杜仲SQS基因的特征信息分析

雷躍 楊仕梅 張?zhí)炀? 趙德剛 宋莉

摘要：鯊烯合酶（SQS）是催化植物細(xì)胞合成甾醇和三萜類化合物的一種關(guān)鍵酶。為探明杜仲SQS基因家族成員的存在及其特性，本文通過生物信息學(xué)分析方法，對(duì)杜仲SQS基因（EuSQS）進(jìn)行發(fā)掘，并對(duì)其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、染色體定位、蛋白理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、調(diào)控元件等進(jìn)行分析。從杜仲基因組數(shù)據(jù)中獲得3條EuSQS基因，它們分布于不同的scaffold上，有5 ～6個(gè)外顯子;EuSQS蛋白含396～ 440 aa，相對(duì)分子質(zhì)量為4573 ～ 4906 kDa，均屬于不穩(wěn)定蛋白，主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成;EuSQS1和EuSQS3在結(jié)構(gòu)上較為接近，二者與EuSQS2差異較大;除含有基本元件外，EuSQSs的順式作用元件還包括光照和激素響應(yīng)、分生組織表達(dá)、逆境脅迫及類黃酮生物合成等六類;在進(jìn)化關(guān)系上，杜仲EuSQSs與產(chǎn)膠植物橡膠草及橡膠樹的親緣關(guān)系較近。分析結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)EuSQS基因的功能鑒定和利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：杜仲鯊烯合酶基因;萜類化合物;生物信息學(xué);基因結(jié)構(gòu);功能預(yù)測

中圖分類號(hào)：Q8114

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）06-0001-07國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.001

Characteristic Information Analysis of Eucommia ulmoides SQS Gene

LEI Yue1，YANG Shi-mei1，ZHANG Tian-yuan1，ZHAO De-gang1，2，SONG Li1*

（1. Institute of College of Life Sciences and Agro-Bioengineering，Guizhou University/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/ Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2. Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Squalene synthase （SQS ）is a key enzyme catalyzing the formation of sterols and triterpenes in plant cellsIn order to explore the? existence and characteristics of the? SQS gene family members of? Eucommia ulmoidesthe Eucommia ulmoides SQS genes （EuSQSs ）were screened and further analyzed for a better cognition by bioinformatic analysis including phylogenetic evolution，gene structure，conserved motif，chromosome positioning，the physicochemical properties，spatial structure and regulatory elements etcThe results showed that three EuSQS genes scattering different scaffold were obtained from the genome data，which have 5-6 of exonsEuSQS proteins were composed of 396-440 aa with a relative molecular weight of 4573 ～ 4906 kDaThe main structure of α- helix and random coil were found in these unstable proteinsEuSQS1 and EuSQS3 are similar in structure，but they are quite different comparing with EuSQS26 types of cis-acting elements related to gene regulation including basic elements，photoresponse，hormone response，meristem expression，stress tolerance and flavonoid biosynthesis also were found in the EuSQS genesIn terms of evolutionary relationship，Eucommia ulmoides EuSQS is closely related to the Taraxacum kok-saghyz and Hevea brasiliensis based on the phylogenetic analysisThis study preliminarily revealed the EuSQS molecular characteristics，which laid a good foundation for further study on the function of EuSQS genes.

在城市化和工業(yè)化不斷發(fā)展過程中，土壤重金屬污染的問題逐漸凸顯，已對(duì)糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。貴州省礦產(chǎn)資源豐富，磷礦、鋁礦開采和冶煉是貴陽市的支柱產(chǎn)業(yè)，上世紀(jì)80年代小煤礦無序開采產(chǎn)生的環(huán)境污染仍未得到有效治理。同時(shí)，城市周邊蔬菜產(chǎn)地養(yǎng)殖廢水灌溉普遍存在，以上所述都屬于典型的污染區(qū)域。研究表明：貴陽市周邊土壤存在重金屬污染[2]，工礦區(qū)土壤重金屬均高于其他功能區(qū)，如白云區(qū)工業(yè)園（以鋁工業(yè)為主）附近土壤重金屬含量都超過貴州省背景值[3]，貴陽市某養(yǎng)殖廢水污灌區(qū)土壤Cd嚴(yán)重超標(biāo)[4]，花溪和烏當(dāng)?shù)鹊刂蠧d為特征污染元素[5]。貴陽市是喀斯特地質(zhì)背景，碳酸鹽巖和黑色巖系等母巖風(fēng)化的土壤，重金屬具有較高的本底值，屬于重金屬地球化學(xué)高背景區(qū)[6]。目前，對(duì)土壤重金屬污染現(xiàn)狀和評(píng)價(jià)研究較多，但對(duì)地質(zhì)高背景下污染區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全與農(nóng)作物吸收富集規(guī)律的研究相對(duì)較少。

農(nóng)產(chǎn)品中重金屬富集特征一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7-8]，不同植物、相同植物不同品種對(duì)重金屬的吸收積累效應(yīng)都存在差異，通常用富集系數(shù)來表征植物對(duì)重金屬的吸收及累積能力。何玉生等[9]對(duì)海口市四大蔬菜基地土壤-蔬菜系統(tǒng)重金屬富集研究發(fā)現(xiàn)：葉菜類蔬菜中Pb、Cd、Cr等含量明顯高于瓜果類;根據(jù)地上部Cd含量的顯著性，可篩選出重金屬低積累型的大白菜品種;蔬菜對(duì)不同重金屬的富集能力表現(xiàn)為Cd>As>Cu>Pb>Hg>Cr[10]。另有研究表明[11]：不同品種的蔬菜對(duì)Cr富集差異較大，Cd次之，Pb、As和Hg相對(duì)較小。目前，鎘米一直是土壤重金屬和食物鏈安全研究的焦點(diǎn)。稻米鎘超標(biāo)除受土壤鎘含量的影響外，土壤pH是最大的影響因素。酸性條件會(huì)促進(jìn)水稻根系對(duì)Cd的吸收，往往在土壤Cd未超標(biāo)的情況下也會(huì)生產(chǎn)出鎘米。貴州省農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標(biāo)現(xiàn)象屢見報(bào)道，多數(shù)與礦產(chǎn)資源開發(fā)與利用有關(guān)。

為探討地質(zhì)高背景下典型污染區(qū)農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染狀況及安全風(fēng)險(xiǎn)，本研究選取貴陽市磷礦區(qū)、煤礦區(qū)、鋁礦冶煉區(qū)和養(yǎng)殖廢水灌溉區(qū)為研究區(qū)域，以沒有外源污染的區(qū)域作為對(duì)照，對(duì)研究區(qū)的土壤、蔬菜及水稻重金屬進(jìn)行調(diào)查研究，為區(qū)域土壤重金屬污染防治、蔬菜和水稻安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11樣品采集與處理

圖1是不同污染區(qū)域分布圖。以貴陽市各行政區(qū)（縣）為劃分規(guī)則，分別是：開陽縣磷礦區(qū)（KY），是典型的磷礦資源開采區(qū)域;花溪煤礦區(qū)（JA），花溪區(qū)麥坪鄉(xiāng)分布了很多小煤窯開采的廢棄礦洞，現(xiàn)仍然在持續(xù)排放酸性礦山廢水，沒有得到有效治理;白云區(qū)鋁礦冶煉區(qū)（BY），是中鋁貴州分公司和貴州鋁廠所在區(qū)域;烏當(dāng)區(qū)養(yǎng)殖廢水灌溉區(qū)（WD），以養(yǎng)豬場排放的廢水作為灌溉水源;以清鎮(zhèn)市紅楓湖水上訓(xùn)練基地作為對(duì)照區(qū)（QZ）。每個(gè)研究區(qū)采集10～16個(gè)土壤樣品，每個(gè)樣品采集 0～20 cm 耕層土壤，采用不均勻的“S”形布點(diǎn)法，不少于5個(gè)點(diǎn)的混合樣，用四分法取1～2 kg 后裝在布袋里，共采集62個(gè)土壤樣品。

以土壤樣品對(duì)應(yīng)采集蔬菜樣品，包括蔥、蒜苗、辣椒、豇豆、豆角、黃瓜、南瓜、茼蒿菜、空心菜、白菜、茄子、小瓜、蘿卜、蘿卜菜、稻米等十多種農(nóng)產(chǎn)品品種，按照其生物特性將其分為瓜果類、葉菜類和根莖類。帶回實(shí)驗(yàn)室后，選取可食部分，用自來水和去離子水洗凈，晾干，放置于烘箱內(nèi)85 ℃下殺青1 h，拿出樣品待其降至室溫后，放于烘箱70 ℃下至恒重（約3～4 h），粉碎后過60目篩，裝入自封袋內(nèi)，編號(hào)，待測。

12樣品檢測方法與數(shù)據(jù)處理

土壤樣品采用王水進(jìn)行水浴消解后測定;蔬菜樣品采用硝酸￣電熱板消解后測定;土壤和蔬菜待測液中重金屬含量均采用美國熱電Thermo電感耦合等離子體質(zhì)譜儀X2（ICP￣MS）測定，整個(gè)分析過程所用試劑均為優(yōu)級(jí)純（GR），實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水（DI water），所有玻璃器皿均在10%的硝酸中浸泡24 h以上。分析過程中采用空白樣、平行雙樣，設(shè)置3組平行，并使用國家植物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GSV￣2）對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中Cr、Cu、Zn、As、Cd、Pb濃度的分析測定進(jìn)行質(zhì)量控制。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率均在推薦值的95%～105%以內(nèi)，土壤樣品加標(biāo)回收率為 92%～105%，樣品回收率較好。所有數(shù)據(jù)均通過異常值檢驗(yàn)篩選后采用Excel 2007、Origin80數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

13土壤重金屬污染評(píng)價(jià)方法

運(yùn)用綜合污染指數(shù)法中的內(nèi)梅羅指數(shù)法[12]對(duì)各研究區(qū)進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，計(jì)算公式如下：

15富集系數(shù)（BCF）

富集系數(shù)（BCF）計(jì)算，是指植物體系某種重金屬含量與土壤中對(duì)應(yīng)元素含量的比值[8]，可以反映出植物對(duì)土壤重金屬元素的累積能力。其計(jì)算公式為：

2結(jié)果與分析

21不同污染區(qū)土壤重金屬污染評(píng)價(jià)

通過對(duì)污染區(qū)土壤綜合污染指數(shù)評(píng)價(jià)（表1）可知：磷礦區(qū)、鋁礦冶煉區(qū)和煤礦區(qū)，綜合污染因子分別為118、117、134，達(dá)輕度污染水平。如圖2所示，磷礦區(qū)土壤重金屬Cd含量均值為046 mg/kg，對(duì)比農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值（GB15618—2018），超標(biāo)15倍，顯著高于對(duì)照區(qū);鋁礦冶煉土壤主要受到附近赤泥堆的影響，赤泥滲透液造成該地土壤Cd及部分As超標(biāo)。煤礦區(qū)土壤中Cu、Cd含量均值分別為8707、036 mg/kg，分別超標(biāo)174和12倍（GB15618—2018），煤礦區(qū)Cu含量顯著高于其余研究區(qū)，土壤pH為426，與磷礦區(qū)、對(duì)照區(qū)存在極顯著差異（P<001），可能原因是該地水稻田灌溉水源自上游的酸性礦山廢水。該地土壤有機(jī)質(zhì)含量均值達(dá)14037 g/kg，顯著高于磷礦區(qū)，與其余研究區(qū)無顯著差異。養(yǎng)殖廢水灌溉區(qū)土壤中土壤Pb含量顯著高于鋁礦冶煉區(qū)、煤礦區(qū)和對(duì)照區(qū)，土壤Cd、Zn含量均值為078和23119 mg/kg，Cd超標(biāo)26倍（GB15618—2018），Cd、Zn含量均顯著高于其余研究區(qū)，其污染指數(shù)為201（表1），達(dá)到中度污染水平。

運(yùn)用土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB15618—2018）對(duì)污染區(qū)土壤進(jìn)行類別劃分：Ⅰ類土壤為優(yōu)先保護(hù)類，Ⅱ類土壤為安全利用類，Ⅲ類土壤為嚴(yán)格管控類。由表2可知，污染區(qū)土壤2個(gè)為Ⅲ類土壤外，其余45個(gè)土壤都屬于Ⅱ類土壤，表明各污染區(qū)土壤均受到重金屬污染。除Cr外，污染區(qū)土壤中其余重金屬元素都存在不同情況的點(diǎn)位超標(biāo)，Cd為特征污染元素，總點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)8085%。

22不同污染區(qū)蔬菜和水稻重金屬含量特征及污染評(píng)價(jià)

將研究區(qū)蔬菜按不同種類進(jìn)行劃分后，對(duì)比食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2762—2017）表明（見圖3），污染區(qū)各類蔬菜重金屬均值含量未超過食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)，煤礦區(qū)稻米樣品中存在Cd、Cu、Zn超標(biāo)的現(xiàn)象，說明當(dāng)?shù)乩玫V山廢水灌溉農(nóng)田存在一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，不利于水稻的種植。該區(qū)域土壤Zn不超標(biāo)的情況下稻米受到污染，有可能是水稻生長過程中根系分泌小分子有機(jī)酸，促進(jìn)了根系的差異性。再者，該地土壤pH低至448，有機(jī)質(zhì)高達(dá)14037 g/kg，說明土壤中有機(jī)質(zhì)含量的增加對(duì)重金屬有效態(tài)含量具有促進(jìn)作用。土壤酸化不僅是受煤礦開采的影響，也可能是黑色巖系風(fēng)化的結(jié)果。有學(xué)者指出，黑色巖系風(fēng)化過程會(huì)導(dǎo)致土壤pH過低[15]。

從單因子污染指數(shù)可以看出（表3），該批蔬菜中磷礦區(qū)辣椒和鋁礦冶煉區(qū)豆角存在Cd污染現(xiàn)象（Pcd≥1），污染的主要原因在于對(duì)應(yīng)土壤Cd點(diǎn)位超標(biāo)和部分瓜果類蔬菜對(duì)Cd的富集能力較強(qiáng)，其余蔬菜均未受到污染（Pi<1），處于安全生產(chǎn)水平，食用較為安全;同種蔬菜在不同的重金屬間單因子污染指數(shù)不同，不同種蔬菜在同種重金屬中的污染指數(shù)也不同，這是由于不同研究區(qū)土壤污染狀況不同以及蔬菜間的富集差異所致。根據(jù)綜合污染指數(shù)來看，除上述蔬菜受Cd 影響導(dǎo)致輕度污染外，其他品種蔬菜都在清潔范疇內(nèi)。煤礦區(qū)稻米存在不同程度的污染，最大綜合污染指數(shù)達(dá)3983，單因子污染指數(shù)PCu﹥PCd﹥PZn﹥PPb﹥PAs﹥PCr，主要受到Cd、Cu、Zn的污染。利用目標(biāo)危險(xiǎn)系數(shù)法[16]（Target hazard quotient）模型計(jì)算出稻米中受污染元素Cd、Cu、Zn的THQ值分別為66、12、24，均大于1，表明3種元素對(duì)人體具有潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。

23不同污染區(qū)蔬菜和水稻重金屬生物富集特性

富集系數(shù)（BCF）指植物體內(nèi)某種重金屬含量與土壤中對(duì)應(yīng)元素含量的比值[8]，可以反映出植物對(duì)土壤重金屬元素的累積能力。

由表4可知，各研究區(qū)的蔬菜對(duì)重金屬富集能力表現(xiàn)為Cd﹥Cu﹥Zn﹥As﹥Cr﹥Pb。從不同類型蔬菜對(duì)同種重金屬吸收來看，葉菜類和根莖類中的Cd、Zn、Cu、As、Cr 5種元素大多都高于瓜果類。對(duì)于Cd的富集能力而言，不同類型蔬菜間表現(xiàn)為葉菜類>根莖類>瓜果類，其余元素在蔬菜種類間無明顯規(guī)律。但賈麗等[17]對(duì)濟(jì)南菜地重金屬富集的研究中，表明重金屬Cd的富集能力順序?yàn)楣祟惄內(nèi)~菜類﹥莖菜類，與本研究不同。這可能是由于土壤的理化性質(zhì)與土壤類型的不同，土壤理化性質(zhì)主要是土壤酸化以及有機(jī)質(zhì)含量不一帶來的影響。土壤類型不同，其土壤中各類物質(zhì)的生理機(jī)制也不同，這些差異便會(huì)波動(dòng)重金屬在蔬菜體內(nèi)的富集效應(yīng)。煤礦區(qū)（JA）的稻米富集能力強(qiáng)弱順序?yàn)镃d﹥Zn﹥Cu﹥Pb﹥Cr﹥As，與王碩等[18]的研究一致。

3討論與結(jié)論

31討論

各污染區(qū)土壤重金屬污染特征不同，Cd為特征污染元素，磷礦區(qū)屬于磷質(zhì)石灰?guī)r地質(zhì)背景下Cd較高的土壤類型，加上磷礦開采產(chǎn)生的礦渣等是土壤重金屬污染的主要原因;而鋁礦冶煉區(qū)附近的赤泥堆在雨水沖刷下向土壤中滲漏，直接污染土壤，堿性廢水也導(dǎo)致土壤pH升高;而煤礦區(qū)污染源是礦山廢水的灌溉。查建軍等人[19]的研究表明，使用酸性礦山廢水灌溉農(nóng)田，將會(huì)改變土壤結(jié)構(gòu)變化和元素組成，是造成土壤重金屬污染的重要原因。重金屬生物有效性與土壤pH呈負(fù)相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，由于酸性礦山廢水的影響，煤礦區(qū)稻田土壤pH平均值為426，重金屬生物有效性高，容易在土壤-作物系統(tǒng)中遷移。因此，稻米Cd、Cu、Zn超標(biāo)倍數(shù)分別為67、11和15，THQ值均大于1，對(duì)人體具有潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，養(yǎng)殖廢水灌溉區(qū)土壤有大量鹽基離子積累，pH較高，重金屬累積嚴(yán)重，綜合污染指數(shù)最高，但生物有效性相對(duì)較低，重金屬富集系數(shù)均小于1，富集能力弱，該區(qū)域蔬菜樣品均未超標(biāo)。

另外，不同類型蔬菜品種對(duì)同種重金屬的富集狀況不同，同類型蔬菜品種對(duì)不同種重金屬的富集狀況也有可能不同，Cd的富集能力最強(qiáng)，Pb的富集能力較弱。蔡寶新等[21]對(duì)云南農(nóng)作物研究表明，玉米對(duì)Cd的富集明顯高于其他金屬元素，這是由于Cd在土壤中的移動(dòng)能力較強(qiáng)，植物對(duì)其吸收能力也較強(qiáng)。相反，Pb在土壤中的移動(dòng)能力較差，這可能是由于Pb在土壤中以化學(xué)吸附為主，在土壤中形成溶解度較小的沉淀。葉菜類蔬菜對(duì)Cd的富集明顯高于其他類型蔬菜。劉意章等[22]研究表明，最弱的

葉菜類蔬菜平均Cd含量（干重）高達(dá)115 mg/kg，葉類作物具有較大的葉片面積、較快的生長率及蒸騰作用，通常易于富集 Cd 等重金屬元素。煤礦區(qū)的稻米富集能力強(qiáng)弱順序?yàn)镃d﹥Zn﹥Cu﹥Pb﹥Cr﹥As，Cd富集能力最強(qiáng)，As最弱。稻米對(duì)于As的富集有明顯的特性，其根部對(duì) As 的富集能力遠(yuǎn)高于其他植物，但其根系砷含量與生育初期相比降低50%～90% ，由于鐵膜的緩沖層作用，稻米中As的含量很低[23]。

32結(jié)論

不同污染區(qū)土壤重金屬綜合污染指數(shù)均大于1，土壤污染嚴(yán)重;Cd的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)8085%，是特征污染元素。蔬菜重金屬富集系數(shù)表現(xiàn)為Cd﹥Zn﹥Cu﹥As﹥Cr﹥Pb，均小于1，典型污染區(qū)蔬菜重金屬的富集能力較弱，食物鏈風(fēng)險(xiǎn)較低。煤礦區(qū)稻米Cd、Cu、Zn超標(biāo)倍數(shù)分別為67、11和15，THQ值均大于1，對(duì)人體具有潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。

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