多花黃精不同齡須根藥材質(zhì)量研究

陳怡 姚云生 陳松樹 劉紅昌 趙致

摘要：為了進(jìn)一步了解多花黃精須根的價值，擴(kuò)展多花黃精藥用部位，緩解市場供需矛盾，充分利用資源。本文按照2015版《中國藥典》（一部和四部）測定多花黃精不同齡須根水分、浸出物、灰分和多糖含量，利用比色法測定黃酮含量。結(jié)果表明：（1）多花黃精須根的水分含量為524%～553%，灰分含量為733%～867%，醇溶出物含量為4088%～4930%，水溶出物含量為3476%～3604%，多糖含量為574%～783%，黃酮含量為017%～028%;（2）多花黃精一年齡和二年齡須根多糖含量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。所以，以多糖為主要藥效成分時，適當(dāng)調(diào)整處方量，多花黃精須根可以部分替代塊莖使用。研究表明多花黃精須根具有一定的潛在藥用價值，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

關(guān)鍵詞：多花黃精;須根;質(zhì)量

中圖分類號：S56723

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）06-0061-03國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.011

Study on the Quality of Radix in Different Ages of Polygonatum cyrtonema Hua

CHEN Yi1，YAO Yun-sheng1， CHEN Song-shu1，LIU Hong-chang1，2，ZHAO Zhi1，2*

（1.College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025，China; 2.Laboratory about Breeding and Planting of Traditional Chinese Medicine in Guizhou， Guiyang， Guizhou 550025，China）

Abstract：In order to further understand the value of Polygonatum cyrtonema Hua，and extend their medicinal parts to alleviate the contradiction between supply and demand in the market and make full use of resourcesIn this paper， the water content， extract， ash and polysaccharide content of P cyrtonema Hua were determined according to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （Part 1 and 4） The flavonoid content was determined by colorimetryResults：（1）the water content of fibrous root of P cyrtonema Hua was 524%～553%， ash content was 733%～867%， alcohol content was 4088%～4930%， water content was 3476%～3604%， polysaccharide content was 574%～783%， flavonoids content was 017%～028%;（2）Annual roots and biennial roots of P cyrtonema Hua meet the pharmacopoeia standards Therefore， when polysaccharides are the main medicinal ingredient， the amount of prescription is appropriately adjusted， and the yellow roots can partially replace the tuberIn conclusion，Polygonatum cyrtonema Hua has a certain potential medicinal value and deserves further research

Key words：Polygonatum cyrtonema Hua; root; quality

多花黃精P cyrtonema Hua是中藥材黃精P Rhizoma的基源植物之一，用于脾胃氣虛，體倦乏力，胃陰不足，口干食少，肺虛燥咳，勞嗽咳血，精血不足，腰膝酸軟，須發(fā)早白，內(nèi)熱消渴[1]。多花黃精主產(chǎn)于貴州、湖南、云南、浙江、安徽等地區(qū)[2]。多花黃精的塊莖一般每年向前伸長一節(jié)，當(dāng)年新生1節(jié)塊莖，稱一年齡塊莖，該塊莖上的須根稱一年齡須根，與其相連接的1節(jié)塊莖，稱二年齡塊莖，該塊莖上的須根稱二年齡須根，依此類推。

近年來，黃精藥用價值和營養(yǎng)保健等價值不斷被挖掘，而其藥用價值主要集中在多糖和黃酮含量上。據(jù)“中藥材天地網(wǎng)”調(diào)查，目前年需求量在3500～4000 t，2015年版《中國藥典》規(guī)定的滇黃精Polygonatum kingianum、黃精Psibiricum和多花黃精Pcyrtonema 3種基原植物蘊(yùn)藏量正急劇下降[3]。目前，傳統(tǒng)經(jīng)驗認(rèn)為多花黃精炮制前處理需剪去塊莖上須根[4]，為了進(jìn)一步了解多花黃精須根的價值，擴(kuò)展多花黃精藥用部位，緩解市場供需矛盾，充分利用資源，本研究對多花黃精須根進(jìn)行質(zhì)量考察，為須根的合理利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11供試材料

供試材料于2018年10月采自貴州大禹王農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司黃精種植基地，種植年限為五年，經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)院趙財副教授鑒定為多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua。洗凈材料，將須根按不同年齡分開（4年齡和5年齡塊莖上須根已脫落），再用去離子水清洗，晾干表面水分后，稱重，然于置于105℃條件下殺青30 min，60℃烘至恒重，稱重，粉碎，過五號篩，備用。

本研究以三穗鴨為試驗材料，檢測ITPR1基因的遺傳變異，分析其與蛋殼品質(zhì)的相關(guān)性，探討其對蛋殼性狀的效應(yīng)機(jī)制及其在蛋殼品質(zhì)改良上的應(yīng)用價值，為開展分子標(biāo)記育種加快提高蛋殼質(zhì)量提供參考，并為深入研究IP3R3基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，提高鴨蛋品質(zhì)。

1材料與方法

11試驗動物及樣品采集

隨機(jī)選擇飼養(yǎng)于貴州大學(xué)家禽研究所的同日出雛、健康無病、相同飼養(yǎng)管理條件下的三穗鴨母鴨144只，對90日齡鴨翅靜脈采血02～05 mL。采用血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304）（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA，12%瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP2000 DNA濃度測定儀（美國Thermo Scientific公司）聯(lián)合評估提取質(zhì)量，稀釋成100 ng/μL進(jìn)行保存?zhèn)溆?，并收?5周齡的鴨蛋。

12鴨蛋殼品質(zhì)的測定

將收集的鴨蛋使用分析天平測定蛋重和蛋殼重量，采用蛋殼厚度測定儀 （Egg Shell Thickness Gauge，Orka Technology Ltd） 測定蛋殼厚度，蛋殼強(qiáng)度分析儀 （Egg Force Reader，Orka Technology Ltd） 測定蛋殼強(qiáng)度;蛋形指數(shù)的測定用游標(biāo)卡尺測量蛋殼的縱徑和橫徑，計算蛋的縱橫之比，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

13引物設(shè)計和目的片段的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中CALM1基因mRNA（登錄號：XM_0274578581）的序列信息，利用Primer 3 在線軟件（http：//primer3utee/）和 UCSC（https：//genomeucscedu/） 對該基因的全部外顯子和部分內(nèi)含子設(shè)計引物，引物信息見表1。擴(kuò)增總體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系：1 μL基因組 DNA模板，10 μL 2xEs Taq Master Mix，7 μL ddH2O，10 pmol/μL的上游引物和下游引物各1 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性8 min;95 ℃變性50 s，退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán);72 ℃終延伸6 min。

14篩選鑒定多態(tài)位點

對144只三穗鴨CALM1基因的每個擴(kuò)增片段進(jìn)行純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司直接測序，采用DNAMAN和Chromas軟件進(jìn)行SNPs篩查和鑒定。

15數(shù)據(jù)統(tǒng)計和生物信息學(xué)分析

使用Excel 2016，統(tǒng)計CALM1各個位點的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）和Hardy￣Weinberg平衡定律適合性檢驗。用SPSS 180 軟件程序中一般線性模型完成三穗鴨CALM1基因SNPs位點基因型與蛋殼表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2結(jié)果與分析

21SNPs位點的篩選

通過在線軟件設(shè)計的6對特異性引物，對三穗鴨CALM1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用DNA直接測序法測序，測序結(jié)果表明，一共發(fā)現(xiàn)3個突變SNPs位點（圖1），分別位于第2內(nèi)含子g21554634A>G、第3內(nèi)含子g21554954T>C突變和第4內(nèi)含子g21558072A>T。

22SNPs位點的群體遺傳信息分析

通過對144只三穗鴨群體遺傳信息分析，結(jié)果表明：g21554634A>G位點的優(yōu)勢基因型為AA，頻率為0451，優(yōu)勢等位基因為A，頻率為0670，雜合度為1793，多態(tài)信息含量為0334，屬于中度多態(tài)（050>P>025）（表2）;g21554954T>C位點的優(yōu)勢基因型為TT，頻率為0590，優(yōu)勢等位基因為T，頻率為0778，雜合多為1528，多態(tài)信息含量為0286，屬于中度多態(tài)（050>P>025）;g21554954T>C優(yōu)勢基因型為AA，頻率為0542，優(yōu)勢等位基因為A，頻率為0708，雜合度為1704，多態(tài)信息為0328，屬于中度多態(tài)（050>P>025）?？ǚ剑?）檢驗結(jié)果顯示，各位點基因型分布未偏離Hardy￣Weinberg平衡（P>005）。

23SNPs位點各基因型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

三穗鴨CALM1基因的SNPs位點各基因型與蛋殼品質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。從表可知：g21554634A>G位點的AG、GG基因型個體與AA基因型個體蛋殼厚度呈顯著差異（P<005），AA型基因個體與AG、GG型基因個體的蛋殼強(qiáng)度差異

極顯著（P<001），AA、AG基因型與GG基因型個

體蛋重呈顯著差異（P<005）;g21554954T>C位點的CC基因型個體與TT、TC基因型個體蛋殼厚度呈顯著差異（P<005），TT型基因個體與TC、CC型基因個體的蛋殼強(qiáng)度差異極顯著（P<001），TT、TC基因型與CC基因型個體蛋重呈顯著差異（P<005）;g21558072A>T位點的AT、TT基因型個體與AA基因型個體蛋殼厚度呈顯著差異（P<005），AA型基因個體與AT、TT型基因個體的蛋殼強(qiáng)度差異極顯著（P<001），AA、AT基因型與TT基因型個體蛋重呈顯著差異（P<005）;其他蛋殼品之間無顯著關(guān)聯(lián)。

3結(jié)論與討論

CALM1作為一種遺傳因子，在動物體內(nèi)起著重要的作用，與CALM2和CALM3共同編碼CaM，這是一種普遍存在的、高度保守的Ca2+結(jié)合蛋白[13]。本研究以三穗鴨為材料，通過對CALM1基因檢測，共檢測到3個SNPs位點，分別位于第2內(nèi)含子g21554634A>G、第3內(nèi)含子g21554954T>C