UPLC法測(cè)定整參·須根和蘆頭中人參皂苷的含量

趙琳琳 趙云平 魏靜娜

摘要 [目的]建立適用于整參、須根、蘆頭中人參皂苷的超高效液相色譜（UPLC）檢測(cè)方法，同時(shí)測(cè)定人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。[方法]采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）分離，流動(dòng)相為乙腈-0.1 mol/L磷酸溶液，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min。[結(jié)果]人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、RC、Rb2、Rd線性關(guān)系良好，回收率在87.3%～98.6%。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于整參、須根、蘆頭中人參皂苷的定量分析。

關(guān)鍵詞 人參皂苷；超高效液相色譜法；整參；須根；蘆頭

中圖分類號(hào) S567.5+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0138-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish a chromatographic separation method for the determination of ginsenosides in the whole ginseng， fibrous root and root refs.Ginsenosides Rg1，Re，Rf，Rg2，Rb1，Rc，Rb2 and Rd were determined.[Method]The separation was performed by a ACQUITY UPLC BEH C18 column （1.7 μm， 2.1 mm× 50 mm）， the mobile phase was acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min， the detection wavelength was set at 203 nm， and the column temperature was 35 ℃. [Result]The method showed a good linear relationship of ginsenosides Rg1， Re， Rf， Rg2， Rb1， Rc， Rb2， Rd.Recovery rate was from 87.3% to 98.6%.[Conclusion]This method is accurate and good reproducibility，and suitable for the determination of ginsenosides in the whole ginseng， fibrous root and root refs.

Key words Ginsenosides； UPLC； Whole ginseng；Fibrous root；Root refs

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科植物人參的根，是我國(guó)珍貴中草藥材[1-2]，主要功能有復(fù)脈固脫、補(bǔ)脾益腎、生津養(yǎng)血、安神益智。研究表明，人參具有抗腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)活性、心腦血管系統(tǒng)活性、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[3]。人參中有多種獨(dú)特活性成分包括人參皂苷、人參揮發(fā)油、人參多糖、人參多肽等，其中人參皂苷含量的高低是考察人參質(zhì)量的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[4-5]。

人參皂苷可通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖、減少癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、影響癌細(xì)胞周期、誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮抑癌功效，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從分子水平上研究了人參皂苷及其衍生物抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制，主要涉及到了線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及WNT/β-catenin信號(hào)通路，通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低新生血管的生成，減少癌細(xì)胞的侵襲和遷移，最終誘導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞自噬和凋亡[6]。人參皂苷Rg1與Rb1作為人參益智作用的主要活性成分，可通過(guò)改變腦內(nèi)主要神經(jīng)遞質(zhì)的量、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中蛋白分子等，改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶行為能力[7]。張有為等[8]利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色法檢測(cè)了27種人參皂苷和皂苷元對(duì)體外培養(yǎng)的人體骨肉瘤細(xì)胞U2OS的增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷均有不同的抗U2OS活性，其中Rf活性最強(qiáng)。人參皂苷Rb1能夠通過(guò)上調(diào)脂肪組織周脂素的表達(dá)，減少游離脂肪酸的釋放和甘油三酯的異位沉積，這可能是其改善機(jī)體胰島素抵抗和糖代謝異常的作用機(jī)制之一[9]。周玥等[10]利用Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植建立Sca-1+HSC/HPC小鼠衰老體內(nèi)模型，研究人參皂苷Rg1延緩衰老的作用與相關(guān)衰老信號(hào)分子之間的關(guān)系，為人參皂苷Rg1抗衰老作用提供試驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)上述文獻(xiàn)報(bào)道可以看出，人參皂苷在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疑難病的治療中發(fā)揮的作用得到了深入的研究。

人參皂苷類成分分析多采用高效液相色譜串聯(lián)紫外分光光度法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)法、薄層色譜法、比色法等[11-14]，其中高效液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器法因其準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好而得到廣泛應(yīng)用，但人參皂苷類成分結(jié)構(gòu)差異在糖的位置、數(shù)量，極性非常相近難以達(dá)到很好的分離[15]，導(dǎo)致色譜分析時(shí)間需要80～100 min才能將其有效分離。筆者采用超高效液相色譜（UPLC）串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器，在保持較高分離度的前提下，將分離時(shí)間控制在35 min以內(nèi)，建立了整參、須根、蘆頭中8種人參皂苷定量分析方法，為人參皂苷的合理開(kāi)發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材 參皂苷Rg1（批號(hào)R-015-130823，純度≥98%），人參皂苷Re（批號(hào)R-020-131117，純度≥98%），人參皂苷Rf（批號(hào)R-021-131217，純度≥98%），人參皂苷Rg2（批號(hào)R-016-131228，純度≥98%），人參皂苷Rb1（批號(hào)R-021-131122，純度≥98%），人參皂苷Rc（批號(hào)R-008-131128，純度≥98%），人參皂苷Rb2（批號(hào)R-013-131111，純度≥98%），人參皂苷Rd（批號(hào)R-009-130826，純度≥98%），均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；二氯甲烷（AR）、正丁醇（AR）均購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸（HPLC級(jí)）購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙腈（HPLC級(jí)）購(gòu)自Merck公司；水為超純水。

1.2 儀器 超高效液相色譜儀Waters Quatemary Solvent Manager；超聲波清洗器為AS系列超聲波清洗器，天津Autoscience儀器有限公司；電子分析天平METTLER AB54、METTLER XS205。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）：流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～4 min（19%A），4～11 min（19%A～25%A），11～33 min（25%A～33%A），33～34 min（33%A～19%A），34～40 min（19%A）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制。精密稱取8種人參對(duì)照品，加甲醇溶解，配置濃度為人參皂苷Rg1 0.507 mg/mL、Re 0.508 mg/mL、Rf 0.407 mg/mL、Rg2 0.392 mg/mL、Rb1 0.867 mg/mL、Rc 0.351 mg/mL、Rb2 0.395 mg/mL、Rd 0.608 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 供試品溶液制備。分別精密稱取整參、須根、蘆頭粉末0.2 g（精確到±0.0001 g），置索式提取器中，加入二氯甲烷80 mL，加熱回流3 h后，棄去二氯甲烷液，殘?jiān)鼡]干溶劑，連同濾紙移入錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇25 mL，密塞，浸泡4 h，超聲30 min，濾過(guò)，用水飽和正丁醇少量多次沖洗濾紙，合并濾液和洗液，放置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙廪D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度搖勻，濾過(guò)，即得。

1.3.4 方法學(xué)考察。

1.3.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各2 μL，在“1.3.1”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

1.3.4.2 線性關(guān)系的考察。取“1.3.2”人參皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、150、200、250 μL于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，得到人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，以不同濃度為橫坐標(biāo)、不同濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 精密度試驗(yàn)。精密吸取人參皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL，按照“1.3.1”操作步驟連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)得8種人參皂苷的RSD。

1.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，以“1.3.1”色譜條件，每次進(jìn)樣2 μL，分別在2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)定8種人參皂苷的RSD。

1.3.4.5 回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量整參樣品6份，每份0.1 g，加入對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”制備供試品溶液，再按“1.3.1”色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.3.5 樣品含量測(cè)定。分別取整參、須根、蘆頭2個(gè)批次樣品，每個(gè)樣品做6個(gè)平行，按照“1.3.3”方法制備供試品溶液，精密吸取2 μL，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算樣品中的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。從圖1可以看出，Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的色譜峰與相鄰的色譜峰的分離度均大于1.5，Rg1、Re也可以有效分離，說(shuō)明此條件適合人參皂苷的測(cè)定。

2.1.2 線性關(guān)系的考察。按照“1.3.4.2”操作，得到8種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，以不同濃度為橫坐標(biāo)、不同濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb、Rc、Rb2、Rd的線性回歸方程分別為：Y=45 804x-32 340（r=0.999）、Y=38 838x-15 476（r=0.998）、Y=48 246x-15 729（r=0.997）、Y=40 851x-2 3731（r=0.996）、Y=32 643x+2 790（r=0.998）、Y=33 112x-12 734（r=0.996）、Y=31 943x-5 350（r=0.999）、Y=40 657x-1 2313（r=0.998），表明8種人參皂苷分別在0.254～1.266、0.254～12.270、0.204～1.018、0.196～0.980、0.434～2.168、0.176～0.878、0.198～0.988、0.304～1.520 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按照“1.3.4.3”操作，連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的RSD分別為0.88%、0.97%、0.18%、2.19%、1.67%、0.20%、1.75%、0.88%，表明精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.3.4.4”操作，測(cè)定人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的RSD分別為2.06%、2.17%、2.74%、1.91%、2.83%、2.75%、1.98%、1.70%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 回收率試驗(yàn)。從表1可以看出，8種人參皂苷回收率為87.3%～98.6%，RSD為1.04%～2.77%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，符合相關(guān)要求。

2.2 樣品含量測(cè)定 從表2可以看出，整參、須根和蘆頭中Rf、Rg2和Rd的含量較低，整參和須根中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2含量較高；蘆頭中Rg1、Re含量較高。不同樣品中人參皂苷含量由高到低的順序?yàn)轫毟?、整參、蘆頭。

3 結(jié)論與討論

在樣品提取過(guò)程中，先嘗試了水飽和正丁醇直接提取和水提后利用D101大孔樹(shù)脂凈化，前者進(jìn)樣后雜質(zhì)較多，分離度較差，后者回收率較低。故筆者在水飽和正丁醇提取之前比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷脫脂，乙酸乙酯脫脂效果不佳，二氯甲烷與三氯甲烷脫脂后，樣品峰可以有效分離，但三氯甲烷毒性較大，該試驗(yàn)采用二氯甲烷來(lái)進(jìn)行脫脂；同時(shí)又比較了水飽和正丁醇浸泡時(shí)間，分別為1、2、4、8、16、24 h，人參總皂苷浸泡4～16 h含量變化不大，故采用浸泡4 h。該研究最終采用方法為二氯甲烷脫脂后，水飽和正丁醇浸泡4 h超聲處理，進(jìn)樣雜質(zhì)峰干擾較少，分離度較好。

流動(dòng)相的選擇比較了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液。乙腈-0.1%甲酸溶液不能有效分離并且基線波動(dòng)較明顯；乙腈-水色譜峰可以分離，但是人參皂苷Rg1與Re極性相似，出峰時(shí)間接近，2個(gè)峰不能完全有效分離。該研究采用乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈在4～11 min，比例從19%逐漸變化到25%的過(guò)程中，Rg1與Re可有效分離。

試驗(yàn)結(jié)果表明，整參、須根和蘆頭中Rf、Rg2和Rd的含量較低，整參和須根中Rg、Re、Rb1、Rc、Rb2含量較高；蘆頭中Rg1、Re含量較高。雖然人參須不作為主要的用藥部位，但是因其人參皂苷含量較高，可以考慮特殊用藥情況下人參須代替人參作為用藥部位。該試驗(yàn)結(jié)果為人參皂苷的提取與用藥提供參考依據(jù)，因試驗(yàn)樣品數(shù)量有限，為了進(jìn)一步的統(tǒng)籌分析，還需增加樣品數(shù)量進(jìn)行數(shù)據(jù)累積。通過(guò)試驗(yàn)中UPLC方法優(yōu)化縮短了進(jìn)樣分析時(shí)間，增加方法準(zhǔn)確性，并且方法穩(wěn)定性好，回收率較高，適用于人參皂苷類物質(zhì)的定量分析。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：北京人民衛(wèi)生出版社，2015.

[2] 潘堅(jiān)揚(yáng)，程翼宇，王毅，等.9種人參皂苷同時(shí)測(cè)定方法及在人參質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用[J].分析化學(xué)，2005，33（11）：1565-1568.

[3] 黎陽(yáng)，張鐵軍，劉素香，等.人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2009，40（1）：164-166.

[4] 孫成賀，王英平.HPLC-ELSD法測(cè)定人參莖、葉、根中7種人參皂苷含量[J].特產(chǎn)研究，2009，31（4）：54-60.

[5] 曾偉杰，梁淑明，高凱雯.HPLC法快速測(cè)定人參提取物中7種人參皂苷含量[J].農(nóng)業(yè)工程，2012，2（3）：47-50.

[6] 趙琛，蘇光悅，趙余慶.人參皂苷及其衍生物抗結(jié)腸癌作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（16）：2477-2483.

[7] 王瓊，王逸，韓春勇，等.人參皂苷Rg1、Rb1及其代謝產(chǎn)物益智作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2014，46（13）：1960-1965.

[8] 張有為，竇德強(qiáng)，陳英杰，等.人參皂苷對(duì)人體骨肉瘤細(xì)胞U2OS增殖的影響[J].中草藥，2001，32（3）：232-236.

[9] 尚文斌，于希忠，王國(guó)強(qiáng)，等.人參皂苷Rb1改善高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠胰島素抵抗和脂肪異位沉積[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（23）：4119-4123.

[10] 周玥，姜蓉，姚欣，等.人參皂苷Rg1在造血干/祖細(xì)胞連續(xù)移植中抗細(xì)胞衰老的作用機(jī)制[J].中草藥，2013，44（21）：3011-3017.

[11] 許傳蓮，鄭毅男，崔淑玉，等.RP-HPLC法測(cè)定西洋參莖葉中6種人參皂苷的含量[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（3）：50-52.

[12] 劉丹，濮社班，朱玲英，等.PR-HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地紅參中6種人參皂苷的含量[J].藥學(xué)進(jìn)展，2011，35（6）：278-281.

[13] 張玉婷，馮克然，曹進(jìn)，等.UPLC法評(píng)價(jià)多種人參提取物中人參皂苷的含量[J].食品科學(xué)，2013，32（24）：102-106.

[14] 趙亮，呂磊，紀(jì)松崗，等.高校液相色譜法快速測(cè)定人參中8種主要皂苷類成分的含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（12）：1507-1510.

[15] ZENG F，WANG X M，YANG M，et al.Fingerprint analysis of different Panax herbal species by HPLC-UV method[J].J Chin Pharm Sci，2007，16（4）：277-281.