無(wú)硫復(fù)合護(hù)色劑處理的干制蘋(píng)果片中差異蛋白表達(dá)的分析

李新明 郭志利 李群

摘要 [目的]分析經(jīng)無(wú)硫復(fù)合護(hù)色劑處理的蘋(píng)果片在干制后差異蛋白的表達(dá)情況。[方法]采用無(wú)標(biāo)記（Label-free）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)復(fù)合護(hù)色劑處理的干制蘋(píng)果片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討蛋白質(zhì)組表達(dá)水平的差異。所提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)酶解、色譜質(zhì)譜檢測(cè)分析，用Label-free定性定量軟件maxquant（1.5.0.12）結(jié)合搜庫(kù)定性軟件Andromeda，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行定性定量，通過(guò)蛋白質(zhì)相對(duì)定量的比較尋找差異表達(dá)蛋白。[結(jié)果]與非處理蘋(píng)果片相比，差異蛋白總數(shù)為909個(gè)，上調(diào)差異蛋白質(zhì)319個(gè)，下調(diào)差異蛋白質(zhì)590個(gè)；生物學(xué)過(guò)程主要集中在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程。分子功能主要在綁定、催化活性、能量代謝等部分。細(xì)胞組件主要集中在細(xì)胞膜相關(guān)的部件。[結(jié)論]該研究可為解析復(fù)合護(hù)色劑處理后干制蘋(píng)果片中次生代謝物差異的成因及其抑制褐變的蛋白質(zhì)機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞 干制蘋(píng)果片；Label-free；褐變；護(hù)色；差異蛋白

中圖分類(lèi)號(hào) TS255.42 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0071-03

Abstract [Objective] To analyze the expression of differentially expressed proteins in dried apple slices treated with sulfur free composite color protection agent.[Method] Proteomic analysis of dry apple slices treated with composite color protection agents was carried out using unlabeled （Labelfree） quantitative proteomic techniques to investigate the differences in protein expression levels.The analysis of the extracted protein samples by enzymolysis and GCMS detection，using Labelfree quantitative software maxquant （1.5.0.12） combined with qualitative database search software Andromeda，the qualitative and quantitative of each sample，the protein relative quantitative comparison for different expression of protein.[Result] Compared with untreated apple slices，the total number of differentially expressed proteins was 909，up to 319 differentially expressed proteins and 590 down regulated proteins.The biological process mainly focused on the metabolic process and the cellular process.The molecular functions were mainly binding，catalytic activity，energy metabolism and so on.Cell components were mainly concentrated in cell membrane related components.[Conclusion] This study can provide a reference for the analysis of the causes of the secondary metabolite differences in the dried apple slices and the mechanism of protein inhibition of browning.

Key words Dried apple slices；Labelfree；Browning；Color protection；Differential proteins

蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如生命科學(xué)領(lǐng)域（細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等），涉及的生物種類(lèi)范圍很多，如原核生物、真核生物、植物和動(dòng)物等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究中需要使用多種方法，鑒定蛋白質(zhì)需要應(yīng)用質(zhì)譜方法，標(biāo)記或染色等可以通過(guò)定量分析等方法來(lái)完成。如今，不使用其他方法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定性和定量?jī)H靠質(zhì)譜就可完成，這就是無(wú)標(biāo)記（Label-free）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，也是現(xiàn)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有效新方法，它直接利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中產(chǎn)生的肽段數(shù)據(jù)（重復(fù)肽段數(shù)和強(qiáng)度）進(jìn)行蛋白相對(duì)定量[2-4]。

去皮后蘋(píng)果的果肉褐變主要為酶促褐變，導(dǎo)致褐變的酶有很多種，其中多酚氧化酶是最主要的，酶促反應(yīng)的進(jìn)行需要4個(gè)因素，即氧、多酚氧化酶、底物、銅離子[5]。抑制這種反應(yīng)可以通過(guò)除去氧，降低活性銅離子和底物濃度或直接鈍化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)[6]。還有一種褐變?yōu)榉敲负肿?。在蘋(píng)果干制過(guò)程中，溫度會(huì)引起果肉中各種蛋白的表達(dá)變化，通過(guò)檢測(cè)這些功能蛋白的差異表達(dá)，可以從分子水平為褐變抑制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試蘋(píng)果為太谷產(chǎn)的紅富士蘋(píng)果。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理。洗凈蘋(píng)果，將蘋(píng)果切成 1 mm的薄片，均等分成2份；其中一份放置于空氣中 4 h，同時(shí)另一份置于復(fù)合護(hù)色液中浸泡 4 h；將2份蘋(píng)果放置于 45 ℃烘箱中烘至恒重。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取。

取樣品 100 mg 于 5 mL 管中，加入 5 顆鋼珠，液氮凍存 5 min，放入高通量組織研磨儀中，70 Hz 1 min；加入 1 mL Lysis buffer，漩渦振蕩 30 s，冰上靜置10 min；加入 100 mg 玻璃珠，漩渦振蕩 30 s 后立即放入冰上冷卻，重復(fù) 6 次；15 000 r/min 4 ℃離心 30 min，收集上清液；加入終濃度 25%的 TCA于-20 ℃ 2 h 沉淀蛋白，15 000 r/min 4 ℃離心10 min，去上清，蛋白沉淀用 80%丙酮洗滌3 次，小心去掉上清液，晾干 2～3 min；用 300 μL 8 mol/L urea（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0）復(fù)溶蛋白沉淀，BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，樣品濃度最好≥2 mg/mL；樣品置于-80 ℃內(nèi)，待酶解。

1.2.3 蛋白質(zhì)的酶解。先將蛋白用 10 mmol/L DTT 在 37 ℃ 下進(jìn)行變性處理，隨后加入 20 mmol/L IAA（iodoacetamide）室溫反應(yīng) 45 min 進(jìn)行還原烷基化處理，蛋白樣品用 100 mmol/L TEAB 稀釋至尿素終濃度為 1 mol/L，首先加入 trypsin （1∶50） 過(guò)夜進(jìn)行第1次酶解，第2次用 1∶100 trypsin 進(jìn)行酶解 4 h。大概每個(gè)樣本有 100 μg 的蛋白用 trypsin 進(jìn)行了酶解。

在用 trypsin 進(jìn)行酶解后，肽段混合物用 5%甲酸進(jìn)行酸化處理后，通過(guò) C18 Spin Columns 進(jìn)行除鹽處理；除鹽洗脫產(chǎn)物用 Pierce TM Quantitative Colorimetric Peptide Assay 試劑盒進(jìn)行定量，凍干，最后用一定量的流動(dòng)相（0.1%甲酸水溶液）復(fù)溶肽段。

1.2.4 色譜質(zhì)譜檢測(cè)流程。

檢測(cè)用 LTQ orbitrap Velos液質(zhì)聯(lián)用儀配備戴安ultramate 3000 nano-UPLC 進(jìn)行分析，上機(jī)量 10 μL，首先進(jìn)入保護(hù)柱（C18 PepMap100，300 μm×1 mm，5 μm，100 ），隨后進(jìn)入分析柱（AcclaimPepMap C18，15 cm×75 μm，2 μm，100 ，Dionex）以流速 0.2 μL/min 進(jìn)行分析，流動(dòng)相梯度為 5%～55%流動(dòng)相 B（流動(dòng)相 B：乙腈，0.1%甲酸；流動(dòng)相 A：超純水，0.1%甲酸）以 180 min 進(jìn)行檢測(cè)。

質(zhì)譜參數(shù)：陽(yáng)離子模式，CID 碰撞模式，120 000 分辨率，質(zhì)量范圍 350～1800，NCE 為 35%，前15 離子強(qiáng)度用于 MS-MS 分析。

1.3 分析方案

Orbitrap原始數(shù)據(jù)定性定量方法：對(duì)獲得的Label free蛋白質(zhì)原始數(shù)據(jù)，用Label free定性定量軟件maxquant（1.5.0.12）結(jié)合搜庫(kù)定性軟件Andromeda，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行定性定量，參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot（收錄了共34 361條記錄）。定性和檢索方法：對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行“運(yùn)行間匹配”，匹配時(shí)間窗口為0.5 min，對(duì)齊時(shí)間窗口為20 min。酶切類(lèi)型為胰蛋白酶全酶切，母離子質(zhì)量誤差為±10×10-6，固定修飾為半胱氨酸，可變修飾為天冬酰胺、賴(lài)氨酸（肽段N端）和蛋氨酸（氧化），肽段和蛋白FDR<0.01，最少匹配unique peptide數(shù)目為1，同時(shí)采用LFQ和iBAQ兩參數(shù)進(jìn)行蛋白定量，對(duì)獲得的蛋白結(jié)果過(guò)濾掉污染序列、反向序列等獲得最后的結(jié)果用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白鑒定統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)過(guò)定性定量分析，一共有15 180個(gè)潛在多肽的MS-MS數(shù)據(jù)，最終經(jīng)過(guò)maxquant搜庫(kù)以后共有7 988個(gè)多肽的MS-MS數(shù)據(jù)可以歸屬到已知蛋白，最終樣本可以識(shí)別到1 797個(gè)蛋白（unique peptide≥1）。

2.2 功能注釋

2.2.1 總體蛋白GO分析。

蛋白參與的生物過(guò)程（BP）、所處的細(xì)胞位置（CC）、發(fā)揮的分子功能（MF）三方面功能信息是GO數(shù)據(jù)庫(kù)的重要包含內(nèi)容，可以把不同的功能概念組合為DAG（有向無(wú)環(huán)圖）的結(jié)構(gòu)。在蛋白表達(dá)譜分析中，GO常用于提供蛋白功能分類(lèi)標(biāo)簽和蛋白功能研究的背景知識(shí)。利用GO的知識(shí)體系和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，旨在發(fā)掘與蛋白差異表達(dá)現(xiàn)象關(guān)聯(lián)的單個(gè)特征蛋白功能類(lèi)或多個(gè)特征功能類(lèi)的組合。

圖1為GO的第2級(jí)（level 2）注釋信息所整理的GO分布圖。可以發(fā)現(xiàn)生物學(xué)過(guò)程主要集中在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程。分子功能主要集中在綁定、催化活性、能量代謝等部分。細(xì)胞組件主要集中在細(xì)胞膜相關(guān)的部件。

2.2.2 差異蛋白分析。

2.2.2.1 柱狀圖分析。對(duì)A-/A+各蛋白的比例進(jìn)行柱狀圖分析，考察蛋白的比例分布，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白的比例的對(duì)數(shù)位于0附近（圖2）。

2.2.2.2 差異分析。最后篩選LFQ信號(hào)強(qiáng)度差異倍數(shù)的log2值的絕對(duì)值在log2（1.5）以上[|log2（Fold change）|≥log2（1.5）]為最終差異的蛋白，最終獲得差異蛋白數(shù)。差異蛋白總數(shù)為909個(gè)，其中下調(diào)總數(shù)為590個(gè)，上調(diào)總數(shù)為319個(gè)。

ID：蛋白編號(hào)，log2（A-/A+）：組別間倍性變化值的log2值，uniprot列為經(jīng)過(guò)蛋白搜庫(kù)之后的匹配結(jié)果。

3 結(jié)論

經(jīng)復(fù)合護(hù)色劑處理的蘋(píng)果片，在干制后，果肉中的蛋白差異表達(dá)分析并與非處理對(duì)照比較表明，差異蛋白總數(shù)為909個(gè)，其中下調(diào)總數(shù)為590個(gè)，上調(diào)總數(shù)為319個(gè)。其中，生物學(xué)過(guò)程主要集中在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程。分子功能主要在綁定、催化活性、能量代謝等部分。細(xì)胞組件主要集中在細(xì)胞膜相關(guān)的部件。

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