雞新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT—PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

謝志勤 謝芝勛 鄧顯文 謝麗基 范晴 羅思思 黃莉 黃嬌玲 張艷芳 王盛 劉加波 龐耀珊 梁亮 馮務(wù)玲

摘要：【目的】建立一次性可同時(shí)擴(kuò)增鑒別雞新城疫病毒（NDV）和禽肺炎病毒（APV）的二重RT-PCR，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供技術(shù)支持。【方法】根據(jù)GenBank已發(fā)表NDV的F基因序列（GenBank登錄號(hào)JX840454）和APV的F基因序列（GeneBank登錄號(hào)AF187154）分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，應(yīng)用這2對(duì)引物建立可同時(shí)檢測(cè)鑒別NDV和APV的二重RT-PCR，對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)和臨床樣品檢測(cè)等驗(yàn)證其實(shí)用性。【結(jié)果】?jī)?yōu)化后的二重RT-PCR可特異性擴(kuò)增出參試NDV毒株（LaSota株、F48E9株、I株）及APV/MN-10毒株的目的條帶，其大小分別為247和424 bp，而其他對(duì)照參試毒株在247和424 bp處均無(wú)特異條帶出現(xiàn)。二重RT-PCR針對(duì)NDV和APV的最低檢出限均為10 pg的RNA。應(yīng)用建立的二重RT-PCR對(duì)132份從廣西采集的病雞樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果得到NDV陽(yáng)性樣品26份、APV陽(yáng)性樣品2份，與血清學(xué)方法的鑒定結(jié)果一致。隨機(jī)選取的2份NDV陽(yáng)性PCR產(chǎn)物與NDV（GenBank登錄號(hào)JX840454）的F基因序列一致，同源性達(dá)100%；2份APV陽(yáng)性PCR產(chǎn)物與APV（GenBank登錄號(hào)AF187154）的F基因序列也完全一致，同源性達(dá)100%?！窘Y(jié)論】針對(duì)NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特異性好、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，可用于臨床快速鑒別診斷，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 雞新城疫病毒（NDV）；禽肺炎病毒（APV）；二重RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）03-0546-06

0 引言

【研究意義】雞新城疫病毒（Newcaslte disease virus，NDV）和禽肺炎病毒（Avian pneumovirus，APV）是危害養(yǎng)雞業(yè)的兩種主要病毒，二者均為副粘病毒科（Paramyxoviridae）成員，其中，NDV隸屬于副粘病毒屬（Paramyxovirus），而APV隸屬于禽偏肺炎病毒屬（Avian pneumovira）（Pringle，1998）。NDV全基因長(zhǎng)15198 bp，基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，共編碼6個(gè)基因蛋白，依次為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素—神經(jīng)氨酸酶（HN）和大蛋白（L）（Huang et al.，2004）。APV全基因長(zhǎng)約14000 bp，為負(fù)鏈RNA，基因中有8種編碼蛋白，依次為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、第二基質(zhì)蛋白（M2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）（Naylor et al.，2004；胡海霞等，2012）。這兩種病毒引起的臨床癥狀很相似，均可引起禽類上呼吸道的癥狀，因此根據(jù)臨床癥狀很難對(duì)二者進(jìn)行鑒別，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段進(jìn)行確診?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國(guó)對(duì)NDV的研究非常重視，建立了很多檢測(cè)診斷方法，如傳統(tǒng)的病毒分離鑒定（陳安莉等，2012）和血清學(xué)方法等，近年又出現(xiàn)了高通量GeXP檢測(cè)方法（羅思思等，2013）。這些方法為準(zhǔn)確檢測(cè)診斷NDV提供了技術(shù)保障，是有效防控雞新城疫發(fā)生的前提。針對(duì)APV的診斷國(guó)外已開(kāi)展了相關(guān)研究，我國(guó)起步相對(duì)較晚，其診斷方法主要有病毒分離鑒定（Goyal et al.，2000；Cook and Cavanagh，2002）、ELISA（Gulati et al.，2000；Goyal et al.，2003）、RT-PCR（Shin et al.，2000；陳琳等，2012）、Taqman探針熒光定量PCR（謝志勤等，2014a）等。雖然目前實(shí)驗(yàn)室診斷NDV和APV的方法都已成熟，但缺少針對(duì)兩種病混合感染的快速鑒別診斷，不利于養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。二重（或多重）PCR是利用兩對(duì)（或多對(duì)）引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)（或多個(gè)）模板，能有效彌補(bǔ)常規(guī)PCR的不足（范志宇等，2015；秦毅斌等，2016），在禽類疫病鑒別診斷中得到廣泛應(yīng)用，如吳萍萍等（2010）建立了雞傳染性貧血病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒二重PCR檢測(cè)方法，謝麗基等（2012）建立了鴨I型肝炎病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細(xì)小病毒三重RT-PCR檢測(cè)方法，謝志勤等（2016）建立了H9亞型禽流感病毒和APV二重RT-PCR檢測(cè)方法，奉彬等（2016）建立了雞細(xì)小病毒和禽呼腸病毒二重PCR檢測(cè)方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)快速發(fā)展及防病的需求，尤其針對(duì)臨床癥狀相似且難以進(jìn)行診斷的雞病，應(yīng)建立快速鑒別的診斷方法，但至今尚無(wú)針對(duì)NDV和APV二重RT-PCR檢測(cè)方法的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)在NDV和APV兩種病毒各自F基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物，建立一次性可同時(shí)擴(kuò)增鑒別二者的二重RT-PCR，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株（LaSota株、F48E9株、I株）、禽呼腸孤病毒（Reo S1133）和禽大腸桿菌（E. coli O2）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，NDV分離株（GX/2010和GX/2013）由廣西動(dòng)物疫病病原生物學(xué)與診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存提供，APV（MN-10毒株）由美國(guó)濱夕法尼亞大學(xué)Lu教授惠贈(zèng)，雞馬立克氏病毒（MDV）疫苗毒購(gòu)自南京梅里亞動(dòng)物保健品公司，禽流感病毒H9（AIV H9）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV Mass 41）、雞傳染性喉氣管炎病毒（北京株，ILTV）、禽腦脊髓炎病毒（AEV Van）和雞毒霉形體（MG S6）均由廣西動(dòng)物疫病病原生物學(xué)與診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。SPF雞胚（7～10日齡）是從北京梅里亞種禽有限公司購(gòu)進(jìn)SPF種蛋自行孵化獲得。反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA抑制劑、dNTPs、隨機(jī)引物和2×Premix TaqTM Mix等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表NDV的F基因序列（GenBank登錄號(hào)JX840454）和APV的F基因序列（GenBank登錄號(hào)AF187154），通過(guò)DNASTAR MegAlign對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出各自F基因的保守序列區(qū)間，應(yīng)用PrimerSelect設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物（表1）。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 病毒增殖及處理

1. 3. 1 NDV增殖及處理 NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株（LaSota株、F48E9株、I株）用滅菌PBS按1∶1000進(jìn)行稀釋，然后經(jīng)雞胚尿囊腔分別接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，收集24～120 h死亡雞胚尿囊液。雞胚尿囊液經(jīng)8000 r/min離心5 min，收集上清液用于RNA提取或-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 2 APV增殖及處理 參照謝志勤等（2014b）的增殖方法進(jìn)行操作。

1. 4 樣品處理及RNA提取

取病雞的肺臟、氣管和脾臟等組織，按1∶5加入滅菌PBS進(jìn)行研磨，研磨后的懸液分裝于1.5 mL離心管中，-70 ℃下反復(fù)凍融3次（4 h內(nèi)），8000 r/min離心5 min，收集上清液用于病毒增殖。病毒增殖后按Xie等（2005）的方法進(jìn)行總RNA提取，提取的總RNA直接用于反轉(zhuǎn)錄（RT）或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 RT-PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系所用的Buffer、dNTPs、Mg2+、Random 9-mer（自由引物）、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA 抑制劑、RNA模板濃度、Taq DNA聚合酶及擴(kuò)增程序的退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的反應(yīng)濃度及擴(kuò)增條件。

1. 6 特異性及敏感性試驗(yàn)

以NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株（LaSota株、F48E9株、I株）、APV/ MN-10毒株及AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV（Beijing）毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株的RNA或DNA為模板，進(jìn)行RT-PCR或PCR擴(kuò)增，檢測(cè)二重RT-PCR的特異性。同時(shí)，測(cè)定NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA濃度，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100 ng～100 fg共7個(gè)稀釋度的RNA（2.0 μL）為模板進(jìn)行敏感性檢測(cè)試驗(yàn)。

1. 7 臨床樣品檢測(cè)

提取132份來(lái)自廣西不同地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)病雞肺臟、氣管和脾臟樣品的RNA，應(yīng)用建立的二重RT-PCR對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，取相同樣品研磨后以0.2 μm濾膜無(wú)菌過(guò)濾進(jìn)行病毒分離，經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚或經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，以評(píng)價(jià)二重RT-PCR對(duì)臨床樣品檢測(cè)的實(shí)用性。

1. 8 序列分析比對(duì)驗(yàn)證

隨機(jī)選取NDV和APV各2份PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定比對(duì)，將回收純化的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α（TaKaRa公司）。提取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的DNA，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，并采用DNASTAR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 二重RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

將12.0 μL二重RT-PCR產(chǎn)物（含2.0 μL加樣緩沖液）加入預(yù)先用TBE（Tris 5.40 g，硼酸2.75 g，0.5 mol/L EDTA 2.0 mL）制備的1.5%瓊脂糖凝膠孔中，以80 V/cm電壓進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)Gelred染色后在紫外線下觀察拍照，結(jié)果（圖1）顯示，NDV毒株樣品約在240 bp處出現(xiàn)明亮條帶，APV毒株樣品約在420 bp處出現(xiàn)明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2. 2 二重RT-PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

對(duì)二重RT-PCR反應(yīng)體系各成分配比進(jìn)行優(yōu)化篩選，獲得最佳的配比條件為：（1）反轉(zhuǎn)錄（RT）體系10.0 μL，即5×RT Buffer（含10 μmol/L dNTPs、Mg2+）2.0 μL，50 μmol/L Random 9-mer（自由引物）0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶AMV 0.5 μL，RNA抑制劑0.5 μL，NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA模板各2.0 μL，滅菌的無(wú)RNA水2.5 μL。（2）PCR反應(yīng)體系25.00 μL，即2×Premix TaqTM Mix12.50 μL（含10 μmol/L dNTPs、Mg2+、5 U Ex Taq DNA酶），RT產(chǎn)物2.00 μL，50 pmol/μL的APVF/APVR各0.25 μL，50 pmol/μL的NDVF/NDVR各0.25 μL，滅菌超純水9.50 μL。同時(shí)，對(duì)不同退火溫度（51、53、55、57、59和61 ℃）進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；最佳PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2. 3 特異性及敏感性試驗(yàn)結(jié)果

參試的NDV LaSota毒株、F48E9毒株和I毒株均擴(kuò)增出247 bp的特異性條帶，APV/MN-10毒株擴(kuò)增出424 bp的特異性條帶，而AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株在247和424 bp處均無(wú)特異條帶出現(xiàn)（圖1）。以10倍梯度稀釋NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二重RT-PCR最低能檢測(cè)到10 pg的對(duì)應(yīng)RNA模板（圖2）。

2. 4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)132份病雞樣品的RNA進(jìn)行二重RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有26份樣品呈NDV陽(yáng)性，2份樣品呈APV陽(yáng)性（圖3），其中1份樣品為NDV和APV混合感染，其余的104份樣品均未檢測(cè)出NDV或APV的特異條帶。樣品病毒分離后經(jīng)血清學(xué)方法鑒定，發(fā)現(xiàn)有NDV陽(yáng)性26份、APV陽(yáng)性2份，與二重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

2. 5 序列分析結(jié)果

隨機(jī)選取NDV和APV各2份PCR檢測(cè)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，利用DNASTAR進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，2份NDV陽(yáng)性PCR產(chǎn)物與NDV（GenBank登錄號(hào)JX840454）的F基因序列一致，同源性達(dá)100%；2份APV陽(yáng)性PCR產(chǎn)物與APV（GenBank登錄號(hào)AF187154）的F基因序列也完全一致，同源性達(dá)100%。

3 討論

疫病防控一直是現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)的首要任務(wù)。除禽流感外，雞新城疫也是一種必須防控的傳染病，雖然我國(guó)對(duì)雞新城疫已采取各種預(yù)防措施，但每年因該病引起的損失仍然十分巨大。相對(duì)于禽流感、雞新城疫病等重大疫病，APV引起的疾病尚未引起人們足夠重視。APV的最早報(bào)道是引起火雞呼吸道疾病，隨后在歐洲流行，死亡率高達(dá)25%～40%（Cook et al.，2000）。我國(guó)最早報(bào)道該病是在1998年（沈瑞忠等，1999），郭龍宗和曲立新（2009）進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國(guó)雞群中APV感染很普遍，感染率高的地區(qū)可達(dá)100%。APV和NDV引起的臨床癥狀很相似，主要表現(xiàn)為上呼吸道癥狀，尤以噴嚏、眼結(jié)膜潮紅、淚腺腫、產(chǎn)蛋下降、孵化率低及神經(jīng)癥狀為主。因此，根據(jù)臨床癥狀很難對(duì)二者進(jìn)行鑒別，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段進(jìn)行確診，但目前尚無(wú)可同時(shí)檢測(cè)鑒別APV和NDV的方法。

NDV和APV的融合蛋白（F）是非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其功能是參與細(xì)胞的吸附過(guò)程。雖然二者的融合蛋白（F）功能相同，但其蛋白序列結(jié)構(gòu)并不一致，具有種屬特異性，因此該蛋白常被用于檢測(cè)鑒別病毒特征。本研究利用各自融合蛋白（F）的種屬特異性，在其基因保守序列區(qū)域分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增NDV和APV的2對(duì)特異性引物，建立了一次擴(kuò)增鑒別二者的二重RT-PCR檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，參試的NDV LaSota毒株、F48E9毒株和I毒株均能擴(kuò)增出247 bp的特異性條帶，APV/MN-10毒株擴(kuò)增出424 bp的特異性條帶，而對(duì)照的AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株在247和424 bp處均無(wú)特異條帶出現(xiàn)，說(shuō)明本研究建立的NDV和APV二重RT-PCR具有特異性，其最低檢出限均為10 pg的RNA，表明其具有良好的敏感性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究建立的二重RT-PCR，采用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有NDV陽(yáng)性26份，陽(yáng)性檢測(cè)率19.69%（26/132），APV陽(yáng)性2份，陽(yáng)性檢測(cè)率1.51%（2/132）。此外，通過(guò)對(duì)2份NDV陽(yáng)性樣品和2份APV陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列測(cè)定比對(duì)，證實(shí)所擴(kuò)增的各自F基因序列片段正確，說(shuō)明建立的二重RT-PCR具有很高的實(shí)用性，可用于臨床檢測(cè)，為快速鑒別檢測(cè)NDV、APV及有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

針對(duì)NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特異性好、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，可用于臨床快速鑒別診斷，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供了技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）