型的卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、心包炎和肝周炎等。

1.1.2試劑與培養(yǎng)基。麥康凱瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂粉、牛肉膏粉、蛋白胨等，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均按照常規(guī)方法配制[1]。

1.1.3藥敏試紙。硫酸黏菌素、頭孢噻呋、頭孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、新霉素、強力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、慶大霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素、鏈霉素18種藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗血清。大腸桿菌單價和多價標(biāo)準(zhǔn)抗O血清，均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.5試驗動物。30日齡健康雛雞，由江蘇省大豐區(qū)仁雨種雞場提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的分離與培養(yǎng)。通過無菌操作采集病死雞的心臟、肝、腹水、輸卵管分泌物等，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。然后，再挑取培養(yǎng)基上生長良好、菌落占優(yōu)勢的單個菌落轉(zhuǎn)接至普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，置于37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況。最后，將分離到的單個菌落制片，進行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.2生化鑒定。取純培養(yǎng)后的細(xì)菌進行常規(guī)生化試驗。

1.2.3血清型鑒定。參照文獻(xiàn)[2]的方法進行血清型鑒定。

1.2.3.1O抗原制備。將純培養(yǎng)的被檢菌置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上密集劃線，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h。用適量的0.5%石碳酸生理鹽水沖洗菌苔，采用平板計數(shù)法，配成濃菌懸液（2×109～3×109個/mL）。菌懸液經(jīng)121 ℃高溫處理 2 h，破壞K抗原，即為O抗原，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3.2玻板凝集試驗。先將標(biāo)準(zhǔn)抗O 血清滴于玻板上，然后再吸取供試細(xì)菌懸液數(shù)滴，混勻，同時設(shè)置陰性對照，一邊搖晃玻板一邊觀察反應(yīng)結(jié)果。若3 min內(nèi)出現(xiàn)均勻的凝集小顆粒，即為陽性，表明有該種抗原的存在，否則判為陰性；然后，再用其他抗血清按照上述方法進行鑒定。

1.2.3.3試管凝集試驗。用0.5%石炭酸生理鹽水將玻板凝集呈陽性反應(yīng)的單價O血清進行10倍、20倍、40倍、80倍……5 120倍稀釋，然后每管加入分離菌株的O抗原0.5 mL， 37 ℃過夜后判斷。

1.2.4動物試驗。

另將營養(yǎng)瓊脂斜面上純化后的菌落用生理鹽水沖洗，采用傾注平板培養(yǎng)法計算活菌數(shù)后，調(diào)整細(xì)菌濃度為3×108個/mL，背部皮下接種30日齡小雞20羽，每羽0.5 mL，另選20羽作為對照，分別注射生理鹽水0.5 mL。接種后隔離飼養(yǎng)，分別記錄發(fā)病、死亡情況。此后，無菌操作取病死雞的心臟、肝，劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察。

1.2.5藥敏試驗。

采用K-B紙片擴散法將被檢分離株細(xì)菌無菌涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，間隔一定距離貼上18種藥敏試紙片，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：抑菌圈直徑≤10 mm為不敏感（R），10 mm<抑菌圈直徑≤15 mm為中度敏感（I），抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感（S）[3]。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離與鑒定試驗病雞及病死雞病例數(shù)為237個，共分離到218株大腸桿菌，在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，菌落特征如下：菌落呈粉紅色，直徑1 mm左右，邊緣整齊、濕潤光滑。分別挑取不同瓊脂平板上單個菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，可見革蘭氏陰性、染色均一、不形成芽孢的桿菌，符合大腸桿菌的菌落特征。

2.2生化鑒定對分離到的細(xì)菌進行生化試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖，能使麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氧，不能發(fā)酵肌糖、木糖；不能利用枸櫞酸，M.R試驗呈陽性，V-P試驗呈陰性；靛基質(zhì)試驗呈陽性，不產(chǎn)生硫化氫。

2.3血清型鑒定對218株大腸桿菌進行血清學(xué)鑒定，除32株未能定型外，鑒定出186株分離菌株，其中52株為O88，占27.96%；44株為O18，占23.66%；35株為O1，占18.81%；21株為O2，占11.29%；另有12株O35、9株O81、8株O115、5株O78、 1株O11、1株O26、1株O114。

2.4動物致病性試驗

雞接種分離株培養(yǎng)液后，試驗組主要表現(xiàn)為精神沉郁、垂翅、豎毛、縮頸；食欲下降或廢絕、呼吸困難、喘氣；腹瀉，排黃白色稀糞。高致病性分離株接種1～2 d后雞出現(xiàn)死亡高峰。對照組雞飲食正常，精神良好，無死亡現(xiàn)象。對病死雞進行解剖，可見心包炎、心外膜水腫、心包囊混濁、囊內(nèi)充滿淡黃色的纖維性滲出物。取病死雞的心、肝劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24 h，在麥康凱瓊脂平板上生長為邊緣整齊、濕潤光滑的粉紅色菌落。

2.5藥敏試驗結(jié)果對分離的大腸桿菌用18種常用藥物進行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)對硫酸黏菌素（102/186，54.84%）、頭孢噻呋（125/186，67.20%）、頭孢噻肟（156/186，83.87%）、卡那霉素（136/186，73.12%）、氧氟沙星（125/186，67.20%）、新霉素（148/186，79.57%）高度敏感；對環(huán)丙沙星（144/186，77.41%）、強力霉素（156/186，83.87%）、氟苯尼考（89/186，47.85%）、恩諾沙星（83/186，44.62%）、慶大霉素（91/186，48.92%）中度敏感；對氨芐青霉素（176/186，94.6%）、四環(huán)素（163/186，87.6%）、萬古霉素（120/186，64.5%）、紅霉素（142/186，76.3%）、復(fù)方新諾明（162/186，87.1%）、林可霉素（147/186，79.0%）、鏈霉素（139/186，74.7%）產(chǎn)生了較強的耐藥性（表1）。

3討論與結(jié)論

大腸桿菌血清型眾多，各血清型之間無交叉保護作用。吳華俊等[4] 對揚州市 142 個禽源性大腸桿菌進行分離與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)128 個分離株的血清型，其血清型種類多達(dá) 10 個，但以 O78、O2、O127、O18、O1為主（共 109 株），占定型菌株的 85.16%，其中O78有 40 個分離株，占定型菌株的 31.25%。因此，在此次調(diào)查中O78、O2、O127、O18、O1等 5 個血清型為優(yōu)勢血清型。該試驗中O因子血清鑒定結(jié)果表明，在大豐地區(qū)主要有4個優(yōu)勢的血清型，為O88、O18、O1、O2，共分離菌株149株，占分離菌株總數(shù)（186株）的80.11%。劉明

生等[2]從海安分離到226株大腸桿菌，除28株未能定型外，鑒定出198個血清型，其中以O(shè)78、O18、O2、O88、O1、O11為主，共119株，占分離菌株總數(shù)的60.1%，與該試驗結(jié)果相一致。該試驗結(jié)果也為今后大腸桿菌毒力檢測與自家多價滅活苗的制備奠定基礎(chǔ)。

禽大腸桿菌是一種條件性病原微生物，在飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境衛(wèi)生不良、生物安全措施不到位、應(yīng)激和其他病原感染等情況下，容易誘發(fā)大腸桿菌病。因此，防治該病時，應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，增強機體抗病力，采取綜合預(yù)防措施來控制。目前，各規(guī)模養(yǎng)殖場對該病的防治主要依賴抗生素或其他抗菌藥物，但由于抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象已相當(dāng)嚴(yán)重，以前對大腸桿菌敏感的藥物（如氟苯尼考、環(huán)丙沙星、阿莫西林等）現(xiàn)在可能變得不敏感或耐藥。因此，在對禽大腸桿菌病進行防治時，應(yīng)進行藥敏試驗，選擇敏感的藥物使用，而且最好能選用幾種藥物交替使用，并嚴(yán)格按療程和劑量用藥，以防止耐藥菌株的出現(xiàn)。徐樹強等[5]對從揚州地區(qū)分離鑒定出42株雞大腸桿菌，用15種藥物進行敏感試驗，結(jié)果表明所有分離菌株對丁胺卡那霉素、卡那霉素和新霉素均敏感，對復(fù)方新諾明、鏈霉素和四環(huán)素均耐藥；劉明生等[2]從海安地區(qū)分離并鑒定出198株雞大腸桿菌，用18種藥物對其進行藥敏試驗，結(jié)果表明分離的大腸桿菌多數(shù)對頭孢噻呋、頭孢噻肟、阿米卡星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星高度敏感，對四環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、頭孢氨芐耐藥。翟向和等[6]檢測了38株雞源大腸桿菌對24種常用藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有不同程度的耐藥性，且大多為多重耐藥，其中36株對 5 種或 5種以上的藥物產(chǎn)生了耐藥性。

在此次藥敏試驗使用的藥物中，大腸桿菌對氨芐青霉素、四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素、鏈霉素等有很強的耐藥性。大多數(shù)菌株對硫酸黏菌素、頭孢噻呋、頭孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星等敏感性較高，這為今后選擇臨床藥物來防治大腸桿菌病提供了科學(xué)依據(jù)和參考。

參考文獻(xiàn)

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