不同保藏條件下廣式燒鵝新鮮度變化及優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

鄭玉璽 阮征 韓明 董蕾

摘要 [目的]探討不同保藏條件下廣式燒鵝新鮮度變化規(guī)律，并研究確定引起新鮮度急劇變化條件下的優(yōu)勢腐敗菌及組成。[方法]廣式燒鵝在不同溫度和時間處理?xiàng)l件下，測定其揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量，同時提取最優(yōu)處理?xiàng)l件下廣式燒鵝中細(xì)菌全基因組，對特異性擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE），圖譜分析樣品中菌群結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]廣式燒鵝在15 ℃條件下放置24～48 h、30 ℃放置12～36 h，TVB-N含量顯著升高，表征新鮮度急劇下降；DGGE電泳結(jié)果表明，廣式燒鵝在15和30 ℃條件放置12～48 h，葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn.）為樣品中優(yōu)勢菌屬。[結(jié)論]在廣式燒鵝保藏過程中，葡萄球菌屬、乳酸片球菌、芽孢桿菌屬為優(yōu)勢腐敗菌，易造成污染且引起燒鵝的腐敗變質(zhì)及新鮮度的急劇下降。

關(guān)鍵詞 變性梯度凝膠電泳；廣式燒鵝；新鮮度；優(yōu)勢腐敗菌

中圖分類號 TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2017）29-0068-04

Identification of Dominant Spoilage Bacteria of Cantonese Roasted Goose Freshness Changes under Variety Preservation Conditions

ZHENG Yuxi1，2，RUAN Zheng1，HAN Ming2 et al

（1.School of the Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong 510650； 2.Department of Food，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou，Guangdong 510600）

Abstract [Objective]To investigate the freshness of Cantonese Roasted Goose under the different condition of storage temperature and time，and determine the dominant spoilage bacteria which caused the freshness changes.[Method]Volatile basic nitrogen（TVBN） content，extraction of bacteria genome，the 16S rDNA of V3 variable region of bacterial by PCR specific amplification products，denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE） and bacterial community structure were determined.[Result]The results showed that the contents of TVBN were increased significantly under 24-48 h placed at 15 ℃ and 12-36 h placed at 30 ℃； Staphylococcus，Pediococcus acidilactici and Bacillus Cohn.were the dominant spoilage bacteria under 12-48 h placed at 15 and 30 ℃.[Conclusion]During the presevation of the Cantonese Roasted Goose，staphylococcus，Pediococcus acidilactici and Bacillus Cohn.were the dominant spoilage bacteria.

Key words Denaturing gradient gel electrophoresis fingerprint technology；Cantonese Roasted Goose；Freshness；Dominant spoilage bacteria

基金項(xiàng)目

2017年廣州市教育局首批高校產(chǎn)學(xué)研技術(shù)合作基地項(xiàng)目（Z1704517）。

作者簡介 鄭玉璽（1984—），男，安徽池州人，實(shí)驗(yàn)師，從事食品微生物相關(guān)研究。

收稿日期 2017-08-09

廣式燒鵝是粵菜系中的傳統(tǒng)名菜，因其營養(yǎng)豐富、滋味醇厚而深受人們喜愛[1]。由于燒鵝是傳統(tǒng)風(fēng)味食品，仍然保持著手工作坊式加工方式，且加工特點(diǎn)為整只燒制，受熱不均勻，容易殘留屠宰過程中污染的腸道菌；同時在包裝、運(yùn)輸、售賣過程中沒有嚴(yán)格的衛(wèi)生控制措施，極易被細(xì)菌污染從而引起新鮮度下降甚至腐敗變質(zhì)，尤其是在年平均氣溫較高的南方地區(qū)，細(xì)菌更容易生長繁殖，由此帶來的品質(zhì)及安全問題日趨明顯。目前對于廣式燒鵝的衛(wèi)生及貯藏研究鮮有報道，僅楊勇等[2]利用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行鵝肉新鮮度的快速測定，但是并未揭示引起這種新鮮度變化的微生物機(jī)制，對于引起燒鵝腐敗變質(zhì)的腐敗菌及菌相組成也未見報道。

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是一種堿性含氮物質(zhì)，它的產(chǎn)生是由于動物性產(chǎn)品腐敗過程中酶與細(xì)菌的作用，使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生了大量的胺和氨類物質(zhì)[3]。此類物質(zhì)揮發(fā)性強(qiáng)，其含量越高，表明氨基酸[特別是蛋氨酸（Met）和酪氨酸（Tyr）]破壞程度越高，嚴(yán)重影響食品的營養(yǎng)價值。大量研究結(jié)果表明，TVB-N可用來表征肉類的新鮮度，其含量越高，肉類的新鮮度越低[4-5]。

傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)、分離、生化鑒定手段只能針對實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)菌，但研究表明，自然界中可培養(yǎng)的微生物只占據(jù)微生物總量的1%。16S rDNA的PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）作為核酸指紋圖譜技術(shù)，能夠分析樣品中微生物多樣性。它可根據(jù)16S rDNA中可變區(qū)序列，對樣品中的微生物進(jìn)行分類鑒定，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，可以準(zhǔn)確地鑒定傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)的微生物種群，能夠直接、全面地了解微生物組成及菌群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化[6]。

筆者以揮發(fā)性鹽基氮作為廣式燒鵝的新鮮度變化的指標(biāo)，探討在不同的處理溫度和時間條件下燒鵝新鮮度的變化規(guī)律，同時采用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)分析引起燒鵝新鮮度變化的微生物種類及組成，確定不同保藏溫度、時間條件下燒鵝的新鮮度及優(yōu)勢腐敗菌組成，以期揭示廣式燒鵝在保藏過程中品質(zhì)變化與微生物種類及組成的關(guān)系，為實(shí)施更具針對性的防腐保鮮措施提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。廣式燒鵝，購于華南理工大學(xué)校外快餐店；北京天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；大連寶生物工程公司Taq DNA聚合酶、2 000 bp DNA Marker、引物合成；西班牙Sigma公司聚丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺；美國Biotium公司GelRed核酸凝膠染色劑。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器；天津泰斯特儀器有限公司DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱；德國Beckman公司高速冷凍離心機(jī)；北京君意東方電泳設(shè)備有限公司DGGE電泳分析系統(tǒng)；美國BIO-RAD公司PCR儀；廣州美格生物有限公司DNA測序。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理。

燒鵝購買后放入無菌容器送回實(shí)驗(yàn)室，操作臺無菌操作切碎混樣，置于滅菌三角瓶中，保鮮膜封口后根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計分組放置。

1.2.2 揮發(fā)性鹽基氮的測定。

參照 GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》半微量定氮法[7]。

1.2.3 細(xì)菌全基因組提取。

無菌條件下準(zhǔn)確稱取10 g廣式燒鵝（不同部位），剪碎后加入50 mL滅菌生理鹽水，搖床振蕩30 min。將混合溶液在4 ℃條件下500 r/min離心10 min。取上清液，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀置于1.5 mL離心管中，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū)擴(kuò)增。

采用細(xì)菌通用引物（上游引物GC-F357，下游引物R518）對細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。

PCR反應(yīng)體系如表2所示。DNA擴(kuò)增采用降落PCR，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 變性30 s，65 ℃到55 ℃退火，每個循環(huán)降低0.5 ℃，退火30 s，72 ℃延伸30 s（此過程循環(huán)20次）；再以恒定退火溫度（55 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行10個循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min[8]。取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測含量及特異性后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 DGGE分析。

PCR產(chǎn)物DGGE分析在DGGE電泳分析系統(tǒng)上進(jìn)行。電泳條件：質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺 ∶甲叉雙丙烯酰胺=37.5 ∶1），變性梯度為30%到50%，PCR產(chǎn)物上樣量20 μL，電泳溫度恒定（60 ℃），1×TAE緩沖液中200 V預(yù)電泳10 min。80 V固定電壓電泳8 h，Gel Red核酸凝膠染色劑1×TAE緩沖液中染色15 min，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照保存。

1.2.6 DNA回收測序。

紫外燈條件下切下DGGE膠泳道中所需亮帶，條帶依照順序放入已編號的1.5 mL EP管中，搗碎后加入30 μL ddH2O，-20 ℃浸泡過夜，離心，去上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列（上游引物F357，下游引物R518）在表1中顯示。

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，30個循環(huán)（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)產(chǎn)量、測序。登陸NCBI，將所得序列與已知序列進(jìn)行比較、相似性分析[8]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，所得圖像分析利用Quantity one 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性鹽基氮含量變化

參考NY5034—2008《無公害食品禽肉及禽副產(chǎn)品》標(biāo)準(zhǔn)：禽肉及其制品TVB-N含量應(yīng)低于150 mg/kg。由圖1所示，在4、15及30 ℃ 3種貯藏溫度下，廣式燒鵝在整個貯藏期間的揮發(fā)性鹽基氮含量均呈上升趨勢，新鮮度下降，其中15、30 ℃分別放置48、36 h后均超過150 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)，不能食用。4 ℃條件下TVB-N含量無顯著性變化（P>0.5），放置72 h后仍未超過標(biāo)準(zhǔn)；30 ℃條件下，12～36 h期間TVB-N含量變化顯著（P<0.5），新鮮度急劇下降，這是由于在適宜溫度，樣品中微生物處于對數(shù)生長期，大量繁殖消耗了樣品中的蛋白質(zhì)；15 ℃條件下，由于溫度對微生物生長的影響，微生物生長遲滯期較長，導(dǎo)致TVB-N含量均低于30 ℃條件的同期水平；放置48 h后，由于微生物的生長繁殖進(jìn)入了穩(wěn)定期，消耗蛋白質(zhì)的速率下降，且樣品中的蛋白質(zhì)消耗殆盡，而微生物消耗蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物堿性含氮物質(zhì)與樣品中酸性成分中和，導(dǎo)致30 ℃及15 ℃條件下的TVB-N都進(jìn)入一個穩(wěn)定的平臺期。

由于TVB-N含量變化主要是因?yàn)槲⑸飻?shù)量和組成的變化所導(dǎo)致的，因此選取30 ℃條件下0～36 h、15 ℃條件下0～48 h 2個區(qū)間進(jìn)行PCR-DGGE指紋圖譜分析，研究微生物菌群結(jié)構(gòu)與新鮮度的關(guān)系。

2.2 細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

對所提取廣式燒鵝中細(xì)菌組總DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測，獲得特異性擴(kuò)增條帶（圖2）。電泳條帶清晰，片段長度在200 bp左右，符合理論16S rDNA V3區(qū)長度，適宜進(jìn)行DGGE電泳。

2.3 DGGE結(jié)果分析

在圖3中顯示為廣式燒鵝中30 ℃條件下0、12和36 h及 15 ℃條件下0、24和48 h的DGGE電泳圖。條帶 a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l亮度相對較高（圖3），是廣式燒鵝樣品中相對的優(yōu)勢菌群，割膠回收、測序比對。

條帶a、b、d、f、h在S12-30、S36-30泳道中均為優(yōu)勢條帶，而在S0中不是優(yōu)勢條帶；條帶c和e在S36-30泳道中是優(yōu)勢條帶，而在 S12-30和S0不是優(yōu)勢條帶，這表明30 ℃恒溫處理下0 h（泳道S0）樣品到12 h（S12-30）廣式燒鵝中優(yōu)勢菌種類變化顯著，而12 h至36 h（泳道S36-30）細(xì)菌組成及優(yōu)勢菌種類變化不顯著。在泳道 S24-15和S48-15中，條帶 j、k、d 和l比在泳道S0中相對較亮，是該處理下的優(yōu)勢條帶。泳道 S24-15和S48-15中條帶組成無明顯差異，說明15 ℃恒溫處理下，24和48 h時間點(diǎn)樣品的細(xì)菌組成及優(yōu)勢菌的種類無明顯差異。

對圖3中標(biāo)記較明顯優(yōu)勢條帶進(jìn)行割膠回收、送樣測序后，登陸NCBI與GenBank對已知序列進(jìn)行BLAST比對分析，回收條帶DNA序列對比同源性均達(dá)95%以上，序列結(jié)果如表3所示。

15和30 ℃處理下，不同時長的優(yōu)勢菌在表4中顯示。可以看出，0 h（即燒鵝不經(jīng)過處理）主要含有格氏乳球菌和芽孢桿菌屬，組成較為簡單。這是由于此時燒鵝剛剛經(jīng)過熱加工，所出現(xiàn)菌種可能為冷卻時的人員或器具污染。但是在后續(xù)處理中沒有發(fā)現(xiàn)格氏乳球菌，表明被其他種群抑制或競爭致死；而芽孢桿菌屬在后續(xù)的每個處理中均檢出，表明芽孢桿菌在廣式燒鵝保藏中的重要性。

15 ℃條件處理24 h的樣品中主要含有葡萄球菌屬 （Staphylococcus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、芽孢

桿菌屬（Bacillus），此時燒鵝TVB-N含量在第1個顯著上升階段（圖1，P<0.5），對比0 h時菌群組成顯著變化，表明這3種菌引起燒鵝新鮮度的下降；而在48 h時，菌群結(jié)構(gòu)沒有顯著改變，但是TVB-N含量還在繼續(xù)大幅度上升，說明這3種優(yōu)勢菌進(jìn)入了對數(shù)生長期，數(shù)量增多，與其他弱勢菌群競爭營養(yǎng)和生存環(huán)境，導(dǎo)致其他弱勢菌群的消亡，同時由于生長繁殖的需要，消耗樣品中大量蛋白質(zhì)產(chǎn)生TVB- N，導(dǎo)致TVB-N含量顯著上升（圖1，P<0.5），燒鵝新鮮度下降。

30 ℃條件處理12 h的樣品中主要含有葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillales bacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus），與15 ℃條件下的變化趨勢相似，新鮮度進(jìn)入第1個顯著下降期，但時間提前12 h，且TVB-N含量上升幅度比15 ℃條件下更顯著（圖1，P<0.5）。這是由于溫度相對較高，適宜微生物生長繁殖，較早進(jìn)入對數(shù)生長期且生長繁殖數(shù)量較高；處理36 h后主要含有葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillales bacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、叢毛單胞菌屬（Comamonassp），此時進(jìn)入燒鵝新鮮度的第2個顯著下降期（圖1），檢出叢毛單胞菌屬。

3 結(jié)論

廣式燒鵝15 ℃條件下放置24～48 h、30 ℃放置12～36 h，TVB-N含量顯著升高（圖1），新鮮度急劇下降，失去營養(yǎng)價值并伴有食物中毒的風(fēng)險，不建議繼續(xù)食用。

引起廣式燒鵝新鮮度變化的主要微生物種群為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳酸片球菌屬（Pediococcus acidilactici）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、叢毛單胞菌屬（Comamonassp），其中影響較大種屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸片球菌屬（Pediococcus acidilactici）。

該研究探討了廣式燒鵝在保藏過程中新鮮度變化的規(guī)律，并分析了新鮮度急劇變化條件下的優(yōu)勢腐敗微生物，這將有利于準(zhǔn)確預(yù)測廣式燒鵝的貨架期，同時也將為廣式燒鵝的包裝或保藏提供更具針對性的依據(jù)。

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